生物分离-预处理

1、生物分离的前处理生物分离的前处理 发酵液的预处理发酵液的预处理 E. coli 生化分离工程生化分离工程 2.发酵液的预处理 2.1 发酵液的特性和预处理的目的发酵液的特性和预处理的目的 2.2 预处理预处理加热加热 2.3 预处理预处理调节调节pH值值 2.4 预处理预处理加入助滤剂加入助滤剂 2.5 预处理预处理加入反应剂加入反应剂 2.6 预处理预处理凝聚凝聚 2.7 预处理预处理絮凝絮凝 2.1 发酵液的特性和预处理的目的 无论产物在胞内还是在胞外或是菌体本身， 都首先需要进行发酵液的预处理和固液分离， 以使产品可以从澄清的发酵液中提取，或是从 收集的固体（菌体）进行破碎、提取分离胞内

2、 的产物。 intracellularintracellular：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质 等等 extracellularextracellular：抗生素（青霉素、红霉素）、有机酸（柠檬酸、：抗生素（青霉素、红霉素）、有机酸（柠檬酸、 乳酸）、胞外酶（乳酸）、胞外酶（-淀粉酶）等淀粉酶）等 微生物发酵液的特性：微生物发酵液的特性： 发酵产物浓度较低发酵产物浓度较低，大多为，大多为1 11010 ，有的甚至更低，悬浮液，有的甚至更低，悬浮液中大部中大部 分是水分是水； 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相悬浮物颗粒小，相对密度与液相相 差不大差

3、不大； 固体粒子固体粒子可压缩性大可压缩性大； 经常经常含有一些粘性物质含有一些粘性物质，如蛋白质、，如蛋白质、 核酸和多糖等，液相粘度大，大多核酸和多糖等，液相粘度大，大多 为非牛顿型流体；为非牛顿型流体； 性质不稳定且随时间变化性质不稳定且随时间变化，如易受，如易受 微生物污染、空气氧化、蛋白酶水微生物污染、空气氧化、蛋白酶水 解等作用的影响。解等作用的影响。 1.1. 这些性质使得发酵液的过这些性质使得发酵液的过 滤与分离相当困难滤与分离相当困难! 工业生物技术中典型固相的形态（非标尺） 尺寸增加尺寸增加 回收费用增加回收费用增加 表表 工业生物技术中典型的固体粒子工业生物技术中典型的固

4、体粒子 固体离子的固体离子的 类型类型 尺寸尺寸 （mm） 细胞碎片细胞碎片Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+。 从上面的理论可以看出，胶体结构中的双电层受 压缩变薄时，会降低电位，当电位降低到相当小时， 颗粒就会因互相吸引而产生疏松的絮凝体。电解质可 以中和颗粒表面的电荷而压缩胶体中的双电层。但如 果双电层的压缩不能大量地减少胶体颗粒表面的电荷， 因此产生的疏松的絮凝体容易在物理因素的作用下重 新分散。 2.6.32.6.3常用的凝聚剂常用的凝聚剂 常用的凝聚剂见表3，可以看到，常用的凝聚 剂主要都是一些无机盐电解质。 分分 类类物物 质质 无机盐无机盐Al2(SO4)3，AlCl

5、3, Fe2(SO4)3, FeCl3, FeSO4, NaAlO2, CaCl2, ZnCl2, Na2CO3, 酸酸H2SO4, HCl, H2CO3. 碱碱NaOH, Ca(OH)2, Na2CO3 ,Al(OH)3, Fe(OH)3 固体粉末固体粉末 高岭土、皂土、酸性白土、碳黑、烟灰、明矾、聚合氯化高岭土、皂土、酸性白土、碳黑、烟灰、明矾、聚合氯化 铝、活性硅胶等。铝、活性硅胶等。 其他其他活性硅酸活性硅酸 表表3 常用凝聚剂种类常用凝聚剂种类 2.7 2.7 絮凝絮凝 2.7.12.7.1絮凝过程的机理絮凝过程的机理 絮凝技术和凝聚一样，都能有效地改变细胞、菌体和 蛋白质等胶体分子

6、的分散状态，使其聚集起来，颗粒体积 增大，以便于过滤，常用于菌体细小而且粘度较大的发酵 液的预处理中。除此之外，还能有效除去杂蛋白质和固体 杂质，提高滤液质量，对产品起到初步纯化作用。但二者 的作用机理却有不同，絮凝和凝聚的概念应加以区分。 凝聚是指胶体及悬浮物颗粒表面电荷被中和，静电排 斥力消失，颗粒脱稳而形成细小的凝聚体的过程。而絮凝 是指在某些高分子絮凝剂的存在下，基于架桥作用，使胶 粒形成较大絮团的过程。是一种以物理的集合为主的过程。 絮凝作用的过程首先包含着凝聚的作用，因此现在多数人 都认为絮凝作用的机理是凝聚和絮凝两种作用的结果。可 以认为凝聚作用是颗粒由小到大的量变过程，而絮凝作

7、用 是若干个凝聚作用的结果，当颗粒聚集到一定程度时，便 会从溶液中沉降而分离出来。 近年来，发展了不少种类的有机高分子聚合物絮 凝剂，它们具有长链线状的结构，是一种水溶性的聚 合物，分子量可高达数万至一千万以上，在长的链节 上含有相当多的活性功能团，可以带有多价电荷（如 阴离子或阳离子），也可以不带电性（如非离子型）。 它们通过静电引力、范德华力或氢键的作用，强烈地 吸附在胶粒的表面，一个高分子聚合物的许多链节分 别吸附在不同胶粒的表面上，产生了架桥联接，生成 粗大的絮团，这就是絮凝作用。高分子絮凝剂的混和、 吸附和絮凝作用见示意图3。 凝絮过程中的架桥作用是指溶液中胶体和悬浮物 颗粒通过有机

8、或无机高分子絮凝利吸附，形成架桥式 空间结构的絮凝体而沉淀下来的现象。有时候也可能 是两个同性电荷的胶体颗粒与两个带异电性的小颗粒 连结在一起。 图3 高分子絮凝剂的混合、吸附和絮凝作用示意图 （a）聚合物分子在液相中分散、均匀分布在粒子之间； （b）聚合物分子链在粒子表面的吸附； （c）被吸附链的重排，高分子链包围在胶粒表面，产生保护作用，是架桥作用的平衡构象 （d）脱稳粒子互相碰撞，形成架桥絮凝作用； （e）絮团的打碎 对于带负电性菌体或蛋白质来说，阳离子型高分 子絮凝剂同时具有降低粒子排斥电位和产生吸附架桥 的双重机理，所以可以单独使用；对于非离子型和阴 离子型高分子絮凝剂，则主要通过分

9、子间引力和氢键 作用产生吸附架桥，它们常与无机电解质凝聚剂搭配 使用。首先加入无机电解质，使悬浮粒子间的相互排 斥能降低，脱稳而凝聚成微粒，然后，再加入絮凝剂。 无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造了 良好的条件，从而，提高了絮凝效果。这种包括凝聚 和紫凝机理的过程，常称为混凝。 表表4 凝聚与絮凝的差别凝聚与絮凝的差别 项目名称项目名称凝凝 聚聚絮絮 凝凝 作用机理作用机理电性中和作用为主电性中和作用为主吸附和架桥作用为主吸附和架桥作用为主 试剂类型试剂类型无机化合物为主无机化合物为主有机高分子聚合物为主有机高分子聚合物为主 分子量分子量小和中等分子量小和中等分子量数万至数千万数万至

10、数千万 絮团强度絮团强度较紧密较紧密较松散较松散 滤饼水分滤饼水分较低较低较高较高 聚集速度聚集速度较慢较慢较快较快 对对pH的反应的反应敏感敏感不敏感不敏感 试剂用量试剂用量较多，较多，10.1较少，较少，0.10.01 操作成本操作成本较低廉较低廉较高较高 对产品的影响对产品的影响试剂可能进入产品试剂可能进入产品基本无影响基本无影响 2.7.2 2.7.2 常用的絮凝剂常用的絮凝剂 目前最常见的高分子聚合物絮凝剂是有机合成的 聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）类衍生物，根据活性 基团在水中解离情况不同，可分为非离子型、阴离子 型（含有羧基）和阳离子型（含有胺基）三类。由于 聚丙烯酸

11、胺类絮凝剂具有用量少，一般以ppm计量； 絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等 优点，所以适用范围广。它们的主要缺点是存在一定 的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，因此，当用于 食品及医药工业时，应谨慎使用，要考虑这些物质最 终能否从产品中去除。近年来还发展了聚丙烯酸类阴 离子絮凝剂，它们无毒，可用于食品和医药工业中。 另外。还有聚苯乙烯类衍生物及无机高分子聚合物絮 凝剂，如聚会铝盐和聚合铁盐等。除此以外，也可采 用天然有机高分子絮凝剂。如多聚糖类胶粘物，海藻 酸钠，明胶、骨胶和壳聚糖等。 表表5工业上常用的絮凝剂举例工业上常用的絮凝剂举例 分分 类类举举 例例 天然的高分子絮凝剂天然

12、的高分子絮凝剂海藻酸钠、壳聚糖、多聚糖类；明胶、干乳酪、海藻酸钠、壳聚糖、多聚糖类；明胶、干乳酪、 骨胶等骨胶等 合成的高分子絮合成的高分子絮 凝剂凝剂 阴离子型阴离子型聚丙烯酸钠、聚乙烯苯磺酸钠等聚丙烯酸钠、聚乙烯苯磺酸钠等 阳离子型阳离子型聚二甲基胺基甲基丙烯酸酯、聚二丙烯二甲基聚二甲基胺基甲基丙烯酸酯、聚二丙烯二甲基 氯化胺、聚二甲基胺甲基丙烯酰胺、聚乙胺等氯化胺、聚二甲基胺甲基丙烯酰胺、聚乙胺等 非离子型非离子型聚丙烯酰胺、聚氧乙烯、聚乙烯吡咯烷酮等聚丙烯酰胺、聚氧乙烯、聚乙烯吡咯烷酮等 两性型两性型改性聚丙烯酰胺等改性聚丙烯酰胺等 壳聚糖 2.7.32.7.3影响絮凝分离的因素影响絮

13、凝分离的因素 絮凝作用是复杂的物理化学过程，影响絮 凝作用（过程）的因素也是复杂和多方面的， 如：分子量和类型，絮凝剂的加入量、溶液的 pH，搅拌转速和时间等。同时，在絮凝过程中， 常需加入一定的助凝剂以增强絮凝效果。 1 1、pHpH对絮凝作用的影响对絮凝作用的影响 溶液pH值对絮凝作用的影响是非常大的，pH值 的变化常会影响离子型絮凝剂中功能团的电离度， 从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，由于链 节上相邻离子基团间的静电排斥作用，而使分子链 从卷曲状态变为伸展状态，所以架桥能力提高。 因此，pH值通过对胶体颗粒表面的带电性（ 电位）、絮凝剂的性质的改变对絮凝的作用产生很 大的影响。一般

14、情况下，阳离子型的絮凝剂适合在 酸性和中性的pH值环境中使用；而阴离子型絮凝剂 适合在中性和碱性的环境中使用。聚季铵盐的阳离 子有机高分子絮凝剂也适合在碱性的介质中使用。 非离子型絮凝剂适合于从强酸性到碱性的环境中使 用。 2 2、温度对絮凝作用的影响、温度对絮凝作用的影响 温度过高或过低都对絮凝不利，一般絮凝作 用最适合的温度在2030之间。水温过高时， 化学反应速度过快，形成的絮凝体细小，并使 絮凝体的水合作用增加，同时能量的消耗也增 大。水温过低，有些絮凝剂的水解反应变慢， 水解时间过长，效率降低；同时温度低，水的 粘度变大，也会增加水对絮凝体的撕裂作用， 使絮凝体变得细小，不易分离。

15、3 3、搅拌速度和时间对絮凝作用的影响、搅拌速度和时间对絮凝作用的影响 搅拌的速度和时间对发酵液絮凝的影响很大，条件 选择得恰当，可以加速絮凝作用，有利于絮凝剂发挥作 用，提高絮凝效果。 几点结论： （1）絮凝初期，颗粒聚并快，此时搅拌应强一些，絮 凝后期，颗粒聚并速度变慢，搅拌应降低。 （2）增加颗粒浓度，有利于聚并絮凝。 （3）加大搅拌，增加速度梯度有利于颗粒聚并，但太 大时，剪切力会导致絮凝体破裂。 一般来说，搅拌转速以4080r/min为宜，不要超 过100r/min；搅拌时间以24min为宜，不超过5min。 速度过快，时间过长，会将大颗粒的固体搅碎变成小颗 粒而不能沉淀；搅拌速度过

16、慢，时间过短，絮凝剂和胶 体颗粒不能充分接触，不利于絮凝剂捕集胶体颗粒，从 而难以发挥絮凝作用。 谭天伟，沈忠耀.细胞絮凝技术及在生物产品分离中的应用. 生物工程进展，15(5), 5356 (1995) 4 4、高分子絮凝剂的性质和结构对絮凝作用的影响、高分子絮凝剂的性质和结构对絮凝作用的影响 线型结构的有机高分子絮凝剂，絮凝作用较 好。而环状或支链结构的有机高分子絮凝剂的 絮凝效果较差。有机高分子絮凝剂的一些官能 团如COONa、R3NRCl、CONH2、SO3Na等 过多时，电荷密度过高，絮凝作用差；官能团 较少时，有利于絮凝作用，但过少对电荷的中 和作用不利而影响到絮凝作用。 5 5、

17、高分子絮凝剂的相对分子量对絮凝作用的影响、高分子絮凝剂的相对分子量对絮凝作用的影响 高分子絮凝剂分子量增大，链增长，可使架 桥效果更明显，所以通常情况下，絮凝剂的相 对分子量越大，絮凝作用越好。絮凝剂的相对 分子量不要小于30000，最好在250000以上。但 是，分子量也不能超过一定的限度，因为随分 子量提高，高分子絮凝剂的水溶性降低，因此 分子量的选择也应适当。 6 6、絮凝剂的用量对絮凝作用的影响、絮凝剂的用量对絮凝作用的影响 一般情况下，料液中的絮凝剂浓度增加有助于 架桥充分，絮凝作用的效果随着絮凝剂用量的增 加而增大。絮凝剂的用量达到一定值时，絮凝作 用达到最佳效果，但再增加用量时，

18、絮凝效果反 而下降，因为絮凝剂过量时会使形成的絮凝体重 新变成稳定的胶体。絮凝剂的用量与溶液中悬浮 物的含量有关，所以最佳的絮凝剂用量应通过实 验来确定。 2.7.42.7.4絮凝技术的应用和发展动态絮凝技术的应用和发展动态 絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速度的提高， 还在于能有效地去除杂蛋白质和固体杂质，如菌体、细胞 和细胞碎片等，提高了滤液质量，在生物产品分离中的应 用越来越广泛。 Person等曾报导在-半乳糖苷酶（胞内酶）发酵液中 采用絮凝技术除去细胞碎片的方法，利用壳聚糖 （chitosan）和聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine）阳离子 絮凝剂以及氯化钙无机电解质，分别在细胞破碎前后处理 发酵液，有机絮凝剂在破碎前预先加入，其加量为 640ppm， 氯化钙在破碎后加入，加量为 40 mmol，并调节一定的 pH， 这样可将细微的细胞碎片粒子聚集起来。絮凝处理的结果 不仅大大改善了离心分离后滤液的澄清度，使细胞碎片的 去除率提高了十倍以上，而且凝固了部分可溶性杂蛋白质， 滤液总蛋白的含量