10动物染色体工程hxy

1、 真核细胞染色体的组成真核细胞染色体的组成 组蛋白：组蛋白：H1、H2A、H2B、 H3、H4； 非组蛋白：非组蛋白：HMG、DNA结合结合 蛋白蛋白 DNA：不重复序列；中度重复不重复序列；中度重复 序列；高度重复序列序列；高度重复序列 少量的少量的RNA； 从DNA到染色体的包装压缩 DNA链链 核小体核小体 螺线管螺线管 染色单体染色单体 超螺旋超螺旋 压缩比例：压缩比例：76405 = 8400 （1：7） （1：6） （1：40） （1：5） Gene Expression 染色体组染色体组 染色体组染色体组 染色体组型染色体组型 染色体倍性染色体倍性 体细胞中的一组非同源染色体，它

2、们在形态和功能上各不相同，但是，携带着控体细胞中的一组非同源染色体，它们在形态和功能上各不相同，但是，携带着控 制一种生物生长发育、遗传和变异的全部信息，这样的一组染色体，叫做一个制一种生物生长发育、遗传和变异的全部信息，这样的一组染色体，叫做一个 染色体组染色体组。 染色体组型染色体组型是指一个体细胞中全部染色体的数目、大小和形态特征。是指一个体细胞中全部染色体的数目、大小和形态特征。 染色体倍性染色体倍性是指细胞中包含的染色体组数或基数。是指细胞中包含的染色体组数或基数。 Human mitotic chromosomes and karyotype 染色体组用符号染色体组用符号“X”表示

3、表示 生物体的体细胞染色体数用生物体的体细胞染色体数用2n表示，无论是二倍表示，无论是二倍 体还是多倍体，体还是多倍体，2n只表示体细胞的染色体数，并不只表示体细胞的染色体数，并不 表示其倍性，如：表示其倍性，如： 玉米体细胞染色体数玉米体细胞染色体数2n=20， 普通小麦体细胞染色体数普通小麦体细胞染色体数2n=42， 要正确表示倍性应写成：要正确表示倍性应写成： 玉米玉米2n=2X=20， 普通小麦普通小麦2n=6X=42。 符号符号“n”和和“X”的区别与联系的区别与联系 9 生殖细胞的减数分裂生殖细胞的减数分裂 骡骡 子子 母马和公驴的后代母马和公驴的后代 10 11 为什么骡子不能繁

4、殖后代？为什么骡子不能繁殖后代？ 马的染色体数是马的染色体数是64条，驴的染色体数是条，驴的染色体数是62 条，马的卵子染色体数是条，马的卵子染色体数是32条，驴的精子条，驴的精子 染色体数是染色体数是31条，通过精卵结合发育成的条，通过精卵结合发育成的 新个体新个体骡子的染色体数是骡子的染色体数是63条。条。 骡子的染色体联绘紊乱，因此骡子的生殖骡子的染色体联绘紊乱，因此骡子的生殖 细胞不能分化发育成完整的个体。细胞不能分化发育成完整的个体。 12 骡子生育的概率极低骡子生育的概率极低 骡子性成熟以后，再形成精子或卵子时，每条染骡子性成熟以后，再形成精子或卵子时，每条染 色体都没有相对应的同

5、源染色体进行配对，这样色体都没有相对应的同源染色体进行配对，这样 每一条染色体分到哪个配子里是随机的，在这些每一条染色体分到哪个配子里是随机的，在这些 配子中，只有配子里的染色体完全来自于马的，配子中，只有配子里的染色体完全来自于马的， 或来自于驴的，这样的配子才有生育能力。或来自于驴的，这样的配子才有生育能力。 13 狮虎兽（狮虎兽（liger） 雄狮和雌虎交配产生的后代。雄狮和雌虎交配产生的后代。 狮虎兽的体型比狮或虎都要狮虎兽的体型比狮或虎都要 大，又同时具备两者之间的大，又同时具备两者之间的 外貌特征；狮子与老虎相恋、外貌特征；狮子与老虎相恋、 怀孕的概率极低，即使在人怀孕的概率极低，

6、即使在人 工饲养的环境下，虎、狮受工饲养的环境下，虎、狮受 孕的机会也仅为孕的机会也仅为1至至2。 幼兽由于先天不足等原因，幼兽由于先天不足等原因， 成活率仅为五十万分之一左成活率仅为五十万分之一左 右。据资料显示，目前世界右。据资料显示，目前世界 上存活的狮虎兽只有上存活的狮虎兽只有20只左只左 右。右。 14 狮虎兽（狮虎兽（liger） 15 狮虎兽 狮 虎 虎狮兽 16 动物染色体工程动物染色体工程 p染色体倍性改造染色体倍性改造 p染色体结构改造染色体结构改造 p人工染色体的利用人工染色体的利用 17 10.1 10.1 动物染色体倍性改造动物染色体倍性改造 定义：指有目的、有计划地

7、增加或减少定义：指有目的、有计划地增加或减少 一组或几组同源或异源染色体，以创造一组或几组同源或异源染色体，以创造 动植物新品种的一项染色体工程技术。动植物新品种的一项染色体工程技术。 主要包括：主要包括： 多倍体育种多倍体育种 单倍体育种单倍体育种 18 动物的多倍体育种动物的多倍体育种 多倍体（多倍体（polyploidy）:是指体细胞中含有三个是指体细胞中含有三个 或三个以上染色体组的个体或三个以上染色体组的个体 多倍体产生机制：多倍体产生机制：通过卵细胞第二极体的保通过卵细胞第二极体的保 留或受精卵早期有丝分裂的抑制而实现留或受精卵早期有丝分裂的抑制而实现 19 动物的多倍体育种动物的

8、多倍体育种 1 1染色体加倍技术染色体加倍技术( (人工诱导人工诱导) ) （1 1）化学诱导法化学诱导法 秋水仙素秋水仙素 细胞松弛素细胞松弛素B B （2 2）物理学方法物理学方法 1 1）温度休克法）温度休克法 2 2）水静压法）水静压法 (3 (3）生物学方法生物学方法 20 1. 1.化学方法化学方法 A. A. 细胞松驰素细胞松驰素B(cytochalasin)B(cytochalasin)： 能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分抑制细胞质分 裂裂，使用最早、最广泛，其诱导效果也最突出。，使用最早、最广泛，其诱导效果也最突出。 B. B. 秋水仙

9、素秋水仙素(colchicine)(colchicine)：主要用于植物主要用于植物 阻止细胞分裂过程中的阻止细胞分裂过程中的纺缍体纺缍体的形成，可使染色的形成，可使染色 体正常复制而细胞不发生分裂，从而形成同源多体正常复制而细胞不发生分裂，从而形成同源多 倍体细胞。倍体细胞。 C. C. 其他：其他： N N2 2O O 特点：特点：化学药物价格昂贵，有毒性化学药物价格昂贵，有毒性 2.2.物理学方法物理学方法 温度休克法温度休克法 原理：原理：引起细胞内酶构型的变化，不利于酶促反应的进行，引起细胞内酶构型的变化，不利于酶促反应的进行， 导致细胞分裂时形成纺缍丝所需的导致细胞分裂时形成纺缍丝

10、所需的ATPATP供应受阻。抑制供应受阻。抑制 第二极体的释放，诱导三倍体或四倍体第二极体的释放，诱导三倍体或四倍体 方法：方法：冷休克法（冷休克法（0-50-5）和热休克法（）和热休克法（3030左右）左右） 特点：特点：操作简单，成本低廉，对胚胎发育影响小，有利于操作简单，成本低廉，对胚胎发育影响小，有利于 养殖场大规模生产使用养殖场大规模生产使用 适用：适用：冷水鱼类应用热休克法，温水性鱼类用冷休克效果冷水鱼类应用热休克法，温水性鱼类用冷休克效果 较好较好 关键：关键：成功阻止第二次成熟分裂和第二极体的排出成功阻止第二次成熟分裂和第二极体的排出 2. 2.物理学方法物理学方法 B B、水

11、静压法、水静压法 原理：原理：抑制第二极体的排出或第一次卵裂抑制第二极体的排出或第一次卵裂 方法：方法：65kg/cm65kg/cm2 2 特点：特点：诱导率高（诱导率高（9090以上），处理时间短，对受以上），处理时间短，对受 精卵损伤小，成活率高。精卵损伤小，成活率高。 需要专门的设备需要专门的设备水压机，成本较高，不水压机，成本较高，不 适于大规模生产。适于大规模生产。 3. 3. 生物学方法生物学方法 动物通过杂交方法动物通过杂交方法 尤其是种间杂交获尤其是种间杂交获 得异源多倍体。得异源多倍体。种种 间杂交导致第二极间杂交导致第二极 体不排出。体不排出。 草鱼草鱼 三角鲂三角鲂 (2

12、n=48) ( 2n =48)(2n=48) ( 2n =48) 草鲂杂种草鲂杂种 (3n=72)(3n=72) 人工诱导三倍体的方法人工诱导三倍体的方法 p直接途径，直接途径，即用物理或化学的方法对受精卵即用物理或化学的方法对受精卵 进行处理，阻碍第二极体外排。（即前述的进行处理，阻碍第二极体外排。（即前述的 物理法、化学法）物理法、化学法） p间接途径，间接途径，即首先诱导获得四倍体，待四倍即首先诱导获得四倍体，待四倍 体个体性成熟后再与二倍体个体交配，从而体个体性成熟后再与二倍体个体交配，从而 获得三倍体子代。获得三倍体子代。 25 三倍体三倍体 植物植物 26 27 三倍体三倍体 动物

13、动物 2多倍体的倍性鉴定多倍体的倍性鉴定 （1）直接法）直接法 1）染色体计数：）染色体计数：是鉴定多倍体的一个准确的直接方法，是鉴定多倍体的一个准确的直接方法， 但比较费时。但比较费时。 2）DNA含量测定含量测定：细胞：细胞DNA含量测定是倍性鉴定的另含量测定是倍性鉴定的另 一个有效的直接方法。一个有效的直接方法。 （2）间接法）间接法 1）核体积测量）核体积测量 2）蛋白质电泳）蛋白质电泳 3）生化分析）生化分析 29 30 3动物多倍体育种的意义动物多倍体育种的意义 1 1）多数具有良好的生长率）多数具有良好的生长率 2 2）低等动物的种间杂交优势非常明显）低等动物的种间杂交优势非常明

14、显 3 3）巨大性）巨大性 4 4）育性低）育性低( (四倍体可育四倍体可育) ) 31 鱼类三倍体育种的意义鱼类三倍体育种的意义 p三倍体是非偶数染色体组，阻碍了生殖细胞正三倍体是非偶数染色体组，阻碍了生殖细胞正 常的减数分裂，结果导致性腺不能发育。不育常的减数分裂，结果导致性腺不能发育。不育 的三倍体经济鱼类因为没有性成熟阶段性腺发的三倍体经济鱼类因为没有性成熟阶段性腺发 育的能量损耗，所以有以下优点：育的能量损耗，所以有以下优点： 避免了性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降避免了性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降 并延长了上市时间并延长了上市时间 避免了性腺发育阶段的生长停滞和死亡率增加避

15、免了性腺发育阶段的生长停滞和死亡率增加 缩短了养殖周期，减少了养殖成本并可养成大缩短了养殖周期，减少了养殖成本并可养成大 型个体型个体 32 利用三倍体鱼类不育性的优点，利用三倍体鱼类不育性的优点， 人们可以达到这样的目的：人们可以达到这样的目的： 获得生长速度较快的三倍体品种，提高鱼获得生长速度较快的三倍体品种，提高鱼 类养殖的经济效益类养殖的经济效益 控制养殖鱼类的过度繁殖和防止对天然资控制养殖鱼类的过度繁殖和防止对天然资 源的干扰源的干扰 33 湘云鲫湘云鲫由湖南师由湖南师 范大学生命科学学范大学生命科学学 院刘筠院士培育院刘筠院士培育 34 35 Triploid Grass Carp

16、三倍体草鱼三倍体草鱼 36 动物的单倍体育种动物的单倍体育种 1人工单性生殖人工单性生殖 （1）雌核发育）雌核发育gynogenesis dindenisis （2）雄核发育）雄核发育androgenesis ndrdenisis 37 动物的单倍体育种动物的单倍体育种 1.1.雌核发育雌核发育：指精子虽然能正常地钻入卵子中并指精子虽然能正常地钻入卵子中并 激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育， 胚胎的发育仅在胚胎的发育仅在母体遗传物质母体遗传物质的控制下进行。的控制下进行。 方法：方法：经遗传失活的动物精子刺激而使卵子发育经遗传失活的动物精子

17、刺激而使卵子发育 为正常的为正常的二倍体二倍体动物。动物。 38 抑制第二极体外排 抑制第一次卵裂精子遗传物质失活 39 Haploid embryos are generated by mock-fertilizing eggs with UV-irradiated sperm (which cannot contribute genetically), and can survive a few days. Haploids can be rescued by suppressing formation of the polar body with pressure treatment s

18、hortly after fertilization. 40 朱朱 洗洗 细胞学家。浙江临海人。细胞学家。浙江临海人。19311931年获法国国家博士学年获法国国家博士学 位。中国科学院实验生物研究所所长。长期从事两位。中国科学院实验生物研究所所长。长期从事两 栖类、鱼类、家蚕等动物卵子成熟、受精等研究栖类、鱼类、家蚕等动物卵子成熟、受精等研究 。 19611961年使人工雌核发育的雌蟾蜍与雄蟾蜍交配，繁年使人工雌核发育的雌蟾蜍与雄蟾蜍交配，繁 殖出殖出没有外祖父的蟾蜍没有外祖父的蟾蜍，证明了单性生殖的高等动，证明了单性生殖的高等动 物仍保有传代的能力。物仍保有传代的能力。 41 雌核发育的意

19、义雌核发育的意义 雌核发育具有产生单性种群的能力雌核发育具有产生单性种群的能力 迅速地产生同源型二倍体克隆迅速地产生同源型二倍体克隆 可通过克隆自交，即以激素致使性逆转可通过克隆自交，即以激素致使性逆转 为雄性，再与同胞姐妹交配，获得强壮的为雄性，再与同胞姐妹交配，获得强壮的 纯系同型配子二倍体，然后借助于雌核发纯系同型配子二倍体，然后借助于雌核发 育，产生新的纯系来筛选除去有害的等位育，产生新的纯系来筛选除去有害的等位 基因，以改良近亲繁殖系基因，以改良近亲繁殖系 动物的单倍体育种动物的单倍体育种 2.2.雄核发育：雄核发育：用经过紫外线、用经过紫外线、X X线或线处理线或线处理 的卵子与正

20、常的精子受精，再在适当时间施的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施 以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内 的精子染色体加倍，而发育成完全为父本性的精子染色体加倍，而发育成完全为父本性 状的二倍体。状的二倍体。 定义：定义：遗传失活的卵子与精子结合，发育成遗传失活的卵子与精子结合，发育成 只有只有父本父本染色体个体的一种特殊生殖方式。染色体个体的一种特殊生殖方式。 43 人工诱导雌核发育的方法人工诱导雌核发育的方法 （1）精子遗传物质的失活）精子遗传物质的失活 辐射处理（辐射处理（紫外线紫外线）、）、 化学物质、化学物质、 直接去除受精卵中的雄性原核直接去

21、除受精卵中的雄性原核 （2）细胞分裂的阻止（雌核染色体二倍）细胞分裂的阻止（雌核染色体二倍 化）化） 温度休克、静水压力、化学抑制剂处理温度休克、静水压力、化学抑制剂处理 44 Heat-shock treatment to activated/fertilized eggs of Indian major carps to induce diploid gynogenesis/polyploidy respectively 热休克 45 人工诱导雌核发育的方法人工诱导雌核发育的方法 （3）雌核发育的鉴别）雌核发育的鉴别 鉴别雌核发育的个体，通常以颜色、形状鉴别雌核发育的个体，通常以颜色、形状

22、 和生化等方面的指标为根据。和生化等方面的指标为根据。 目前，还采用细胞学和遗传标记的方法目前，还采用细胞学和遗传标记的方法 46 10.2 10.2 动物染色体结构的改造动物染色体结构的改造 染色体片段的删除和重排染色体片段的删除和重排 染色体的易位工程染色体的易位工程 47 染色体结构变异染色体结构变异 易位：一个染色体上某一 区段跟另一非同源染色 体上的区段发生互换 缺失：染色体的某一区段 及带有的基因一起丢失 倒位：染色体上某一区段 连同它带有的基因顺序 发生180度倒转 重复：一个染色体上增加 了相同的某个区段。 10.3 人工染色体人工染色体 人工染色体 酵母人工染色体 细菌人工染

23、色体 哺乳类人工染色体 人工染色体的应用 49 人工染色体人工染色体 染色体要确保在细胞分裂中保持稳定性，必须要能够自染色体要确保在细胞分裂中保持稳定性，必须要能够自 我复制和向子细胞中平均分配，需要我复制和向子细胞中平均分配，需要3个关键序列：个关键序列： 1.自主复制自主复制DNA序列（序列（ARS） 是是DNA复制的起点，确保染色体能够开始自我复制。复制的起点，确保染色体能够开始自我复制。 2.着丝粒着丝粒DNA序列（序列（CEN） 确保染色体在细胞分裂时能平均分配到子细胞中。确保染色体在细胞分裂时能平均分配到子细胞中。 3.端粒端粒DNA序列（序列（TEL） 使使DNA能结束复制，确保

24、染色体的独立性和稳定性。能结束复制，确保染色体的独立性和稳定性。 50 人工染色体人工染色体 定义：定义：人工构建的含有人工构建的含有复制起始点、着丝粒复制起始点、着丝粒 和端粒和端粒三个关键序列的三个关键序列的载体载体系统。系统。 51 现正在研究的人工染色体有三种：现正在研究的人工染色体有三种： 酵母人工染色体（克隆容量酵母人工染色体（克隆容量105-1010bp） （yeast artificial chromosome, YAC） 细菌人工染色体（常用于克隆约细菌人工染色体（常用于克隆约300bp片段）片段） （bacterial artificial chromosome, BAC）

25、 哺乳类人工染色体哺乳类人工染色体 （mammalian artificial chromosome, MAC） 52 YAC YAC 载体基本序列元件载体基本序列元件： 酵母染色体DNA自主复制顺序（ARS） ： 负责DNA复制 酵母染色体的着丝粒顺序（CEN）： 保证酵母细胞分裂时染色体的分配 酵母染色体的端粒顺序（TEL）： 维持染色体结构的稳定性（两端各 一个） 选择标记：用于重组克隆的筛选 pYAC4是一个大肠杆菌穿梭质粒， 含有Amp大肠杆菌筛选标记 YACYAC重组载重组载 体构建示体构建示 意图意图 完整的染色体DNA的提取 基因组DNA酶切大片段的获取 YAC载体臂的制备 Y

26、AC臂与目的DNA大片段的连接 YAC重组体对酵母的转化 YAC基因库的鉴定 目的基因YAC克隆的筛选 目的基因YAC克隆的鉴定 YAC克隆技术流程克隆技术流程 YACYAC的主要用途是：的主要用途是： (1)YAC可容纳大片段的外源DNA ，而且在构建基因组文构建基因组文 库库时需要较少的克隆。 (2)用YAC克隆构建的物理图谱在复杂的生物基因组分析基因组分析 和和DNADNA测序测序中发挥着重要作用。目前，用YAC提供大片段 DNA构建染色体图谱的技术已在人类、植物、昆虫、鸟 类、两栖类等动物中得到广泛应用，相比于早期的DNA 片段载体，YAC是容纳大片段外源DNA的首选载体。 (3)在基

27、因功能研究基因功能研究中，基因嵌入及转基因技术都采用 了YAC克隆系统。通过YAC嵌入的基因不仅片段长，而且 嵌入的基因更适于体内表达，并有利于基因保持其固有 的空间构象和功能的发挥。 YACYAC的缺点：的缺点： 1、插入片段大，稳定性较差，不易操作 2、插入的大片段常发生缺失，使文库不完整 3、YAC与酵母天然染色体分子结构相似分离 时难与天然染色体分开 4、文库中的嵌合现象严重 5、因插入片段大，往往发生序列重排，造成 序列错乱。 细菌人工染色体（细菌人工染色体（BAC） 新一代BAC载体为7.4kb的环状质粒环状质粒，主要结 构有： F因子的因子的parA，parB，parC基因基因 保证低拷贝的BAC质粒在大肠杆菌分裂时均匀分配到 子代细胞。 起始起始oriS基因基因 严密控制，决定低拷贝数和复制起始 解旋酶基因解旋酶基因repC 易于DNA复制和决定复制方向 选择标志基因选择标志基因Cmr 氯霉素抗性基因 lacZ基因基因 颜色鉴别重组子，外源基因插入其中 loxP和和cosN位点位点 易于克隆DNA回收和操作 BAC的特点： 宿主中只有1-2个拷贝 插入片段不易变化，稳定遗传 避免嵌合现象 转化效率高 主要用于300b