液相色谱定量方法指导原则[稻谷文苑]

1、液相色谱定性定量方法液相色谱定性定量方法 1研究特制 1 有关色谱峰的基本概念（一）有关色谱峰的基本概念（一） 峰底峰底(CD):峰的起点与终点之间连接的直线 峰高峰高(h):峰最大值到峰底的距离 峰宽峰宽(KL):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半高峰宽半高峰宽(W1/2):通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两 侧相交两点之间的距离 峰面积（峰面积（A）:峰与峰底之间的面积,又称响应值 拖尾峰（拖尾峰（Tailing peak）:后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰（前伸峰（Leading peak）:前沿较后沿平缓的不对称峰 基线（基线（Baseline):在正常操作条件

2、下，仅由流动相所产生的响应信 号的曲线 基线噪声（基线噪声（N）:由各种因素所引起的基线波动 基线漂移基线漂移(Baseline drift):基线随时间定向的缓慢变化 2研究特制 1 有关色谱峰的基本概念（二）有关色谱峰的基本概念（二） 3研究特制 2 通过测量和计算得到的色谱参数（一通过测量和计算得到的色谱参数（一） 死时间死时间(dead time，t0)不保留组分的保留时间，即流动相（溶剂）通 过色谱柱的时间。 死体积死体积(dead volume，V0)由进样器进样口到检测器流动池未被固定 相所占据的空间。V0Ft0（F为流速） 保留时间保留时间(retention time，tR)

3、从进样开始到某个组分在柱后出现浓度 极大值的时间。 保留体积保留体积(retention volume，VR)从进样开始到某组分在柱后出现浓 度极大值时流出溶剂的体积，又称洗脱体积。VRFtR。 调整保留时间调整保留时间(adjusted retention time，tR)扣除死时间后的保留时间 。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tR只决定于组分的性质，因 此tR（或tR）可用于定性。tRtRt0 调整保留体积调整保留体积(adjusted retention volume，VR)扣除死体积后的保留 体积VRVRV0或VRFtR 4研究特制 2 通过测量和计算得到的色谱参数通过测量和计算

4、得到的色谱参数(二）二） 柱效能柱效能：色谱柱在分离过程中主要有动力学参数 决定的分离效能。通常用理论板数或有效板数表 示。 理论板数： 若应用调整保留时间 tR计算理论塔板数，所得值 称为有效理论塔板数( n有效或 neff ) 有效板数： 5研究特制 2 通过测量和计算得到的色谱参数通过测量和计算得到的色谱参数(三）三） 分离度：分离度：两个相邻色谱峰的分离程度， 以两个组分保留值之差与其平均峰宽之 比表示。 6研究特制 分离度图示分离度图示 7研究特制 响应值：响应值：组分通过检测器系统产生的信 号值。 相对响应值：相对响应值：单位量物质与单位量参比 物质的响应值之比。 2 通过测量和计

5、算得到的色谱参数通过测量和计算得到的色谱参数(四）四） 8研究特制 校正因子（校正因子（f）：）：相对响应值的倒数，它与峰面积的乘 积正比于物质的量。 定量限（定量限（LOQ）：）：是指样品中被测物能被定量测定的 最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。定 量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。 2 通过测量和计算得到的色谱参数通过测量和计算得到的色谱参数(五）五） 检测限（检测限（LODLOD）：）：系指试样中的被测物能被检查的最低 量，是鉴别试验的灵敏度指标。其越低，反应的灵敏度 越高。 9研究特制 3 液相色谱的定性分析液相色谱的定性分析 1、与已知物直接对照 2、已知物峰

6、高增加法 3、二极管阵列检测器的三维图谱定性 4、与其他仪器联用定性 10研究特制 4 色谱法定量的依据色谱法定量的依据 在一定的操作条件下，检测器的响应 信号（色谱峰的峰面积或峰高）与进入检 测器组分的量成正比。 即即：mi = fi Ai 或或 mi = fi hi 式中：mi组分的量 fi比例常数 这就是色谱法定量的依据。 11研究特制 5 峰面积峰面积 A 的测量方法（一）的测量方法（一） （1）峰高）峰高 h 乘半峰宽乘半峰宽 w1/2 法法 将色谱峰视为等腰三角形，得到的面积为 实际面积的0.94倍，故实际面积应为：（适合 于对称峰） A 1.065 h w1/2（相对计算可略去前

7、面系 数） （2）峰高乘平均峰宽法）峰高乘平均峰宽法 不对称峰不能作前述近似，可于峰高0.15及 0.85处测得峰宽，取其平均值进行计算： A = h (w0.15+w0.85)/2 12研究特制 5 峰面积峰面积 A 的测量方法（的测量方法（二）二） （3）峰高乘保留时间法）峰高乘保留时间法 难以量度半峰宽的狭窄峰或半峰宽以上重叠的峰 可用下式计算： A 1.065h b tR （相对计算可略去1.065和 常数b） （4）剪纸称重法）剪纸称重法 对于不对称或分离不完全的峰，可将峰剪下，以 质量代其面积，使用较少。 13研究特制 （5）自动积分法）自动积分法 将记录仪与自动积分仪连接，可直接

8、准确、快 速地测出峰的面积。 （6）以峰高代替峰面积定量法）以峰高代替峰面积定量法 当各种实验条件严格保持不变时，一定进样范 围内色谱峰的半峰宽不变，即可用峰高代替峰 面积定量，特别对于狭窄的峰，较面积定量法 更为准确。 5 峰面积峰面积 A 的测量方法（的测量方法（三）三） 14研究特制 6 定量校正因子（一）定量校正因子（一） 检测器对不同物质的响应值不同，故相同质 量的不同物质通过检测器时，产生的峰面积 不等，因而不能直接应用峰面积计算组分含 量。 为此引入“定量校正因子”以校正峰面积， 使之能更真实地反映组分含量。 前面已知：mi fi Ai 即：fi mi / Ai 15研究特制 6

9、 定量校正因子（二）定量校正因子（二） fi 称绝对校正因子，定量分析中常用的是相对校正因称绝对校正因子，定量分析中常用的是相对校正因 子子f i，定义为组分的绝对校正因子与标准物质的绝，定义为组分的绝对校正因子与标准物质的绝 对校正因子之比：对校正因子之比： v mi、ms用质量单位时，用质量单位时，f w称相对质量校正因子称相对质量校正因子 v mi、ms用摩尔为单位时，用摩尔为单位时，f M称相对摩尔校正因子称相对摩尔校正因子 v 注意：应用中一般地略去注意：应用中一般地略去“相对相对”两字两字 isi is ss ii si SmA mA Am Am fff 1 / / / 16研究特

10、制 6 质量校正因子的测定方法（三）质量校正因子的测定方法（三） 准确称取一定量待测组分的纯物质和标准物 质的纯物质混和后，取一定量（在检测器的 线性范围内）在实验条件下注入色谱仪，出 峰后分别测出两者峰面积，由前式可求得校 正因子。 isi is ss ii si SmA mA Am Am fff 1 / / / 17研究特制 7 常用的几种定量测定方法（一）常用的几种定量测定方法（一） （1）归一法 当试样中的全部组分都出峰（即都反映在 色谱图上）时，可以从校正后每峰峰面积占全部 色谱峰总面积的分数，求得该组分的质量分数。 n i ii ii Af Af 1 x i% = 100 （可以为

11、质量百分含量或摩尔百分含量） 18研究特制 7 常用的几种定量测定方法（二）常用的几种定量测定方法（二） 归一法的特殊情况 若试样中各组分的相对校正因子很接近（如同系物中 沸点接近的组分），上式则可简化为： n i i i A A 1 x i % = 100 当测量参数为峰高时，也可以用峰高归一法计算组分含量。 （用峰高校正因子，以峰高代峰面积代入前页算式即可，） 归一法具有简便、准确的特点归一法具有简便、准确的特点 不足之处在于仅可使用于所有组分都出峰的情况不足之处在于仅可使用于所有组分都出峰的情况 19研究特制 7 常用的几种定量测定方法（三）常用的几种定量测定方法（三） （2）内标法 使

12、用条件：试样中各组分不能全部出峰、各组分含量悬 殊、仅需测定其中部分组分 操作步骤： a. 准确称取一定量的试样； b. 加入一定量的选定标准物（内标物）； c. 混匀后进样，进行色谱分析； d. 根据内标物和试样质量以及色谱图上相应的峰面积， 计算待测组分的量。 20研究特制 7 常用的几种定量测定方法（四）常用的几种定量测定方法（四） 内标法待测组分含量计算式如下（由前可推得）: （各符号意义同上） 内标法中常以内标物为基准，即：f s 1 ， 也可用峰高代替峰面积，做法同上。 %100 样品 m Af Af m x ss ii s i 21研究特制 内标法注意事项 a.内标物应是试样中不

13、存在的纯物质； b.加入的内标物量与试样中待测组分量相近； c.内标物的色谱峰应位于待测组分色谱峰附近 或几个待测组分色谱峰之间。 7 常用的几种定量测定方法（五）常用的几种定量测定方法（五） 22研究特制 内标法优缺点 优点：定量准确，对试样含有不出峰的 组分情况下，也不影响测定。 缺点：每次测定都必须准确称取样品和 内标物质量，不适于快速分析。 7 常用的几种定量测定方法（六）常用的几种定量测定方法（六） 23研究特制 内标曲线法 若以 Ci % 对 Ai / As作图，则可得一条通过原点的直 线内标标准曲线。 sf 样品m fmis 为一常数，上式则可化为： 常数 s i A A x i

14、 % = 用内标法待测组分含量计算式 若固定试样称取量，加入内标物也恒定，则有： 7 常用的几种定量测定方法（七）常用的几种定量测定方法（七） %100 样品 m Af Af m x ss ii s i 24研究特制 内标标准曲线的绘制内标标准曲线的绘制 a. 将待测组分的纯物质配成不同浓度的标准溶 液（系列）； b. 取固定量的标准溶液和内标物，混合后进样 分析，测出 Ai 和 As； c. 用 Ai / As 对标准溶液浓度作图，可得一组通 过原点的直线（内标标准曲线）。 7 常用的几种定量测定方法（八）常用的几种定量测定方法（八） 25研究特制 样品测定与组分定量样品测定与组分定量 a.

15、 称取与绘制标准曲线相同量 的试样和内标物，测出其峰 面积比，由标准曲线即可查 出待测组分的含量。 b. 内标标准曲线法应用在生产 过程控制分析上，不须计算 校正因子，对液体样品也可 量取体积，具有简便快速的 特点。 7 常用的几种定量测定方法（九）常用的几种定量测定方法（九） 26研究特制 （3）外标标准曲线法 a. 取被测组分的纯物质，配制成 一系列不同浓度的标准溶液； b. 分别取一定体积上述溶液注入 色谱柱； c. 得到色谱图后测出峰面积或峰 高； d. 绘出峰面积（或峰高）对浓度 的关系曲线（标准曲线）。 标准曲线的绘制 7 常用的几种定量测定方法（十）常用的几种定量测定方法（十）

16、27研究特制 外标法 样品测定（一） a.在同样操作条件下注入同样量（一般为体积） 的待测试样，从色谱柱上测得峰面积或峰高， 在标准曲线上即可查出待测组分的浓度。 b. 外标法也用于生产过程的控制分析，操作简 便，计算简单，但分析结果准确性取决于操 作条件的稳定性和进样的重现性。 7 常用的几种定量测定方法（十一）常用的几种定量测定方法（十一） 28研究特制 外标法 样品测定（二） c.当试样中待测组分浓度变化不大时，可不必 作标准曲线，而用单点校正法。即配制一个 与被测组分含量接近的标准样，分别取相同 量体积进样，测定标准样和待测样的峰面积， 按下式计算组分含量: Ci% = Ai/As C

17、s% 7 常用的几种定量测定方法（十二）常用的几种定量测定方法（十二） 29研究特制 （4）标准加入法（一） 标准加入法实质上是一种特殊的内标法，以欲 测组分的纯物质加入到待测样品中，分别测定 加入前后的峰面积，从而计算欲测组分在样品 中的含量。 a. 可以单点加入，色谱条件完全相同的情况下， 按以下公式计算： 7 常用的几种定量测定方法（十三）常用的几种定量测定方法（十三） )( )( i ii i i hA hA X XX 30研究特制 标准加入法（二） b.可以加入一系列浓度，按标准曲线外推法计算 出欲测物在样品中的含量。 优点：不需要另外的内标物，不必要进样非常 准确；操作简单；若在前

18、处理过程加入，可补 偿被测组分在处理过程中的损失。 缺点：色谱条件要求完全一致，否则会带来分 析误差。 7 常用的几种定量测定方法（十四）常用的几种定量测定方法（十四） 31研究特制 7 常用的几种定量测定方法（十五）常用的几种定量测定方法（十五） 标准加入法（三） 标准加入法标准曲线绘制 将一系列已知量待测物分别加入到几等份的样品中，配制成 浓度为(cx+0), (cx+c1), (cx+c2), (cx+c3). 和样品有相同基体的 标准系列溶液(加标，spiking)； 通过仪器分别测量以上系列溶液的响应值S0，S1，S2，S3， S4； 以响应信号S对浓度c作图，再将直线外推与浓度轴相交于 一点(下图)，求得样品中待测物浓度cx。 32研究特制 cx 0.0 0.2 0.01020 30-10 浓度，浓度，c S S2 S3 S4 S1 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 当样品量很少时，可在一份样品中加标，加一次作一次测量，可得到上述当样品量很少时，可在一份样品