感染马立克氏病病毒SPF鸡法氏囊蛋白质组学研究

1、感染马立克氏病病毒 SPF鸡法氏囊蛋白质组学研究马立克氏病病毒(Marek s Disease Virus, MDV是一种致肿瘤性疱疹病毒, 能够引起内脏和皮肤肿瘤 , 侵染中枢神经系统 , 导致易感鸡瘫痪或死亡。 马立克氏 病病毒引起的马立克氏病 (Marek s Disease,MD) 也是一种目前人类能成功用疫 苗进行预防的肿瘤性疾病 , 具有重要的比较生物学意义。研究马立克氏病病毒感染的鸡在感染不同阶段的蛋白质组学 , 将为认识淋巴 瘤的形成提供更基础、更广泛的资料 , 并可能为肿瘤的治疗提供新的方法和新的 思路。法氏囊作为禽类特有的重要淋巴器官 , 它既执行着中枢免疫功能也执行着 二

2、级免疫功能。溶细胞阶段是MDVS染周期中的一个重要阶段，这个过程主要发生在法氏囊 组织,并且这个过程的直接结果通常会导致免疫抑制 ,从而增加对其它疾病的易 感性。本论文在成功建立了法氏囊组织双向凝胶电泳 (Two dimensional gel electrophoresis,2-DE) 技术基础上,分别对MDV超强毒株RB1B感染的SPF鸡在 不同阶段法氏囊组织中病毒感染水平和宿主差异蛋白质组进行研究 , 对其中的部 分差异点进行了质谱鉴定和回复验证。并对差异蛋白进行生物信息学分析，探讨了 MDV感染引起法氏囊差异蛋白变 化的意义和可能机制。1.鸡法氏囊蛋白质组学双向电泳方法的建立以SPF鸡

3、的法氏囊组织为研究对象,用固相pH梯度胶条进行等电聚焦,SDS-PAG垂直电泳,采 用不同的样品制备方法 , 对上样量、水化、等电聚焦、胶条平衡和凝胶染色方法 等进行一系列优化 ,并应用 PDQuest 8.0.1 软件对图谱进行初步分析。结果显示法氏囊组织在pH5-8范围17 cm的2-DE胶上可以得到很好的分离,胶体考染后经PDQuest软件分析正常法氏囊组织可检测到 800个以上蛋白点，不 同 2-DE 图谱间蛋白点平均匹配率为 83.5%。本研究建立了鸡法氏囊组织蛋白质组双向电泳技术 , 为法氏囊发育进化及其免疫功能的研究提供了可靠的技术和理 论依据。2. 马立克氏病病毒感染后法氏囊组

4、织中病毒感染水平研究MDV在体内的感染分为四个主要阶段 : 早期溶细胞感染 , 潜伏感染 , 再次溶细胞感染 , 肿瘤细胞增 生。本研究用超强毒株 RB1B感染SPF鸡,感染后的不同阶段（4DPI、7DPI、14DPI 和21DPI）对法氏囊等组织进行了感染状态研究，组织冰冻切片，HE染色观察,结 果显示在感染后期法氏囊和胸腺明显萎缩 , 脾脏明显肿大 , 切片观察法氏囊组织 滤泡严重萎缩 , 滤泡内淋巴细胞排列松散 , 滤泡间质增宽 , 肌细胞层弥漫性增生。同时利用半定量RT-PCF技术检测不同阶段法氏囊中 MDV勺gB和Meq基因的 mRN相对表达水平。结果显示 MDV-Me基因的mRNA

5、水平在7DPI、21DPI时明显 增高,21DPI时达到差异极显著；MDV-gB基因在4DPI和21DPI时显著性增高,而在 潜伏期7DPI和14DPI时则明显下降,这些数据显示MDV在感染鸡法氏囊中复制正 常, 也为后期的病毒感染宿主差异蛋白质组学研究提供了条件。3. 马立克氏病病毒感染后法氏囊组织的蛋白质组学研究采用2-DE技术,对RB1B感染的SPF鸡和对照组鸡的法氏囊在不同感染阶段 （4DPI、7DPI、14DPI和 21DPI）的组织样品进行了蛋白质组分离,利用PDQuest8.0.1软件对2-DE图谱进 行分析, 对其中的部分差异点进行质谱鉴定。结果平均每块胶能检测到 800-90

6、0 个蛋白点,四个阶段共有 77个差异蛋白点 , 利用统计分析方法筛选出差异极显著 且变化有规律的蛋白点 29个,其中表现为持续上调的有 13个, 持续下调的有 10 个,先期上调后期下调的 2 个,先期下调后期上调的 4个。对这些蛋白点进行切胶消化 ,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassociated laser dissociation / ionization time of flightmass spectrometry, MALDI-TOF-MS) 进行鉴定分析。共鉴定出 24个蛋白, 它们是载脂 蛋白AI(ApoAI)、白血病相关蛋白18(LAP18)、癌蛋白18

7、(Op18)、Ras相关蛋白 RabllA两种热休克蛋白27(HSP27)、BUB同系蛋白、含硫氧还蛋白域5(TXNDC5) 伴侣素蛋白(CCT)、B 2-微球蛋白(BMG)热休克蛋白40(HSP40)、磷酸甘露糖变 位酶蛋白、慢骨骼肌肌钙蛋白T、蛋白质二硫化物异构酶 A3前体、dUTP焦磷酸 酶蛋白、D样不均一核核糖核蛋白、醛缩酶 C蛋白、胰蛋白、LOC129607类似蛋 白、含错配修复酶假定蛋白、含 GTPasd假定蛋白、两种含GATase1样结构域假 定蛋白。另外, 还发现了两个数据库中没有的禽源蛋白 , 这有待于更进一步的研究。 通 过数据库查询和生物信息学分析 ,证实这些已知的差异蛋

8、白与新陈代谢相关的占 19%,与蛋白质折叠相关的占 15%,与细胞增殖和调亡相关的占 15%,与信号转导相 关的占 22%,与免疫相关的占 15%,与细胞骨架结构相关蛋白的占 7%,其它占 7%。在此基础上结合现有的文献报道 , 对这些差异蛋白质的功能、与病毒感染发 病关系以及肿瘤相关方面进行分析讨论。 提出 ApoAI 持续的过量表达可能与 MDV 病毒粒子跨膜感染机制有关 ,同时以 ApoAI 过表达为主导的脂类代谢紊乱可能是 最终导致MDV感染易引起动脉粥样硬化的主要原因；LAP18和Op18的波动性调节 可能与MDV引起的肿瘤形成早期有关;RB1B诱导的HSP27S白过量表达可能有利

9、于其子代病毒大量产生；持续上调表达的Rab11A蛋白可能与MDNffl胞内转运，囊 泡出芽,逃避免疫或复制机制有关,Rab11A也有望成为抗单纯疱疹病毒分子治疗 的作用靶点；BMG的下调表达可能与MDV引起的免疫抑制有关；与肿瘤形成有关的BUB测系物蛋白和TXNDC蛋白在RB1B感染后的四个阶段均表现为持续上调表 达,后期差异极显著可能预示着MDV感染的肿瘤形成。本研究首次报道了在MDV感染下的宿主法氏囊组织中一些重要蛋白的差异 变化，为更深入研究MD致病机制和病毒性致肿瘤机制提供了可靠数据，同时也 为把MDV感染鸡作为肿瘤模型动物奠定了基础。4.感染MDV后法氏囊中ApoAlOp18的mRN

10、变化和ApoAI蛋白变化研究通过对RB1B感染鸡不同阶段的法氏囊 组织中的差异蛋白的检测 , 发现 Apolipoprotein A1(ApoAI) 呈现持续性过量表达 而 Oncoprotein 18(Op18) 的蛋白表达水平呈现波动性变化。本研究通过半定量RT-PCR勺方法,对RB1B感染后不同时间点的实验组与对 照组法氏囊组织中ApoAI和0p18的mRN水平进行检测,比较2-DE和质谱结果的 一致性；同时，将完整的ApoAI和0p18开放阅读框分别克隆进入pGEX6p1载体， 通过诱导表达手段分别获得了这两个带有 GST的融合蛋白,将融合蛋白 GST-ApoA通过电洗脱的方法回收后免疫 Balb/c小鼠制备多抗血清,再利用多抗 血清采用Western blot检测手段对2-DE和质谱结果进行蛋白表达水平上的验证。 结果显示不同阶段ApoAI和Op18的mRNAK平变化与2-DE和质谱分析的结果基 本一致,通过原核表达成功获得了这两种含有 GST的融合蛋白,其中GST