高效液相色谱[稻谷文苑]

1、第二十一章第二十一章第二十一章 高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱 1. 概述概述 2. 基本原理基本原理 3. 各类各类HPLC法法 4. 固定相固定相 5. 流动相流动相 6. 仪器仪器 7. 定性、定量分析定性、定量分析 1优质荟萃 第一节第一节第一节 概述概述概述 优 缺 经典LC 适用范围广 效率低 GC 高效、高速， 300多万化合物中 高灵敏度、自动化 仅20%能用GC HPLC：由经典液相色谱HPLC有三个突破 1、高效填料高效填料：5m 10m 高效 （经典LC75-590m） 2、高压泵输液高压泵输液： 高压 3、高灵敏度的检测器高灵敏度的检测器： 仪器化 2优质荟萃 3

2、优质荟萃 HPLC特点特点： 1、适用范围广 2、高效 3、高速 4、高灵敏度（主要用UV 510-10g/ml） 5、流动相选择范围宽 6、柱可以反复使用（可用1-2年） 7、流动组分易收集 8、安全 4优质荟萃 第二节第二节第二节 基本原理基本原理基本原理 一、范氏方程：一、范氏方程： 1、柱内展宽、柱内展宽： H=A+B/+C (A涡流扩散 B纵向扩散 C传 质阻抗) 在前述气相GC中B=2rDm中Dm比HPLC中大105倍 在HPLC中第二项可忽略，故高效液相色谱的范氏方程 为： H = A + CH = A + C 5优质荟萃 H=A+C 涡流扩散项：A=2dp（-不规则因子 dp填

3、充物直径） 传质阻抗项引起板高：C=Cm+Csm+Cs 由于目前大都使用数学键合相，以Cs可忽略。 a、引起部分：Hs= 忽略 Cs常数与颗粒内空隙体积分数及容量因子有关。 dp填料直径 Ds组分在固定相中扩散系数。 固定相的粒度dp对物质抗项也有影响 u D dpC s s 21 6优质荟萃 b、由流动相引起部分：Hm= , Hsm= , （Hsm静态流动相物质阻抗项） Cm流动相的物质阻抗系数，与填充物质结构有关 HPLC的范氏方程： H=A+cu=2dp+（ ）u Cs Csm (1) dp，H，n (2) Dm，流动相粘度增大，H，n (3) 要使，H填充要均匀。 u D dpC m

4、m 22 u D dp C m m 2 1 m sm s s D dpC D dpC 2121 7优质荟萃 2、柱外展宽：、柱外展宽： 进样器联结管边等死体积越小越好。 HPLC 2-6mm 10-30cm 死体积约1ml 记：由H=A+C，在HPLC中可近似认为板高 与速成正比（直线关系），H，n， 为了兼顾柱效和分析速度，一般采用较低流 速，多用1ml/min流量。 8优质荟萃 二、分离度及影响因素：二、分离度及影响因素： 又可： 讨论如何由n、k 来改变R 1、 K， R ， k最适宜范围1k5 2/ 21 12 WW tt R RR 2 2 1 1 4k kn R 9优质荟萃 2 2、

5、改变、改变变峰间距变峰间距 ，R在GC主要通过改变固定相（载量一 定），而在HPLC中，主要通过改变流动相。 3 3、改变、改变n n、nn a、减小题粒直径dp b、提高装柱技术（均匀） c、流动相（低粘度流动相可以增大Dm） （Dm 组分在流动相速扩散） d、线速度u（减小传质阻抗引起H） e、增加柱长L（但太长，柱压大，寿命短） 10优质荟萃 第三节第三节第三节 各类各类各类HPLCHPLCHPLC法法法 近年来新的HPLC法应运而生 我们仅讲其中部分内容： HPLC 高效液相 LSC 液固 LLC 液液 IEC 离子交换 SEC 空间排阻 AC 亲和色谱 CE 毛细管电泳 BPC 化学

6、键合相 NPBC 正 RBPC 反 PIC 离子对 ISC 离子抑制 11优质荟萃 一、液一、液- -固吸附色谱：固吸附色谱：LSCLSC 1、机理机理：同前章，即组分分子与流动相分子争夺吸附剂 表面的活性中心的能力不同而分离。通过Ka不同来达到目的 的。在吸附色谱中，常用容量因子来讨论问题。 2 2、影响、影响k k的因素的因素： 当柱与柱温（一般是室温）选定时，k与溶质与溶剂的性 质有关。以硅胶吸附剂为例。 与硅胶亲和力大的溶质k大，tR大 控制溶剂的极性，可调整tR(常用多元体系流动相)溶剂 的极性愈大，洗脱力愈强，k .tR) 12优质荟萃 二、液二、液- -液分配色谱：液分配色谱：L

7、LCLLC 分离机理同前几章：LLC 与液相色谱同样有正相色谱与反相色谱之分。 (一一). 正、反色谱正、反色谱 正相 反相 固定相极性 大 小 流动相极性 小 大 流动顺序 极性小的组分先流出 极性大的组分先流出 13优质荟萃 反相主要用于分离非极性及中等极性各类分子型化合物。 正相色谱正相色谱:固定相：氰基与氨基化学键合相 流动相：与以硅胶为固定相的吸附色谱选法一致。 反相色谱反相色谱: :固定相如：十八烷基键合相（ODS；orC18表示） 流动相：甲醇-水or乙腈-水 pH2-8 反相色谱是应用最广的色谱法，主要用于分离非极性至 中等极性的各类分子型化合物。 14优质荟萃 三、反相离子对

8、色谱：（三、反相离子对色谱：（RPICRPIC） 把离子对试剂加入极性流动相中，被分析的离子在流动 相中与离子对试剂（反离子）生成不带电荷的中性离子时， 从而增加在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增大，而 改变分离效果。 由上分离原理可以看出，反离子对色谱并不难实现，只 是在前边所讲的反相色谱的流动相中，加进离子对试剂，调 节适当的pH即可进行实验。 15优质荟萃 1、常用离子对试剂：、常用离子对试剂： 分析样品 离子对试剂 例 碱 烷基磺酸钠 C5、C6、C7、C8磺酸钠 酸四丁基季铵盐 四丁基胺磷酸盐（TBA） 2、机理、机理： 流动相 固定相 B+H+ BH+ + RSO3Na RSO

9、-3+Na+ BH+.RSO-3 BH+.RSO-3 中性离子对 增加了在非极性固定相中溶解度。 16优质荟萃 3、分配系数、分配系数：其流出顺序与反相液相色谱一致。 分离碱（RNH2），流动相pH33.5 K= 分离酸（RCOOH） pH7.5 K= 注注：凡在反相色谱中影响K的因素，此处同样。 离子对试剂C链，K，k。 此离子对色谱在药物分析中对有机酸、生物碱及抗生素 应用较广。但有试剂价格贵，且流动相因有一定pH，对泵和 流路有腐蚀。 m s PICBRNH PICBRNH 3 3 m s PICAIRCOO PICARCOO 17优质荟萃 四、离子抑制色谱四、离子抑制色谱ISCISC

10、在前边所述的反相色谱法中，调节流动相的pH，抑制组分 离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸， 弱碱的目的。 1 1、适用范围、适用范围：3.0Pka7.0 的弱酸 7.0Pka8.0 的弱碱 而pKa8的碱应用离子对色谱。 PKa8 pKbpH-pKa 2 2、抑制剂、抑制剂 弱酸（HAc）、弱碱（NH3H2O）或缓冲液 18优质荟萃 3 3、k k及其影响因素：及其影响因素： (1)凡在反向色谱中的影响因素，此处同样影响。 (2)pH的影响 弱酸：pHpKa时，k,tR(以离子形式为主，流动相中多) 弱碱与上恰相反。pHpKb tR 总之，pH应在28，超出将会腐蚀仪器，流路系

11、统。 19优质荟萃 4、用途：、用途： （1）有机弱酸或弱碱与两性化合物的 分离。 （2）有机弱酸或弱碱与分子型化合物 的分离。 注意：对于pKa8的碱不 能用此色谱。 20优质荟萃 第四节第四节第四节 固定相固定相固定相 一、一、L LS S色谱色谱 1.硅胶：硅胶： （1）表孔硅胶：（薄壳玻球YBK） 特点：易装柱，但柱效不高，柱容量小（10005000） （2）无定形全多孔硅胶：YWG、510m 特点：柱效高，柱容量大，但要匀浆装柱。价格便宜 （80000100000） （3）球形全多孔硅胶：YQG 310m 特点：除具有YWG的优点外，还具涡流扩散项小及渗透 性好等特点。 （4）堆积硅

12、珠：SiO2溶胶+凝胶剂聚结而成。35m 特点：传质阻抗小，柱容量大（80000） 21优质荟萃 特点 表孔硅胶(YBK) 易装柱，柱效不高，柱容量小 （10005000） 无定形全多孔硅胶（YWG） 柱效高，柱容量大，价廉，但 硅胶 要匀浆8000-100000） 球形全多孔硅胶（YQG） 具YWG的优，具涡流扩散小， 渗透性好 堆积硅珠 传质阻抗小，柱容量大 （800000） 22优质荟萃 2 2、高分子多孔小球、高分子多孔小球：YSG （柱效低103） 又称有机胶：苯乙烯与二乙烯苯交联而成。 用途：分离芳烃、杂环、甾体、生物碱 二、二、L LL L色谱固定相：载体色谱固定相：载体+ +固

13、定液固定液 （一）机械涂渍（现高效中基本淘汰）（一）机械涂渍（现高效中基本淘汰） （二）化学键合相：（二）化学键合相： 采用化学反应的方法将固定液结合在担体上。具 有吸附与分配双重作用。 优点：不流失，稳定（pH28液中不变质），热 稳定性好，且能用于梯度洗脱。 23优质荟萃 非极性键合相：键合非极性基团：ODS（十八烷基） 化学键合相 中等极性键合相：醚基键合相（正反应用流动相极性反应） 极性键合相：键合极性基团（氨基、氯基） 1、非极性键合相、非极性键合相：键合相表面基团为非极性基团。 常用：ODS键合相（十八烷基键合相） 载体：全多孔YWG，YQG、堆积硅球，作为ODS键合 相与载体。

14、国产如：YWG-C18（5，10m）， YWG-C6（5，10m） 表面覆盖度： 参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例为 表面覆盖度。其覆盖度的大小，决定键合相是分配还是吸附 占主导作用。 键合基团键长：，载样量，k 24优质荟萃 2 2、中等极性键合相、中等极性键合相：醚基键合相（正、反色谱由流动相 极性而定） 3 3、极性键合相、极性键合相：键合极性基团（氨基、氰基） 国产品：YWG-NH2，YWG-CN（5，10m） ( (三三) )离子交换剂离子交换剂 经典液相色谱的交换树脂，不耐压，不适用，此处 用离子键合相。 载体：薄壳型或全多孔微粒硅胶。 离子交换基团：-SO3H，-N

15、R3Cl等 -SO3H强酸型 -NR3Cl强碱型 25优质荟萃 注意：在pH08的流动相时使用，且要控制一定 的离子强度。当色谱条件一定时，柱交换容量大， 保留时间长。 当色谱条件一定时，柱交换容量大，保留时间 长。 （四）凝胶：（空间排斥色谱）（四）凝胶：（空间排斥色谱） 具有一定孔径的多孔性凝胶。 26优质荟萃 27优质荟萃 第五节第五节第五节 流动相流动相流动相 在HPLC中，溶剂不同，与分子间作用力不同，有可能使 组分的R不同，改变溶剂的极性，对组分的洗脱能力改变，tR 改变，实验时可适当配比，以至得到较适宜的R。 对流动相的要求： 1、不与固定相反应不与固定相反应 2、对样品的溶解度

16、适当、对样品的溶解度适当（控制R25） 3、与检测器匹配与检测器匹配 4、粘度小、粘度小 优化及选择自学（不要求）。 ) 1 )( 1 ( 4 2 2 k k R 28优质荟萃 第六节第六节第六节 仪器仪器仪器 输液泵进样器色谱柱检测器记录 一、输液泵：一、输液泵： 往复泵往复泵 29优质荟萃 二、色谱柱与进样器二、色谱柱与进样器： 1 1、进样器：、进样器：早期用隔膜进样阀，带压进样，操作困难， 进样器易反弹出而损坏。 六通阀： 优势：进 样量准确， 重现性好， 可带压进样。 30优质荟萃 2.色谱柱：色谱柱： 由柱管和固定相组成。 柱管柱管：不锈钢管 2-5mm L1030cm 常量柱 1

17、1.5mm L1020cm 常微量柱 装柱装柱是一项技巧性很强的技术，它直接影响柱效。当填 料20m，较易装，干法，轻叩。粒度20m，匀浆装柱。 （先将填料用等密度的有机溶剂匀浆，再高压装柱。无论装 柱还是买柱，要进行柱效检查。测度条件根据柱类型不同而 选用不同的检测。 测出各组分的W，tR，求出n和R1.5 31优质荟萃 UV 70% 三、检测器三、检测器 荧光 多用 15% 示差分析 电化学 蒸发光散射检测器 （一）紫外检测器（一）紫外检测器： 优：灵敏度高，精密度、线性范围好，可用于梯度洗脱。 缺：样品组分应吸收紫外光 要考虑溶剂的极限波长 32优质荟萃 1、固定波长型：、固定波长型：

18、光源：254nm低压汞灯，此类检测器光源强度大，灵敏 度高，检测限可达110-9g/ml，是一种简便实用的检测器。 2、可变波长检测器、可变波长检测器 可选择max（类似于可见紫外分光光度计），将波 长调在最大的max处进行检测，以增加灵敏度。（有些 配置较好的还可同时扫出紫外光谱），现多数HPLC配这种 检测器。 33优质荟萃 3、光电二极管陈列检测器：、光电二极管陈列检测器： 通过吸收池的光经光栅分光200-699nm，分光的光进入 由500个单元组成的光电二极管陈列上。可同时测每隔1nm 的光线，因此UV（200380nm）及VIS（381699nm）的谱 线瞬间（约60msec）就可测

19、出。信号经处理后记录仪打出 三维空间图，或是平均吸光度色谱图。 优：可鉴别重叠峰，确认峰纯度，比较各峰化学结构， 并可从几个通道同时进行峰面积计算，提供最佳定量标准。 34优质荟萃 35优质荟萃 （二）其它检测器（二）其它检测器 1、荧光检测器：、荧光检测器： 样品应有荧光，灵敏度比紫外更高。检测限110-10g/ml 2、示差检测器：示差检测器： 利用组分与流动相的折射率之差，类似气相热导、利用 组分与载气热导率不同，进行检测。 缺：对多数物质检测限较低。环境、温度对其均有影响。 3、电化学检测器：、电化学检测器： 利用组分氧化还原反应，产生电流或电压变化进行检测。 对还原性物质检测限110

20、-12g/ml。缺：不能测不能氧化还原 的物质。 36优质荟萃 第七节第七节第七节 定性、定量分析定性、定量分析定性、定量分析 一、定性分析：一、定性分析： 1、tR:12 相对保留值相对保留值= 2、化学鉴定、化学鉴定：对HPLC流出组分收集，用专属性化学反 应对收集的分离物质组分进行定性。 3、联机技术、联机技术： HPLCMS、 HPLCFTIR 质谱 富利叶转换红外光谱 2 1 2 1 K K t t R R 37优质荟萃 二、定量分析：与气相色谱同。二、定量分析：与气相色谱同。 1、外标法：、外标法： 以试样的标准品作对照物质，相对比较求含量。 （1）工作曲线法：用待测组分的标准品配制一系列浓度 不同的标准溶液(Ci)s，准确进样，测量峰面积(Ai)s或峰高(hi)s， 与(Ci)s绘制工作曲线