叶酸代谢能力基因检测操作流程

1、实验流程一、操作步骤适用仪器： 普通 PCR仪样本要求： EDTA抗凝剂的静脉全血 （100l ），室温保存不超过 7 天， 2 8保存不超过 1个月，- 20保存不超过 3个月，反复冻融次数不超过 5 次；DNA的浓度应不低于 5ng/ l ， A260/ A 280 应在 之间。有血块的样本需经匀浆处理或用组织研磨仪研磨处理后再进行全血DNA的提取。检验方法：（试剂盒中的检本测卡、阳性 / 阴性对照卡上标识解释如下： M表示突变型， WT表示野 生型， C 表示质控线， T 表示检测线。）A： 样本 DNA的制备试剂盒准备工作：1、清洗液 BW-I：用 50 ml 量筒分别移取 35 ml

2、 无水乙醇（分析纯）和 35 ml 异丙醇加入至清洗 液 BW-I 试剂瓶中，颠倒混合均匀，在试剂瓶上标明“已加入醇”和日期，备用。2、清洗液 BW-II ：用 50 ml量筒移取 49 ml 无水乙醇加入至清洗液 BW-II 试剂瓶中，颠倒混合均 匀，在试剂瓶上标明“已加入醇”和日期，备用。3、蛋白酶 K 准备：取出蛋白酶 K，室温解冻，涡旋混匀后备用。4、磁性微粒准备：将磁性微粒涡旋混匀，保证均一。实验操作步骤：1. 将 20 l 蛋白酶 K溶液加入 2 ml 离心管的管底。依次加入 100 l 全血、 200 l 裂解液 BL，用涡旋振荡器混合 15 sec（ 以下简称涡旋混匀 ），56

3、 水浴 20 min。2. 向步骤 1裂解处理的样品中依次加入 300 l 结合液 BI、25 l 的磁性微粒 （移取前必须充 分涡旋混匀），涡旋混匀，室温静置 5 min 。磁性分离 5 min ，弃上清。3. 从磁性分离器上取出离心管， 加入 400 l 清洗液 BW-I，涡旋混匀， 磁性分离至上清澄清 （期 间上下颠倒数次，以清洗离心管管壁） ，弃上清；重复本步操作，以 400l 清洗液 BW-I 重复 清洗一次。4. 从磁性分离器上取出离心管， 加入 400 l 清洗液 BW-II ，涡旋混匀，磁性分离至上清澄清 （期 间上下颠倒数次，以清洗离心管管壁） ，弃上清（尽可能弃去所有的清洗

4、液 BW-II ）。5. 打开离心管盖，将其室温晾干 5 min6. 从磁性分离器上取下离心管，向管中加入 100 l 洗脱液 ES，涡旋混匀， 56水浴 5 min 。7. 将离心管置于磁性分离器上，磁性分离至上清澄清。将上清液（分离纯化得到的DNA溶液）转移到 2 ml 离心管中，直接用于下游实验或于 -20 保存备用。B：PCR扩增液准备（1）每人份需做两个反应，取两个无菌 PCR薄壁管，在 PCR薄壁管管盖上依次标有 M、WT。（2）将试剂从 - 20取出平衡至室温，瞬时离心。在标有 M的管中加入 29l 扩增液（ M），在标 有 WT的管中加入 29 l扩增液（ WT）。（3）分别向

5、以上 M和 WT各管中加入 1l反应液。将管盖盖紧后，涡旋混匀，瞬时离心待用。C：待检测 DNA样本的配制在上述标有 M、WT管中分别加入 3l待测基因组 DNA，分别再加入 17l ddH2O使终体积为 50 l 。 将管盖盖紧后，涡旋混匀，瞬时离心。D：PCR扩增将 PCR管放入 PCR仪中，按如下程序扩增： 50 2 min；95 5min ； 94 30sec、60 30sec、65 1min （ 26Cycles ）；65 10min ； 4 Hold 。取出 PCR产物， 28保存。E：检测卡检测实验从密封袋中取出检测卡，将待测样本 M与 WT管中的 PCR产物分别滴加在检测卡对应

6、的样品垫处， 待 25 min 对结果进行判读， 20min后结果不可靠。F：质量控制1）检测结果中阳性对照应在阳性对照卡检测线（ T线）出条带，阴性对照应在阴性对照卡检测线（ T线）不出条带。正常检测时，应定期进行阳性对照品及阴性对照品实验。（2）阳性对照品实验：取两个无菌 PCR薄壁管，在 PCR薄壁管管盖上依次标有 M、WT，将 20l M阳性对照液、 20l WT 阳性对照液分别加入标有 M、WT的 PCR薄壁管中，再依次分别加入 M扩 增液 29l及 1l反应液、 WT扩增液 29l及 1l反应液，按照步骤中 DF完成，检测线（ T 线）及质控线（ C线）均应出现条带。（3）阴性对照

7、品实验：取两个无菌 PCR薄壁管，在 PCR薄壁管管盖上依次标有 M、WT，将 M扩增 液 29l 、1l反应液及 WT扩增液 29 l 、1l反应液分别加入标有 M、WT的 PCR薄壁管中， 再 分别加入 20l阴性对照液，按照步骤中 DF完成，质控线（ C线）应出现条带，检测线（ T 线） 应无条带出现。G：结果判读（如下图、下表）如上图一所示，以阳性对照液为模板进行 PCR反应，对 PCR产物进行检测，检测线（ T 线）有条 带出现，作为阳性对照；以阴性对照液为模板进行PCR反应，对 PCR产物进行检测，检测线（ T线）无条带出现，为阴性对照。若阴性样本有条带出现，有可能加样时未及时更换

8、吸头，有 DNA 污染，建议在操作过程中，先配制阴性对照管并及时闭合 PCR管盖。图二显示 MTHFR 677C表C 示 正常野生型；图三显示 MTHFR67 7TT表示一对等位基因的第 677 位胞嘧啶（C）均变为胸腺嘧啶（T）， 即纯合突变；图四显示 MTHFR6 77CT表示其中一个等位基因的第 677位胞嘧啶（ C）变为胸腺嘧啶 （T），即杂合突变；图五质控线（ C线）无条带或质控线（ C线）与检测线（ T 线）均无条带，即 为无效检测。无效原因可能为操作不正确或试纸条已变质损坏。应再次仔细阅读说明书，并用新 的检测卡重新检测。如果问题仍然存在，应立即停止使用该批号产品，并与厂家或供应

9、商联系。图一 阳性及阴性对照图二 野生型 图三 纯合突变 图四 杂合突变图五 无效图H：注意事项（ 1）实验室应该遵循 PCR实验规范的要求分区操作，各区物品均为专用，不得交叉使用，加模板和引物 的移液器不能混用，每次加样后均需更换吸头，推荐使用无核酶、带滤芯的吸头。各区的仪器、设备和工 作服应独立使用。（2）本试剂盒用于体外操作。用户切勿吸入试剂或直接接触皮肤。（3）使用本试剂盒前，请仔细阅读说明书，严格按照说明书的要求操作。打开包装后请尽快使用。（ 4）使用本试剂盒时，因 PCR体系为 50 l 体系，应使用 200l 的 PCR扩增管进行操作。（5）本试剂盒备有“ PCR组分加入确认单”，在【检测方法】中的步骤B（PCR扩增系统