稗草和莴苣种子休眠及萌发生理的研究

1、目录目录摘 要 . iABSTRACT . iii第 1 章 前言 . 11.1 种子的休眠与萌发 . 11.2 种子的结构对种子休眠与萌发的影响 . 11.2.1 后熟和冷层积对种子休眠与萌发的影响 . 11.2.2 种皮对种子休眠与萌发的影响 . 11.2.3 降解细胞壁的三种酶对种子休眠与萌发的影响 . 21.3 温度对种子休眠与萌发的影响 . 21.4 激素对种子休眠与萌发的影响 . 21.5 硝酸盐对种子热抑制的影响 . 41.6 稗草与莴苣种子研究概述 . 41.7 本实验研究的目的及意义 . 5第 2 章稗草种子休眠的释放及萌发过程中b-甘露聚糖酶、b-甘露糖甘酶和a-半乳糖苷酶

2、的酶活性变化 . 62.1 材料 . 62.1.1 植物材料 . 62.1.2 试剂 . 62.2 实验方法 . 62.3 结果与分析 . 92.3.1 稗草种子萌发对温度的响应 . 92.3.2 GA、6-BA 和划伤对稗草种子萌发的影响 . 102.3.3 后熟对稗草种子萌发的影响 . 102.3.4 冷层积对稗草种子萌发的影响 . 112.3.5 稗草种子萌发过程中b-甘露聚糖酶、b-甘露糖苷酶和a-半乳糖苷酶的酶活性变化 . 122.3.6 后熟对b-甘露聚糖酶、b-甘露糖苷酶和a-半乳糖苷酶的酶活性的影响 . 132.3.7 冷层积对b-甘露聚糖酶、b-甘露糖苷酶和a-半乳糖苷酶的酶

3、活性的影响 . 132.4 讨论 . 142.4.1 稗草种子休眠与萌发的特性 . 14第 I 页目录2.4.2 稗草种子萌发过程中b-甘露聚糖酶、b-甘露糖苷酶和a-半乳糖苷酶的酶活性变化 . 142.4.3 后熟对b-甘露聚糖酶、b-甘露糖苷酶和a-半乳糖苷酶的酶活性的影响 . 152.4.4 冷层积对b-甘露聚糖酶、b-甘露糖苷酶和a-半乳糖苷酶的酶活性的影响 . 152.5 小结 . 16第 3 章硝酸盐调控莴苣种子热抑制过程中 ABA 和 GA 生物合成及降解关键基因的表达 . 173.1 材料 . 173.1.1 植物材料 . 173.1.2 试剂耗材 . 173.2 实验方法 .

4、 173.2.1 萌发实验 . 173.2.2 莴苣种子热萌发的恢复实验 . 183.2.3 硝酸盐对莴苣种子萌发的作用 . 183.2.4 RNA 提取. 183.2.5 cDNA 的合成. 183.2.6 实时定量 PCR. 193.2.7 数据分析 . 213.3 结果与分析 . 213.3.1 莴苣种子萌发对温度和光照的响应 . 213.3.2 莴苣种子具有典型的热抑制 . 213.3.3 硝酸盐对莴苣种子热抑制的影响 . 223.3.4 硝酸盐对莴苣种子热萌发过程中 ABA 生物合成及降解关键基因表达的影响 . 233.3.4.1 对 ABA 合成关键基因表达的影响. 233.3.4

5、.2 对 ABA 降解关键基因表达的影响. 243.3.5 硝酸盐对莴苣种子热萌发过程中 GA 生物合成及降解关键基因表达的影响 . 263.3.5.1 对 GA 合成关键基因表达的影响 . 263.3.5.2 对 GA 降解关键基因表达的影响 . 273.4 讨论 . 283.4.1 莴苣种子的热抑制 . 283.4.2 硝酸盐对莴苣种子的热抑制的影响 . 29第 II 页目录3.4.3 硝酸盐调控莴苣种子热萌发过程中 ABA 生物合成及降解关键基因的表达 . 293.4.4 硝酸盐调控莴苣种子的热萌发过程中 GA 生物合成及降解关键基因的表达 . 293.5 小结 . 30第 4 章结论.

6、 31致 谢 . 32参考文献 . 33作者在学期间取得的学术成果 . 39第 III 页表目录表目录表 2.1 对硝基苯酚标准曲线制作 . 8表 2.2 GA 和 6-BA 对稗草种子萌发的影响 . 10表 3.1 不同温度和光照条件对莴苣种子萌发的影响 . 21第 I 页图目录图目录图 2.1图 2.2图 2.3图 2.4图 2.5图 2.6图 2.7图 2.8图 3.1图 3.2对硝基苯酚标准曲线 . 8稗草种子对温度的响应 . 9后熟对稗草种子萌发的影响 . 11冷层积对稗草种子萌发的影响 . 11稗草种子的萌发进程 . 12稗草种子萌发过程中三种酶的酶活性变化 . 12后熟对稗草种子

7、内三种酶活性的影响 . 13冷层积对稗草种子内三种酶活性的影响 . 14莴苣种子对温度的响应 . 22硝酸盐对莴苣种子热抑制的影响 . 23图 3.3 ABA 合成关键基因的表达变化. 24图 3.4 ABA 降解关键基因的表达变化. 25图 3.5 GA 合成关键基因的表达变化 . 27图 3.6 GA 降解关键基因的表达变化 . 28第 II 页摘摘要要种子的休眠与萌发受自身结构特征和外部因素的影响。本研究以稗草和莴苣种子为研究材料，稗草是水稻田中的杂草，在高温多雨季节，水稻种子很容易产生穗萌，稗草种子不会发生穗萌，但是影响稗草种子休眠的主要因子尚不明确，降解细胞壁的三种酶是否与稗草种子的

8、萌发具有相关性。并且，在热带地区很多栽培作物受温度的限制，不能萌发或萌发不整齐，而莴苣喜冷凉气候，不耐热的光敏感性植物，具有典型的热抑制现象，是研究温度对种子休眠与萌发的好材料，且硝酸盐可以释放莴苣种子的热抑制，而 ABA 可以拮抗硝酸盐的作用，但是硝酸盐是否介导莴苣种子内 ABA 和 GA 生物合成及降解关键基因的表达尚不清楚。通过研究温度、划伤种皮、GA、6-BA、后熟和冷层积等对稗草种子萌发的影响，稗草种子萌发过程中，b-甘露聚糖酶、b-甘露糖苷酶和a-半乳糖苷酶的酶活性的变化，以及后熟与冷层积处理后稗草种子中这三种酶的酶活性的变化；同时研究了光和温度对莴苣种子萌发的影响，硝酸盐对莴苣种

9、子热抑制的作用，以及硝酸盐介导下莴苣种子热萌发过程中 ABA 和 GA 生物合成及降解关键基因的表达。得到以下几点结论：(1) 稗草种子的萌发受温度的抑制，20oC 是稗草种子萌发的最适温度，当温度大于或者小于 20oC 都将会抑制稗草种子的萌发。(2) 划伤种皮可以提高稗草种子的萌发率，说明稗草种子具有物理休眠特性。后熟和冷层积可以释放稗草种子的休眠，随着延长后熟和冷层积处理稗草种子的时间，稗草种子的萌发率提高。但是当后熟处理时间 300 d 后，稗草种子的萌发率随后熟处理时间的延长而降低；冷层积处理 360 d 的稗草种子萌发率也比冷层积处理 300 d 的萌发率低。说明稗草种子的休眠与稗

10、草种子胚的成熟有关，具有生理休眠。(3) 植物激素 GA 和 6-BA 不能促进稗草种子萌发。(4) 在稗草种子萌发过程中，b-甘露聚糖酶和b-甘露糖苷酶的酶活性随着萌发率的提高而提高，但是a-半乳糖苷酶活性没有发生显著性变化。后熟处理下b-甘露糖苷酶的活性提高，而冷层积提高了a-半乳糖苷酶活性。后熟可能是通过影响b-甘露糖苷酶的活性来影响稗草种子的萌发，而冷层积可能是通过影响a-半乳糖苷酶活性来影响稗草种子的萌发。(5) 莴苣种子的萌发受到温度和光照的影响。在光照和黑暗条件下，温度大于17oC，莴苣种子萌发受到抑制，将莴苣种子转移至最适温度下，莴苣种子能恢复萌发，说明莴苣种子具有典型的热抑制

11、特性。(6) 使用 5、10、20 mM 硝酸钾可以促进莴苣种子的萌发，且 10 mM 的硝酸钾第 i 页摘要为最适浓度，能释放破莴苣种子的热抑制。(7) 在莴苣种子热萌发过程中，高温促进 ABA 合成关键基因 LsNCED1、LsNCED3 和 LsNCED4 的表达，抑制 ABA 降解关键基因 LsABAox1、LsABAox2、LsABAox3 和 LsABAox4 的表达；加入 10 mM 硝酸盐，硝酸盐抑制 ABA 合成关键基因 LsNCED3 和 LsNCED4 的表达，促进 ABA 合成关键基因 LsNCED1 和 ABA 降解关键基因 LsABAox1、LsABAox2、LsA

12、BAox3和 LsABAox4 的表达，特别是 LsABAox1、LsABAox2 和 LsABAox3 的表达。(8) 在莴苣种子热萌发过程中，高温抑制 GA 合成关键基因 LsGA20ox1、LsGA20ox2 和 LsGA3ox1 的表达，促进 GA 降解关键基因 LsGA2ox1 和LsGA2ox2 的表达；加入 10 mM 硝酸盐，硝酸盐促进了 GA 合成关键基因LsGA20ox1、LsGA20ox2、LsGA3ox1 和 LsGA3ox2 的表达，抑制了 GA 降解关键基因 LsGA2ox2 的表达。主题词：稗草种子，莴苣种子，休眠，萌发，b-甘露聚糖酶，b-甘露糖甘酶，a-半乳糖

13、苷酶，热抑制，硝酸盐，ABA，GA第 ii 页ABSTRACTABSTRACTThe dormancy and germination of seeds were influenced by their structural andenvironmental factors. In this study, we used the barnyard grass and lettuce seeds asresearch material. The barnyard grass was the weed of rice field, the rice seeds wereeasy to germin

14、ate in the high temperature and rainy season, but the seeds of barnyardgrass were not germinated. Now, the factors which effected the dormancy andgermination of the barnyard grass were not be known clealy, and is it related to theenzymes activities of the degradation of cell wall. In addition, the g

15、ermination of manycrops seeds were inhibited by temperature in tropical areas, they were not germinated orin the same time. the lettuce liked growth in the cool climate, it was not tolerence to hot,however, it sensitived to light. The lettuce had the typical thermoinhibitioncharacteristic, and it wa

16、s suit for research the influence of temperature on the dormancyand germiantion of seeds. Nitrate can released the thermoinhibition of lettuce seeds,ABA can inhibited the effector of nitrate. But it not were known about the nitrteregulated the biosynthesis and metabolism genes of ABA and GA. We inve

17、stigated theeffect of the temperature, cutting seed coat, GA, 6-BA, after-ripening andcold-stratification to the barnyard grass seeds, and the different of b-mannanase,b-mannosidase and a-galactosidase activities on the germination of the barnyard grassseeds, and the after-ripening and cold-stratifi

18、cation were effected the activities of thethree enzymes, at the same time, we investigated the effect of temperature and light tothe lettuce seed, and the function of nitrate to the thermoinhibition of lettuce seeds, andthe nitrate regulated the expression of ABA and GA biosynthesis and metabolism g

19、eneson the germination of lettuce seeds. Get the following conclusions,(1) The germination of the barnyard grass seeds was inhibited by the temperature,the optimum temperature was 20oC, when the temperature up or down 20oC wouldinhibited the germination of the barnyard grass seeds.(2) Cutting the se

20、ed coat was promoted the germination of the barnyard grass seeds,so the seeds had the physical dormancy. Following the time of the treatment ofafter-ripening and cold stratification to extend, the germination of barnyard grass seedswas promoted. After the 300 d of the treatment of after-ripening, th

21、e germination of thebarnyard grass seeds was decreased; the germination of the cold stratification treatment360 d of the barnyard grass seeds was lower than the cold-stratification treatment 300 d,so, the seeds also had the physiological dormancy.(3) The plant hormone of GA and 6-BA did not promoted

22、 the germination of thebarnyard grass seeds.(4) On the germination of the barnyard grass seeds, the activities of b-mannanaseand b-mannosidase was increased by the incubation time, but the activity of the第 iii 页ABSTRACTa-galactosidase had no significance changes by the incubation time. After-ripenin

23、gincreased the activity of the b-mannosidase, and the cold stratification increased theactivity of the a-galactosidase, so after-ripening maybe effect the activity of theb-mannosidase to effect the germination of the barnyard grass seeds; cold stratificationmaybe effect the activity of the a-galacto

24、sidase to effect the germination of thebarnyard grass seeds.(5) The germination of lettuce seeds was effected by the light and temperature, inthe light or dark, when the temperature was up 17oC, the germination of lettuce seedswas inhibited, and then send the lettuce seed in the optimum temperature,

25、 the lettuceseed can recover germinate, so the lettuce seeds had the typical thermoinhibitioncharacter.(6) Using 5, 10 and 20 mM nitrate to treatment the lettuce seed, nitrate promotedthe germination of lettuce seeds. It broke the thermoinhition of lettuce seeds.(7) On the germination of the lettuce

26、 seed, the high temperature increased the ABAsynthesis genes expression of LsNCED1, LsNCED3 and LsNCED4, and then decreasedthe ABA metabolism genes expression of LsABAox1, LsABAox2, LsABAox3 andLsABAox4, added the 10 mM nitrate, nitrate decreased the expression of LsNCED3 andLsNCED4, and then increa

27、sed the expression of LsNCED1, LsABAox1, LsABAox2,LsABAox3 and LsABAox4, especially about the expression of LsABAox1, LsABAox2 andLsABAox3.(8) On the germination of the lettuce seed, the high temperature decreased the GAsynthesis genes expression of LsGA20ox1, LsGA20ox2 and LsGA3ox1, and thenincreas

28、ed the GA metabolism genes expression of LsGA2ox1 and LsGA2ox2, added the10 mM nitrate, nitrate increased the expression of LsGA20ox1, LsGA20ox2, LsGA3ox1and LsGA3ox2, and decreased the LsGA2ox2.Key Words： Barnyard grass seeds, Lettuce seeds, Dormancy, Germiantion,b-mannanase, b-mannosidase, a-galac

29、tosidase, Thermoinhibiton, Nitrate, ABA, GA第 iv 页第 1 章 前言第 1 章 前言1.1 种子的休眠与萌发种子是植物繁衍和传播的主要器官。对于栽培物种而言，生产上往往需要种子发芽迅速、整齐、成苗快，以获得高的经济产量；另一方面，缺乏休眠的种子通常在成熟前就萌发，特别是在成熟期间遇到高温、多雨环境时，种子在穗上萌发已成为禾谷类作物生产的一个问题，包括水稻、玉米、小麦和大麦1。种子的休眠(dormancy)与萌发(germination)是植物生活周期中的主要阶段。种子的萌发是指种子的胚从相对静止状态变化为生理活跃状态，并长成营养生活的幼苗的过程。而

30、种子休眠是指在一定的时间内，具有活力的种子在任何正常的物理环境因子(后熟、温度、光照或黑暗等)的组合下不能完成萌发的现象2-3。种子休眠能够保护物种在恶劣的环境中存活，减少同一物种个体之间的竞争，以及防止种子在不适宜的季节萌发。它是植物在长期系统发育进程中获得的一种适应环境变化的特性。当环境条件变得有利于植株生长时，种子萌发在一定的程度上决定了物种的生存4。种子萌发时间的选择与种子休眠的存在或缺乏联系。种子的休眠和萌发受外界因子和自身的特征如种子的结构、植物激素的含量以及种子携带的遗传信息等的影响。且种子的萌发还受种子休眠程度的影响。1.2 种子的结构对种子休眠与萌发的影响1.2.1 后熟和冷

31、层积对种子休眠与萌发的影响种子胚对种子休眠与萌发的影响主要是由于胚的成熟性所致的。后熟(after-ripening)是指胚休眠的种子采收后需经过一系列的生理生化变化达到真正成熟，才能萌发的过程。Kaye 等人在研究烟草种子中发现，后熟可以促进烟草种子萌发。种子在成熟过程中代谢不活跃5，含水量降低。经过后熟处理，可以释放种子的休眠，获得萌发的能力6-7。低温处理种子，使得种子休眠释放称为冷层积(stratification)。冷层积对种子萌发的影响与后熟同机理，影响种子胚的发育成熟。在具有胚、种皮强加、初生和次生休眠的种子中，冷层积可以释放种子的休眠8。但是不同的种子，因其组成不同，休眠释放所

32、需的冷层积处理时间也不相同。1.2.2 种皮对种子休眠与萌发的影响种子的萌发是始于吸胀吸水，结束于胚根的暴露。在很多物种中，首先是胚根，胚根伸长穿透胚乳和种皮完成萌发9。种子吸水受种子结构特征影响，主要影第 1 页第 1 章 前言响水分的渗透是否均匀10。从某种程度上讲，种皮抑制种子的吸水，从而抑制了种子的萌发。且种皮可能阻碍内部抑制萌发的物质溢出，抑制种子萌发。所以破坏种皮，可以促进种子的萌发。1.2.3 降解细胞壁的三种酶对种子休眠与萌发的影响种子吸水后，一系列生理生化发生变化，胚根伸长。胚根突破种皮时，首先突破胚乳细胞壁。细胞壁的降解在种子萌发过程中起着非常重要的作用11-12。已有研究

33、表明，许多种子的胚乳细胞壁主要是由甘露聚糖聚合物组成13。而且甘露聚糖聚合物是碳水化合物的储藏类型，碳水化合物是种子萌发的主要能源14。甘露聚糖聚合物主要被三种酶水解：第一个水解酶是b-甘露聚糖酶(b-mannanase(EC3.2.1.78)，该酶将甘露聚糖聚合物水解成甘露二糖和甘露三糖； b-甘露糖苷酶(b-mannosidase (EC 3.2.1.25)将甘露二糖和甘露三糖水解成甘露糖；a-半乳糖苷酶(a-galactosidase(EC 3.2.1.22)从半乳糖甘露聚糖中水解出半乳糖残基15。已有研究表明这三种酶的活性变化与双子叶植物番茄种子的萌发相关。且这三种酶的活性变化在单子叶

34、植物的水稻种子的萌发过程中也有变化16。但是这三种酶在种子休眠与萌发中的具体作用尚不明确。1.3 温度对种子休眠与萌发的影响种子休眠与萌发主要受外界因素的影响，其中外部环境主要有光、水、温度和氧气。许多植物种子暴露在不适宜萌发的环境下，种子将不能萌发而产生休眠来自我保护。影响种子休眠与萌发的主要环境因子是温度。高温能抑制种子萌发，但是当把种子转移至适宜温度下，将恢复萌发。这种在高温下萌发受到抑制称为热 抑 制 (thermoinhibition) ； 在 高 温 下 种 子 表 现 出 休 眠 的 状 态 称 为 热 休 眠(thermodormancy)17-20。在一年的四季中，温度是决定

35、种子萌发的主要生态因子21。但是在高温的夏天，温度将会延迟需要低温萌发的种子的萌发，或者导致不萌发而表现出休眠的状态，导致产量下降。但是温度对种子的休眠与萌发影响的机制尚不明确。1.4 激素对种子休眠与萌发的影响现已研究表明种子的休眠与萌发同脱落酸 (Abscisic Acid,ABA)、赤霉素(Gibberelic Acid,GA)和细胞分裂素有关。N6-呋喃甲基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA)是一种非植物内源的生长调节物，能促进细胞分裂，是一种细胞分裂素22-23。在玉米种子中，6-BA 能提高a-淀粉酶的生成，并促进其活性，从而促进种子的萌发24。低浓度的 6-BA 随着浓度的第 2 页第 1 章 前言增加而提高大豆种子的萌发率，但是浓度过高会抑制大豆种子的萌发25。在莴苣种