生物制药第1章

1、关于生物制药 性质：选修 学时：32 32 学分：2 2 考核方式：闭卷 参考教材： 夏焕章、熊宗贵，生物技术制药（第2 2版）， 高等教育出版社，20062006； 熊宗贵，生物技术制药，高等教育出版社， 19991999 前 言 当今世界七大高新技术分别是： 现代生物技术 航天技术 信息技术 激光技术 自动化技术 新能源技术 新材料技术 现代生物技术列在七大高新技术的首位。 它在解决人类所面临的诸如食物短缺、 人类健康、环境污染和资源匮乏等重大 问题上有着不可比拟的优越性。 就学科内容来说： 生物技术是以基因工程为主导； 以发酵工程为基础； 包括细胞工程、酶工程、生化工程， 随着生物科学的

2、发展，又衍生出第 二代、第三代的蛋白质工程、抗体 工程、海洋生物技术等。 就产业来说： 生物技术涉及制药工业、化学工业、食 品工业、环境保护、农作物育种与病虫 害防治、能源开发等。 第一章 绪 论 本章主要内容 一、生物技术发展简史 二、生物制药的概念和内容 三、新型生物药物研制的理论和方法 四、生物制药技术新进展 一、生物技术发展简史 生物技术是人类对生物资源（微生 物、动植物）的利用、改造并为人 类服务的技术，它的发展已有几千 年的历史，将其发展过程按技术特 征可分为三个阶段。 1 1、传统生物技术阶段 2 2、近代生物技术阶段 3 3、现代生物技术阶段 1 1、传统生物技术阶段 出现在公

3、元前几千年，直到2020世纪3030年代。 主要是酿造技术，当时人们只知道酿造技 术，但不知道这些技术的内在原因。 16801680年出现了显微镜。 18571857年用实验方法证明了酒精发酵与酵母 菌有关。 18971897年揭开发酵现象的奥秘。酶 至20世纪30年代 该阶段的产品：乳酸、酒精、丙酮、丁 醇、柠檬酸、淀粉酶。 该阶段生产的特点：过程简单，大多数 属于兼气发酵或表面培养，生产设备要 求不高，产品化学结构简单，属于初级 代谢产物。 2 2、近代生物技术阶段 2020世纪4040年代。 第二次世界大战的爆发，急需疗效好、 毒副作用小的抗细菌感染药物，出现了 青霉素。 产品价格昂贵，

4、随着发酵新技术的出现， 又相继发现了链霉素、红霉素、金霉素 等药物。 该阶段的主要产品： 医药：抗生素、维生素、甾体、氨基酸； 食品工业：酶制剂、食用氨基酸、酵母、 啤酒； 化工业：酒精、丙酮、丁醇、沼气； 农林业：农药； 环境保护业：生物治理污染。 （1 1）产品类型多，初级（氨基酸、酶、 有机酸）；次级（抗生素）；生物转化 （甾体）。（2 2）生物技术要求高，纯种、 无菌、通气、产品质量要求也高。（3 3） 生产设备规模大，常用500m500m 3 3 ，最大 2000m2000m3 3。（4 4）技术发展速度快，如青霉 素菌种，初期200200单位/ml/ml，目前8 8万单位 /ml/

5、ml 形成了交叉学科生化工程。 该阶段生物技术的特点 3 3、现代生物技术阶段 标志，19531953年美国WatsonWatson和英国的 CrickCrick共同提出了DNADNA的双螺旋结构， 揭开了生命科学划时代的一页。 此后，又相继出现了一系列新发现和 新进展，遗传中心法则，破译遗传密 码，基因重组，单克隆抗体，DNADNA测序， 动植物细胞培养技术。 DNADNA的双螺旋结构 根据实验研究表明，基因表达即遗传信 息的传递路线是： DNA RNADNA RNA（mRNAmRNA） 蛋白质生物 性状 遗传的中心法则 （1 1）基因操作技术日新月异； （2 2）新技术、新方法迅速商品化；

6、 （3 3）基因工程药物和疫苗研究； （4 4）生物治疗制剂产业化； （5 5）转基因动植物取得重大突破； （6 6）现代生物技术应用于农业； （7 7）阐明生物体基因组及其编码蛋白； （8 8）基因治疗； （9 9）蛋白质工程技术； （1010）信息技术渗入生命科学生物信息学。 现代生物技术的发展趋势 快速、高灵敏度的检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。在高通量药物筛选中，检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光 光度仪等。检测仪器灵敏度的不断提高，即使对微量样品的检测，也可以得到很好的检测效果。 1.3.1 液闪计数 放射性同位素广泛用于受体结合测定、细胞

7、毒性、细胞增殖实验、药物代谢示踪以及基因分析中。由于采用了双光电倍增管及时间分辨偶合回路(time- resolved coincidence circuit)技术，有效地降低了背景信号的干扰，使测定灵敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析检测中，背景信号可控制在10cpm左右。 亲和闪烁分析(scintil1ation proximity assay，SPA)是一种新的液闪分析法。该方法在细胞表面受体药物筛选中应用较为普遍。在高通量筛选测定细胞表面受体亲合结合作 用时，放射配体标记滤过分析技术由于需要进行分离，现已被亲合闪烁分析所取代。亲合闪烁分析技术通过亲合结合，将放射性配基结合到具有受

8、体的闪烁球上，从而产生 光子，减少了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分离过程，使得放射配基分析可完全以自动化的方式进行，适于进行高通量筛选。产生低能量放射粒子的同位素 可被用来进行放射性标记，而这种低能量放射粒子在短距离内可被重吸收，以确保只有结合到受体表面的配基才被检测到。SPA技术被广泛的应用到激酶、核酸处理酶分析 以及受体配体的相互作用分析中。 1.3.2 分光光度法 为了适应高通量药物筛选，许多公司都生产了具备计算机接口并能对多孔板进行同时检测的分光光度计。以Molecular Device公司的spectra 190为例，它 采用8条光导纤维同时对8孔进行测定。测定波长以2n

9、m为间隔，可以在190nm一850nm间进行选择。对未知物质，可在该范围内进行扫描以确定其特征吸收光谱。因此，大大 增加了建立模型的多样性。检测数据以不同文件格式输出，可用随机软件或通用数据处理软件进行处理。方便、快速、准确、自动化程度高。分光光度法高灵敏仪器同自动 化操作系统的连接，使得基于紫外、可见光谱的高通量药物筛选模型成为主要模型种类。 1.3.3 化学发光检测 化学发光指生色物质在酶促作用下，化学能以光子的形式释放出来。化学发光根据发光的形式和种类分为辉光型和闪光型发光两种。辉光型化学发光 如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等为基础的发光反应。其发光时间较长且稳

10、定。而以发光蛋白、ATP、荧光素酶等为底物的发光反应则是闪光型发光反应，其发光时 间较短。由于时间分辨及偶合回路技术的使用，对于背景的去除更为有效，使得化学发光的检测灵敏度达到0.1pg数量级。在单孔多点喷射技术中，用于检测化学发光的光导 纤维末端带有一喷头，用来加入反应性底物。反应性底物从100个小孔喷出，使反应性底物加入孔中后即可均匀混合。发光反应同时启动后，可立即进行测定，对于闪光性化 学发光的测定更为有利。 1.3.4 激发荧光检测 新型激发荧光检测仪在传统仪器的基础上，用连续的激发光谐和测定光谱取代固定光谱，使模型的建立更具备灵活性。荧光检测方法灵敏是因为多数 荧光基团都有短暂的半衰

11、期，即使用较弱的激发光源也能获得大量的光子流。这种特性以及多种可采用的荧光模式，使得荧光检测技术成为高通量筛选必不可少的应用手段。 荧光技术在均相筛选分析中广为应用。其中，包括荧光共振能量转移(FRET)，荧光偏振(FP)，时间分辨荧光(TRET)以及荧光相关谱(FCS)等技术。 1.4 数据库管理系统 高通量药物筛选的特点是对数以万计的化合物样品进行多模型的筛选。与高通量药物筛选相适应的数据库管理系统主要承担4个方面的功能。 样品库的管理功能：化合物样品库对进行高通量药物筛选的化合物样品的各种理化性质进行存储管理。对每一个新入库的化合物进行新颖性分析，排除结构雷同的化合 物，避免不必要的筛选

12、。由于高度反应性基团增加了假阳性出现的机率，样品库对新入库的化合物进行反应基因检测以去除这类化合物。 生物活性信息的管理功能：生物活性库存贮每一化合物经过不同模型检测后的结果，并根据多个模型的检测结果对化合物的生物活性进行综合评价。 对高通量药物筛选的服务功能：高通量药物筛选的工作量大，自动化程度高，也涉及到许多繁琐的工作。高通量药物筛选数据库管理系统对与药物筛选相关的业务往来 通讯、档案管理以及各种样品标签的打印进行管理，使高通量药物筛选的各个环节程序化、标准化。 药物设计与药物发现功能：高通量药物筛选产生大量的化合物结构信息，随着筛选的进行，生物活性信息也特大幅度提高。高通量药物筛选数据库

13、管理系统通过对同一 模型不同的呈现阳性反应的化合物结构进行分析，找出其构效关系，从而为药物设计提供参考。 1.5 筛选模型 是指用于检测药物作用的实验方法。由于高通量筛选要求反应总体积小，而且，反应具有较高特异性和敏感性，因此对于筛选模型也要求较高，常用的筛选模型都在分 子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。目前这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种细胞反应方面。近年也出 现了基因水平的药物筛选模型，使药物筛选模型的范围更为广泛。 1.5.1 以酶为靶的高通量筛选 以酶为作用靶的高通量筛选方法，绝大多数是直接检测酶活性。具体方法根据酶的不同而不同

14、，主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光 的方法两大类。 基于放射性的方法多是将底物标记，测定放射性产物的生成。Taft等建立了(1,3)-葡聚糖合酶抑制剂(抗真菌)的高通量筛选方法。将含有酶的菌丝提取物、-淀粉酶和 UDP-14-葡萄糖加入96孔板的孔中，温孵、反应。终止反应后，滤去未被合成进入的底物。闪烁计数检测滤器上保留的(1,3)-葡聚糖，指示酶活性大小。 也有将酶标记，测定被特异结合的酶的方法。Vollmer等建立了一种以青霉素结合蛋白(PBP)为靶的抗生素的高通量筛选方法。PBP既是糖基转移酶又是肽转移酶，该法是 筛选其糖基转移结构域的活性位点上的可结合物。将莫诺霉素(moenom

15、ycin)结合于一种小球上，制成混悬液，加入96孔板，然后加入3标记的PBP(细菌膜粗提物)和受试化合 物，孵育、过滤去掉非结合的放射性，闪烁计数测得的放射性指示PBP与莫诺霉素结合的情况及受试化合物对其影响。 另外，基于放射性而无需过滤分离的SPA也有应用。Brown等建立了内源性肽酶的水解活性检测方法，用以研究其抑制剂。用3标记的肽底物，通过生物素(biotin)与抗 生物素蛋白(avidin)包裹的SPA闪烁球相连。酶解使3随肽的断裂而离开闪烁球。测定3放射性作用于闪烁球产生的闪烁信号的丢失量，即指示酶活性大小。 基于比色、荧光等的方法有一些报道。Waslidge等建立了脂氧合酶抑制剂的

16、筛选方法。酸性条件下，脂的过氧化物能把Fe2+氧化为Fe3+，然后氧化二甲酚橙(xylenol orange)，产物在可见光区620nm有强烈吸收。在96孔板上测定。Zhang等建立了HIV逆转录酶抑制剂(抗病毒药物)的高通量筛选方法。方法使用了“同质时间分辨荧 光”(homogenous time resolved fluorence，HTRF)技术，既实现了非分离操作(同质)，又避免了放射性同位素的使用。该方法基于逆转录酶能很容易地将核苷酸类似物(如生物 素-11-dUTP)引入新生DNA链。在96或384孔板上，将生物素化的引物/模板与抗生蛋白链菌素-铕在板孔中混合孵育，加入逆转录酶，再

17、加入生物素-dUTP和d-TTP混合物启动 反应。反应60min后，加入链亲和素-别藻蓝蛋白(streptavidin-allophycocyanin)，孵育，用HTRF分析仪读取数据。该法也可用于多种其他的核酸聚合酶。 1.5.2 以受体为靶的高通量筛选 以受体为作用靶的高通量筛选方法，包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。检测功能反应的优点是易 于区分激动剂和拮抗剂。经典的功能检测方法通量低，而引入基于重组技术的报告基因检测方法极大地提高了筛选通量，既高效且节省成本。检测第二信使或下游机制如磷 酸化，传统方法也比较麻烦，不适于高通量检测，但将这些机制与报告基因相

18、偶联则能克服。 1.5.3 以离子通道为靶的高通量筛选 Negri等建立了贝类动物毒素的高通量筛选方法。其作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素(STX)结合位点，用放射性配体(3H-STX)进行竞争 性结合试验考察受试样品。Yong等用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道3亚单位与1亚单位相互作用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。 1.5.4 以核酸为靶的高通量筛选 Hamasaki等建立了以16S rRNA编码区结构和HIV-RRE RNA结构为靶的抑制剂的高通量筛选方法。寻找类似氨基糖甙类抗生素而亲和力更 高或作用于相同核酸的其他位点的新化合物，以及不易被代谢失活的新化合物。方法基于当含芘的氨

19、基甙类似物结合于RNA时，芘的荧光被淬灭的原理。在96孔板上，将芘 碳酰巴龙霉素(PCP)，RNA结构配成溶液后加入有受试化合物的板孔中，用荧光读板器考察荧光恢复的程度。 1.5.5 以细胞功能为基础的高通量筛选 1.5.5.1 内皮细胞激活 内皮细胞激活是急慢性炎症过程中重要的组成环节。Rice等以选择蛋白在细胞表面的表达作为标志，建立了内皮细胞激活抑制剂的高通量筛选方 法。建立人脐静脉内皮细胞培养系统。IL-1刺激下，选择蛋白在内皮细胞表面的表达用ELISA方法定量。方法包括细胞固定、加液、加受试化合物等操作，能保持细胞完整， 不昂贵，可重复，筛选速度可达每星期1000种化合物。适用化合物

20、范围很宽，并且方法用细胞作为检测对象，使能够较早地发现细胞对化合物的摄取及化合物的细胞毒性。 1.5.5.2 细胞凋亡 Erusalimsky等建立了新型细胞凋亡调节物的高通量筛选方法。细胞预先用3 胸苷标记，与凋亡诱导物孵育后，连续经过两种玻璃滤器。一个是中性的， 捕获完整的染色质和高分子量。另一个装有DEAE活性基团，捕获低分子量DNA碎片。通过对滤器上放射性的测量，可以对DNA的破碎情况定量。 1.5.5.3 抗肿瘤活性 Lu等建立了用高通量“生物活性指纹”筛选抗肺癌药物的方法，考察受试分子(类维生素及类维生素相关分子)对许多不同细胞系的效应特点。检 测指标包括：(1)肺癌细胞生长抑制检

21、测。选择了约50种肿瘤和非肿瘤细胞，包括了大量不同的组织和(或)肿瘤来源。细胞暴露于受试化合物5后，用标准比色法测定存活细 胞百分率。20%生长抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制检测，用以区分细胞生长抑制作用和细胞杀伤作用。6孔板上加NCI-H292非小细胞肺癌细胞，暴露于受试物一定时间。 然后对细胞进行清洗，植于无受试物的培养介质共7d。用结晶紫对细胞染色，考察集落形成情况。(3)凋亡检测，用ELISA方法测量细胞DNA破碎。(4)转录调控检测，用以考 察受试化合物是否有类维生素受体介导的转录抑制作用。方法是将HeLa TK-细胞用73Col-CAT报告基因连同受体的表达载体转染，与受试物

22、一起培养，用ELISA方法检测 CAT活性。 1.5.5.4 G2检查点(G2 checkpoint) Roberge等建立了G2期检查点抑制剂的高通量筛选方法。将MCF-7m p53细胞培养，种在96孔聚苯乙烯组织培养板上。照射使细胞进入G2 静止期，加入受试化合物用ELISA方法检测核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，从而得到从G2期释放进入期的细胞数量，即抑制G2检查点程度。 1.5.5.5 信号转导通路 Su等建立了TGF3通路作用物的高通量筛选方法。构建融合报告基因，转染细胞，选择虫荧光素酶表达能被TGF高诱导的克隆。将细胞植于96孔板， 与受试化合物孵育后，稀释并加入Ste

23、ady-Glo底物测虫荧光素酶活力，与对照比较，计算相对酶活性增加值。 1.5.5.6 细菌蛋白分泌 Alksne等建立了以抑制细菌蛋白分泌为作用方式的新型抗生素的高通量筛选方法。该方法基于SecA-lacZ融合报告基因。SecA是一种自我调控翻译的 蛋白，当细菌蛋白分泌被干扰时，该报告基因被诱导。 1.5.5.7 细菌生长 Chung等建立了抑制分枝杆菌生长化合物的高通量筛选方法。选择了一种腐生性分枝杆菌代替结核分枝杆菌，因其具有生长迅速以及非感染性的特点。 通过测定细胞摄入放射性标记的尿嘧啶，考察受试化合物对分枝杆菌活力的作用。用96孔板的形式，1d内可以测试数千个样品。 2生药活性成分的

24、高通量筛选 样品是高通量药物筛选的物质基础，样品库来源的化学多样性是决定高通量筛选技术能否成功的关键因素之一。前面我们谈到，化合物样品主要有常规化学合成、组合 化学合成和从天然产物中分离纯化几个来源。而从天然产物中分离出来的化合物，由于其母核结构和活性基团是长期的自然选择形成的，它们通过高通量筛选所表现出来的 生物活性在药物发现中具有人工合成化合物所不能比拟的优势。 我国拥有非常丰富的药材资源，几十年来，我们应用药理学手段，对我国的传统药物进行了大规模的研究和筛选，取得了巨大成就。但是，仅仅依靠传统的药理实验方 法，既耗时，劳动强度又大，还需要使用大量实验动物，显然不能适应大量样品的同时筛选。

25、虽然经过努力，已从生药中分离、提取、纯化出大量化合物，但由于研究手段 的落后，使大量分离出的化合物得不到充分的利用，造成了化合物资源的极大浪费。 因此，将高通量筛选技术应用于生药的活性成分研究，既是对高通量筛选技术的不断完善，又是将这一技术应用于中药现代化研究的有益尝试。 如何对生药的活性成分进行高通量筛选呢？其原理、方法和人工合成化合物的高通量筛选基本一致，区别主要在于筛选前需要从生药中将化合物提取出来并进行适当的 分离和化学多样性的评价。相同的就不再赘述，这里主要谈一下提取、分离和多样性评价的问题。 2.1 提取 由于高通量筛选需要大量的样品来源，所以常规的提取方法显然不能满足这一要求。寻

26、找一个快速、高效、连续、自动化的提取方法显得迫在眉睫。加速溶剂提 取技术是近年来发展起来的一个新的提取技术，在准备好样品和对提取方法（或程序）进行设定后，自动进样和自动收集装置就可以连续对最多24个不同样品自动完成样品 的提取和提取液的收集，简单方便。应用这一技术，可以得到大量的生药的提取物。 2.2 分离及化学多样性评价 我们都知道，生药的化学成分相当复杂，通过提取得到的提取物往往是大量单体组成的混合物，所以筛选前需要对生药的提取物进行适当的分 离。在众多的分离手段中，制备型HPLC应该是最为理想的，它具有快速、高效、自动化等诸多优点。 分离完成后还需要对分离的物质进行化学多样性的评价，以提

27、高高通量筛选的效率。以前，这种评价多是基于物种的地理分布、生物学分类、化学分类以及基源等关系， 近年来，随着科技的进步，多种现代化手段开始应用于化学多样性的评价。其中，色谱-电喷雾质谱联用（HPLC-ESI-MS）技术在这方面做出了有力的尝试。首先，它做出成 分的离子信号（m/z）对保留时间的平面图，然后对这些数据进行统计学的相似度评估从而对样品的多样性进行定量的评价。接着，三维的HPLC数据被转换为CDF文件格式 并传输到UNIX工作站。数据文件中的每一个离子（包括保留时间、质量、离子强度等数据）被定位在一个二维图谱中，保留时间和质量分占一个轴，离子强度数据储存在位 点中。滤除噪声以后，离子

28、的中心时间和中心质量被计算出来。根据对LCMS的数据处理，混合物间的相似度被定量地计算出来。这种数据处理基于以下的一种关系，这种关 系表征了样品1中的离子i和样品2中的离子j的“化学空间”距离。 其中，ti表示离子i的色谱保留时间，mi表示离子i的质荷比（m/z），wt是保留时间的权重系数，wm是质量的权重系数。dij是离子i和离子j的欧几里的距离，n1和n2分别是 样品1和样品2中确认的离子数。sij是离子i和离子j之间的相似度（0-1），相似度值为1表明是相同样品，相反，相似度值接近0则表明样品具有很高的化学多样性。通过这种方 法，可以很好的解决样品化学多样性的评价问题。 3问题及展望 当

29、然，高通量筛选作为药物筛选的一种方法，它并不是一种万能的手段，特别是在中药研究方面，其局限性也是十分明显的。首先，高通量筛选所采用的主要是分子、 细胞水平的体外实验模型，因此任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；其次，用于高通量筛选的模型是有限的和不断发展的，要建立反映机体全部生理机能或药 物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。但我们应该相信，任何技术的进步，都将为科学的发展起到促进作用。随着我们对高通量筛选研究的不断深入，随着对筛选 模型的评价标准、新的药物作用靶点的研究和发现以及对筛选模型的新颖性和实用性的统一，高通量筛选这一药物筛选新技术必将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作

30、 用。 （1996年） 地区或国家 生物技术专利 /% 药物专利 /% 人DNA序列专利 /% 美国(USA)595140 欧洲(Europe)193324 日本(Japan)171233 其它(Other)543 总计(Total)100100100 生物技术制药的特性 高技术 高投入 长周期 高风险 高收益 三、新型生物药物研制的理论和方法 （一）概述 （二）新药研究和开发的主要过程 （三）先导化合物的寻找 （一）概述 新型生物药物是指利用生物体或生物过程 产生的结构新颖的药物。 结构新颖是指与以前药物有着不同的化学 结构，是一种新的化学实体(New chemical (New chemi

31、cal entityentity，简称NCE)NCE)。这类新型生物药物国家 认定为一类新药。国际上所说的新药开发就 是指开发NCENCE药物。 生物药物分类 根据NCE来源分 一类是利用重组DNA技术，向大肠杆菌、酵母、动物、 植物细胞中导入目的基因，构建重组细胞，生产目的 基因编码的蛋白质类、多肽类药物或疫苗，或将一些 特殊基因及基因片段导入宿主细胞后使宿主细胞产生 原来不能产生的蛋白质，获得新功能，或阻遏宿主细 胞基因的复制、转录、翻译等，抑制其功能，甚至杀 死宿主细胞，这就是常说的基因治疗。 另一类是利用微生物、动植物或酶生产的非上述药品， 通过筛选可获得这类新药的NCE的先异物(Le

32、ad compound)。这类药物种类繁多，包括传统的利用发 酵工程生产的药物和直接从动植物中提取的天然药品 等。 （二）新药研究和开发的主要过程 (1) ) 确定研究计划 要综合考虑医疗、市场、 化学的评估，文献状况，专利的检索，结构 的选择，合成的前景等因素。 (2) 准备化合物 文献研究，合成或分离， 结构鉴定，标准化，专利申请，对研究目标 的复核等。 以上两个环节需占用l2年的时间，需 准备60008000个化合物供筛选。 (3) 药理筛选。 (4) 化学试验 活性成分的分析。 (5) 临床前期(Preclinical I) 进一步 药理研究包括毒性(2种动物)及活性成分的 稳定性。

33、(6) 临床前期(Preclinical ) 进一步 药理研究包括亚急性毒性(2种动物)、畸胎 学研究、药物动力学、动物体内的吸收和排 泄、剂型的研究与开发、包装与保存期的研 究。 以上几个环节占用23年的时间，化合 物分别剩下大约20个、18个和12个。 (10) 注册申请上市 经政府药政部门批准后 提供治疗应用。这一过程需23年。 (11 ) 售后监测(Postmarketing surveillance) 根据情况进行药理试验、毒性试验、特殊 试验和药物动力学试验；对副作用的报告进行 收集、评价和鉴别；对药品生产进行质量控制， 制剂的生产和包装。 可见，一个新药的问世要提供6000 80

34、00个化学物质经历9 13年的时间，耗资 约2.3亿美元。系统性从纵的方面看主要是若 干个环节紧密的衔接和重叠，横的方向主要表 现为多种学科相互之间的渗透性和协同性。 （三） 先导化合物的寻找 在整个新药的研究和开发中，先导化合 物的发现是决定以后研究与开发的首要因 素，要找到一个好的先导化合物，需要建 立好的筛选模型和寻找尽可能多的化合物 来源。先导化合物的筛选是一项复杂的系 统工程，常需要对几个学科同时进行研究。 先导化合物是指具有某种生物活性的化学结 构, ,由于其活性不强, ,选择性低, ,吸收性差, ,或 毒性较大等缺点, ,不能直接药用。但作为新的 结构类型和线索物质, ,对其进行

35、结构变换和修 饰, ,可得到具有优良药理作用的药物。 先导化合物的寻找 1筛选模型的确定 2. 先导化合物来源 1筛选模型的确定 筛选模型的核心是药物作用靶，如细菌、 动物、酶和细胞表面受体等。 v(1)用动物细胞和组织建立的筛选模型 v(2)酶抑制剂的筛选 v(3)受体拮抗剂的筛选 筛选模型 (1) (1) 用动物细胞和组织建立的筛选模型 其中 包括下列物质的筛选： 抗肿瘤活性物质：观察细胞形态的变化， 测定体外细胞毒性LCLC50 50值。 免疫抑制剂：测定对淋巴细胞增殖反应 的抑制作用。 神经营养因子样物质：以神经细胞的分 化，如以神经轴突的伸长为指标。 血管生成抑制剂：以鸡绒毛膜尿囊膜

36、和 动物角膜为材料，观察对新血管生成的抑制作 用。 筛选模型 (2)(2)酶抑制剂的筛选 已经建立了大量的酶抑制剂的筛选模型， 主要有以下6 6种：（抗癌、抗病毒） 蛋白分解酶抑制剂 细胞膜酶抑制剂 糖苷水解酶抑制剂 儿茶酚胺合成酶抑制剂 胆固醇生物合成酶HMGHMGCoACoA还原酶抑制剂 其他酶抑制剂。 筛选模型 (3)(3)受体拮抗剂的筛选 其中包括下列拮抗 物质的筛选： 速激肽(Tachykinin，TK)：以3H标记的物 质与其受体结合的抑制率为指标。 内皮素(Endothelin，ET)：观察内皮素使血 管收缩与其受体结合的抑制率。心血管系统疾病 缩胆囊素(Cholecystoki

37、nin，CCK)：以125I 标记的CCK与其受体结合的抑制率为指标。 心房纳利尿肽(ANP)：以125I标记的ANP与 其受体结合的抑制率为指标。 筛选模型 兴奋性氨基酸(EAA)：观察EAA与其受体 结合的抑制率。 白三烯B4(LTB4)：以人多形核白细胞 (PMN)为LTB4的受体，观察其抑制率。 其他激素受体与C5a 现今筛选靶已扩展到基因水平，开始考 虑以基因复制、转录因子、凋亡基因为治疗 的对象。 2.先导化合物来源 从化学库或天然产物中筛选 化学库是指用特殊合成方式随机合成结 构多样的化合物群体，它的多样性可以得到 较充分的保证，但不能得到结构独特的化合 物。 与受体结合的结构设

38、计（合理新药设计） 合理药物设计(理性的药设计)则是基于受 体三维立体结构的认识，通过计算机辅助分 子设计(Computer aid molecular design)全程 合成新分子。 先导化合物来源 现今从生物中筛选新药重点放在微生物。 化合物的多样性与以下有关： 微生物的种：决定微生物合成的潜在能力； 发酵条件：调整发酵参数可以巧妙地促进不同 次级代谢产物的产生； 地理区域； 生态学环境：最好收集新鲜的野生菌种。 先导化合物来源 除了微生物外，现在人们也开始关注 植物、动物和海洋生物。 植物方面，寻找人们所使用的药用植物， 增加新药发现的机会。 在人类和动物方面，则关注自身免疫系 统。已

39、从人类和动物的吞噬细胞中分离得 到许多具潜在抗菌作用的蛋白质和多肽。 它们有望用作抗菌药物。 先导化合物来源 海洋生物可为新化合物的筛选提供丰富 的资源。目前，海洋天然产物的研究集中在 大型固着无脊椎动物和藻类上，因为这些生 物相对容易识别和采集。 注意：新药的研究与开发不是先导物与新药 的一一对应关系。新药的研究与开发是一个 将化学结构研究与生物活性研究连接起来的 创造性过程，是不断地对初始治疗概念进行 发展和完善的过程。 四、生物制药技术新进展 （一）人类基因组研究与未来药学 （二）抗体工程 （三）转基因技术 （四）海洋药物 ( (五) ) 生物技术制药工业发展动态 （一） 人类基因组研究

40、与未来药学 人类现有的20352035类，1800018000种疾病，都直接或间接与基 因有关。可分为三大类，单基因疾病、多基因病、获得 性基因病。人类基因组的研究成果、可以大大提高人类 对基因受损和人类疾病的关系的了解，从以下几方面促 进未来药学的发展。 (1) (1) 基因诊断 基因图谱的最大最直接用途当属医疗 诊断，特别像心脏病等源于遗传基因变异的疾病。 (2(2） 基因治疗 基因治疗是指将遗传物质导入载体或 受体细胞，通过替代缺陷基因、修正错误基因，对抗异 常基因，调节基因产物的表达方式以实现治疗疾病目的 的一种治疗方法。人们可以根据引起疾病的基因缺陷， 通过定向纠正、替换那些错误基因

41、，达到治病的目的。 (3) (3) 基因组药物学 通过研究个体对包括药 物在内的外界化学物质（有毒外源物) )反应 的遗传多样性和差异性，达到科学合理用药 的目的。 (4) (4) 发现和开发新的蛋白质和多肽类药物。 (5) (5) 提供大量药物作用新的靶点，供新药的 筛选、研究用。 （二）抗体工程 1.1.抗体工程的发展 多克隆抗体：将某种天然抗原经各种途径免疫 动物，成熟的B B细胞克隆受到抗原刺激后，便产 生抗体并将之分泌到血清和体液中，这种抗体实 际上是一种混合物； 单克隆抗体：19751975年KohlerKohler和MilsteinMilstein首次用B B 淋巴细胞杂交瘤技术

42、制备出均一性的针对某一特 定抗原决定簇的单克隆抗体，即第二代抗体或细 胞工程抗体，但具有鼠源性，进入人体后会引起 人抗抗体反应(HAMA(HAMA反应) )； 基因工程抗体：将抗体的基因按不同需要进 行改造和重组，然后导入适当的受体细胞中 进行表达，便产生了第三代抗体基因工程 抗体。 基因工程抗体的优点 2 2 基因工程抗体的优点（与单克隆抗体相比） （1 1）通过基因工程技术改造，可以降低抗体的免疫 原性，使抗体人源化，消除HAMAHAMA反应； （2 2）基因工程抗体的分子质量一般较小，更利于穿 透血管壁，进入病灶的核心部位，从而改善其体内 药代动力学性质； （3 3）利用抗体库技术，不需

43、用抗原免疫动物便可以 获得针对任何一种抗原决定簇的抗体，甚至制备出 用单克隆抗体技术无法实现的新型抗体： （4 4）可以采用原核、真核表达系统以及转基因动植 物生产出大量的基因工程抗体，降低了生产成本。 3 3 基因工程抗体的种类 基因工程抗体主要分两大类，即大分子 抗体和小分子抗体。前者目的是使鼠单抗人 源化；而后者则是使抗体具有更好的通透性， 易于到达靶部位。 4 4其他形式的抗体衍生物 (1(1） 双特异性抗体 (2) (2) 双功能抗体 (3) (3) 抗体酶 （4 4） 抗体库技术 抗体库技术 抗体库技术的主导思想是将某种动物的所有 抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达， 利用不同

44、的抗原筛选出携带特异抗体基因的 克隆，从而获得相应的特异性抗体。 抗体库技术 WinterWinter等人于19941994年建立了噬菌体抗体 库技术，它是抗体工程研究领域的一次飞跃。 在这之前，基因工程抗体技术只能对已有的 单抗进行改造，而抗体库技术的诞生却可以 不通过动物免疫和细胞融合便可以从抗体库 中筛选得到全新的人源化的抗体，并通过细 菌发酵或转基因动植物生产出来。抗体库技 术的发展使得抗体工程技术进入了一个全新 的时期。 （三） 转基因技术 1 1 转基因动物制药 转基因动物（transgenic animal)transgenic animal)就是某种目的 基因导入到哺乳动物的受

45、精卵或胚胎里，使导入的基 因与受精卵的染色体DNADNA整合在一起，当细胞分裂时， 随着染色体的倍增，该目的基因也随之倍增，这样每 个细胞里就都带有导入的基因，而且能稳定地遗传到 下一代，这样一种新的个体，称之为转基因动物。 已在以下动物的奶汁中生产出一些人类蛋白质药物： 牛奶中有抗凝血酶、纤维蛋白原、人白血清蛋白、胶 原蛋白、生育激素、乳缺蛋白、糖基转移酶、蛋白C C等； 山羊奶中有抗凝血酶原、-抗胰蛋白酶(-AT)(-AT)、生 育激素、血清白蛋白、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)(tPA)、 单克隆抗体；绵羊奶中有抗胰蛋白酶、凝血因子、纤 维蛋白原、蛋白质C C；猪奶中亦有蛋白质C C、凝

46、血因子、 纤维蛋白原、血红蛋白。 （三） 转基因技术 2 2 转基因植物制药 利用转基因植物作为生物反应器生产药 用蛋白，这是最近十几年来发展起来的一个 值得关注的研究领域。目前科学家已较成功 地采用了番茄、马铃薯、莴苣、香蕉等转基 因植物生产口服疫苗，这样一方面可以避免 或至少减免部分纯化过程，从而大大降低生 产成本，另一方面人们只需食用这种转基因 食品就可以获得满意的免疫效果，既方便又 便宜，而且很安全。 （四） 海洋药物 海洋生物资源具有广阔的综合利用前景，从海洋 生物体内获取有功效的初生代谢产物与次生代谢产 物，可发展海洋药物，海洋生物保健品、海洋生物 化工产品。 国际上已研制出一些具

47、有特殊疗效的海洋药物 和海洋功能食品。 我国于1996年正式启动国家海洋“863”计划，海 洋生物技术作为其中的主题之一。新型抗艾滋病海 洋药物911已完成了临床前药学、药效学和毒理学研 究，已获准进入I期临床试验，成为我国具有自主知 识产权的第一个抗艾滋病药物。抗肿瘤新药K-001也 已完成了全部临床前研究。甲壳质衍生物916抗动脉 粥样硬化新药已申报了临床研究等等。 (五)生物技术制药工业发展动态 生物技术与生物制药联合企业的发展正 日益全球化，在生物技术企业发展中美国位 居世界榜首 目前主要生物技术公司多分布在美国，如 Amgen Genetics institute Genzyme,Genentech