分子印迹固相萃取高效液相色谱法测定植物油中苯并（a）芘

1、分子印迹固相萃取高效液相色谱法测定植物油中苯并（a）芘的研究伍先绍（广西壮族自治区粮油质量检验站，南宁 530031）摘 要 研究了分子印迹固相萃取高效液相色谱法测定植物油中苯并（a）芘含量的方法关键点、加标回收率和精密度。方法关键点为确立荧光最优检测波长和选择无本底含量的试验试剂，可以提高方法的灵敏度和结果的准确性。苯并（a）芘的荧光最优激发波长为362 nm，发射波长为410 nm。试验试剂本身可能含苯并（a）芘，应优先选择同批次无本底含量的试验试剂。油茶籽油中低、中、高三个不同苯并（a）芘添加量的加标回收率分别为95.7%、94.5%和95.2%，植物油中低、中、高三个不同苯并（a）芘含

2、量的测定结果相对标准偏差分别为1.4%、1.8%和2.1%。结果表明方法加标回收率高，精密度好。通过比较分子印迹柱和中性氧化铝柱净化效果，分子印迹柱的测定结果更加稳定，在实际检测应用中更有优势。将方法应用于植物油中苯并（a）芘测定能力验证，评价结果满意。关键词 苯并(a)芘 分子印迹 固相萃取 高效液相色谱法 荧光检测中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：1003-0174（ ） - - 收稿日期：2016-06-07作者简介：伍先绍，男，1983年出生，工程师，粮油食品检验与质量控制Determination of Benzo(a)pyrene Content in Vege

3、table Oils by High Performance Liquid Chromatography with Molecularly Imprinted Solid Phase ExtractionWu Xianshao(The grain and oil quality inspection station of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning, 530031)Abstract The key points of method，standard recovery rates and method precision of determ

4、ine benzo(a)pyrene content in vegetable oils by high performance liquid chromatography with molecularly imprinted solid phase extraction was studied in this paper. The key points of method were to confirm optimal detection wavelength of fluorescence detector and to choice experiment reagents with no

5、 background content. The optimal wavelength of fluorescence detector to determent benzo(a)pyrene content was the excitation wavelength of 362 nm and the emission wavelength of 410 nm. The experiment reagents might contain benzo(a)pyrene themselves, must control the quality of reagents, and gave prio

6、rity to use of the same batch of reagents with non benzo(a)pyrene. The standard recovery rates of adding benzo(a)pyrene standard on low, medium and high concentration in camellia seed oil were 95.7%, 94.5% and 95.2% respectively, and the relative standard deviation (RSD) of method on low, medium and

7、 high concentration for benzo(a)pyrene in vegetable oils were 1.4%, 1.8% and 2.1% respectively. The results indicated that the method had high standard recovery rates and good precision. Through the comparison between the method of molecularly imprinted column purification and the method of neutral

8、alumina column purification, the method of molecularly imprinted column purification was more stable and had greater application advantage. The evaluation of proficiency testing benzo(a)pyrene content in vegetable oils received good results.Key words Benzo(a)pyrene, Molecularly Imprinted Technology,

9、 Solid Phase Extraction, High Performance Liquid Chromatography, Fluorescence Detection苯并(a)芘是多环芳烃中毒性最大的一种强致癌物，具有很强的致癌性和致畸性1，是食品污染物限量中主要安全指标之一23，有必要检测植物油中的苯并(a)芘含量，防止不合格产品流入市场，危害消费者身体健康。现行国家标准检验方法GB/T 22509-2008动植物油脂 苯并(a)芘的测定 反相高效液相色谱法4采用中性氧化铝固相萃取柱制备净化试样，但是存在自行制备固相萃取柱时难控制中性氧化铝的活性、中性氧化铝柱活性不稳定会导致测定结果

10、不稳定和加标回收率偏低的问题，而且采用的荧光检测波长（激发波长384 nm，发射波长为406 nm）不是最优检测波长，会影响测定结果的准确性和精密度。近年来，针对植物油中苯并(a)芘含量测定用的商品化分子印迹固相萃取柱已被开发出来，具有特异性强、方法回收率高，精密性好等优点57，与现行国家标准检验方法GB/T 22509-2008采用的中性氧化铝柱相比，在实际检测工作应用中更有优势，具有操作步骤简单，回收率高，结果准确，精密度好的特点。本文对分子印迹固相萃取高效液相色谱法检测植物油中苯并(a)芘含量的方法关键点、方法加标回收率和方法精密度进行了研究，以期能为提升植物油中苯并(a)芘的检验检测能

11、力提供参考。1材料与方法1.1实验材料油茶籽油样品：编号为1号和2号，其中1号样品的苯并(a)芘含量为未检出；植物油能力验证考核样品：编号为3号和4号。分子印迹柱：Cleanert BaP固相萃取柱，500 mg/6 mL（P/N：BaP5006），生产厂家：天津博纳艾杰尔科技有限公司。中性氧化铝柱：Cleanert BaP固相萃取柱，22g/60 mL（P/N：BaP2260），100200目，Brockmann活度级，生产厂家：天津博纳艾杰尔科技有限公司。1.2试验试剂试验试剂均为色谱纯。国产甲醇：天津市四友精细化学品有限公司；国产正己烷、国产二氯甲烷：天津市光复精细化工研究所；进口正己烷

12、、进口二氯甲烷、进口乙腈：美国天地有限公司。实验室用水符合GB/T 66822008规定的一级水要求。甲醇中苯并(a)芘溶液标准物质：5.05 g/mL，规格2 mL/支，编号：GBW(E)080476，定值单位：中国计量科学研究院。1.3主要实验仪器和用具Agilent 1260高效液相色谱仪（配置荧光检测器G1321A）：安捷伦科技有限公司；N-EVAP 24-RT氮吹仪：美国Organomation公司；VORTEX-6涡旋混合器：海门其林贝尔仪器制造有限公司；HH-S2电热恒温水浴锅（控温范围：常温至100 ）：金坛市医疗仪器厂。5 mL刻度试管、150 mL圆底烧瓶、100 mL量筒

13、、10 mL容量瓶等玻璃用具，使用前均用色谱纯正己烷或色谱纯二氯甲烷清洗，以消除苯并（a）芘残留污染，晾干备用。1.4色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse PAH柱，250 mm4.6 mm，粒径5.0 m，加PAH保护柱：12.5 mm4.6 mm，粒径5.0 m；流动相及组成：乙腈水为8812（体积分数）；流速：1.00 mL/min；进样量：20 L；柱温：35 。利用安捷伦荧光检测器G1321A的荧光扫描程序，进行苯并（a）芘标准物质的离线荧光扫描。检测器条件：步长1 nm， PMT增益为12，确定荧光最优检测波长。1.5标准溶液的配制1.5.1 1.01 g/

14、mL苯并（a）芘标准储备母液：转移2 mL 5.05 g/mL甲醇中苯并(a)芘溶液标准物质于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀。1.5.2 0.101 g/mL苯并（a）芘标准储备中间液：移取1 mL 1.01 g/mL苯并（a）芘标准储备母液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀。1.5.3 苯并（a）芘标准工作使用液：分别移取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mL 0.101 g/mL苯并（a）芘标准储备中间液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，即为2.525、5.05、7.575、10.10、12.625、15.15、21.2

15、0 ng/mL的苯并（a）芘标准系列工作使用液。1.6试样制备1.6.1分子印迹柱净化试样步骤用5 mL刻度试管称取0.5 g（精确到0.0001 g）植物油试样，加入5 mL正己烷，涡旋振荡溶解后待净化。取苯并（a）芘分子印迹柱，依次用5 mL二氯甲烷和5 mL正己烷活化柱子，弃去流出液，待液面降至距离柱床约1 cm时，将5 mL刻度试管中的待净化试样转移进柱子，用3 mL正己烷分三次清洗5 mL刻度试管，清洗液一并上柱，弃去流出液。待净化液液面下降接近至柱床时，用10 mL正己烷淋洗柱子，弃去流出液。待正己烷流干后加5 mL二氯甲烷洗脱，用另外一支干净的5mL刻度试管收集净化液。将净化液放

16、置在40 水浴中氮吹至尽干。加入1 mL乙腈溶解，涡旋振荡均匀，过0.45 m孔径的有机滤膜转移至进样瓶中，进样20 L上机测定。同时，按上述步骤测定试剂空白。1.6.2中性氧化铝柱净化试样步骤用5 mL刻度试管称取0.4 g（精确到0.0001 g）植物油试样，加入2 mL正己烷，涡旋振荡溶解后待净化。取Cleanert BaP中性氧化铝柱，加入30 mL正己烷活化柱子，控制流速，不收集流出液。当流动相液面接近柱顶端时，将5 mL刻度试管中的待净化试样转移进柱子，同时开始用150 mL的圆底烧瓶接收洗脱液，添加80 mL正己烷洗脱直到80 mL的正己烷完全自然滴出。将收集的洗脱液在78 左右

17、的水浴中蒸发浓缩至约0.5 mL，转移浓缩液至另一支10 mL比色管中，用正己烷淋洗圆底烧瓶34次，合并淋洗液到10 mL比色管中，将净化液放置在40 水浴中氮吹至尽干。加入1 mL乙腈，涡旋振荡均匀，过0.45 m孔径的有机滤膜转移至进样瓶中，进样20 L上机测定。同时，按上述步骤测定试剂空白。1.6.3加标回收率测定方法用5 mL刻度试管称取0.5 g（精确到0.0001 g）植物油试样，分别准确移取0.50、1.00、1.50 mL的10.10 ng/mL苯并（a）芘标准工作使用液，放置在40 水浴中氮吹至尽干，除去乙腈后涡旋振荡混匀。加入5 mL正己烷，将试样溶解后待净化。以下按1.6

18、.1自“取苯并（a）芘分子印迹柱，”起依法操作。1.7建立标准工作曲线取2.525、5.05、7.575、10.10、12.625、15.15、21.20 ng/mL的苯并（a）芘标准系列工作使用液各进样20 L，苯并(a)芘标准物质的色谱出峰见图1，出峰时间为18.252 min。以苯并(a)芘含量为横坐标和峰面积为纵坐标建立标准工作曲线方程为：y=2.8292x-0.9235，相关系数R2=0.99953。图1 苯并(a)芘标准物质的色谱出峰图1.8结果计算植物油中苯并(a)芘含量的计算公式为：其中：X样品中的苯并(a)芘含量，单位为微克每千克（g/kg）； C由标准曲线方程计算得到的样品

19、净化溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；C0由标准曲线方程计算得到的试剂空白净化溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V试样最终定容体积，单位为毫升（mL）； m试样质量，单位为克（g）；1000由ng/g换算成g/kg的换算因子。2结果与分析2.1优化荧光检测器检测波长 利用荧光检测器G1321A的荧光扫描程序，得到苯并（a）芘的荧光检测波长扫描图谱（见图2），确定荧光检测苯并（a）芘的最优激发波长为362 nm，最优发射波长为410 nm。根据GB/T 5009.27-2003食品中苯并(a)芘的测定8并结合相关文献报道9-10中苯并(a)芘的检测波长介绍，本文选择激发波长36

20、5 nm，发射波长410 nm作为荧光检测器的检测波长，PMT增益为12。在实际检测工作中进行大批量样品检测，发现该检测波长的检测灵敏度比GB/T 22509-2008规定的检测波长（激发波长384 nm，发射波长406 nm）的检测灵敏度更高，也能获得更低的方法检出限。图2 苯并(a)芘的荧光检测波长扫描图谱2.2试验试剂的质量控制检测方法中采用的试验试剂本身可能含有苯并（a）芘。按1.6.1规定方法步骤制备试剂空白，比较了天津光复精细化工研究所生产的色谱纯试验试剂和和美国天地有限公司生产的色谱纯试验试剂，实验结果见表1。因植物油中苯并（a）芘含量很低（GB 2762规定油脂及其制品中苯并（

21、a）芘限量为10 g/kg），且方法灵敏度高，当试验试剂含有苯并（a）芘时，试验试剂的本底含量均会影响检测结果的准确性和稳定性。因此，对试验试剂的苯并（a）芘含量进行质量控制至关重要。在实际检测中，应事先对试剂中的苯并（a）芘含量进行质量控制，优先选择不含苯并（a）芘的试验试剂；每做同一批样品，保证使用同一批试剂，可以确保试剂空白测定结果的一致性。表1 两个不同厂家试验试剂中苯并（a）芘含量比较生产厂家测定次数定容体积/mL测定值/ng/mL平均值/ng/mL相对标准偏差（RSD）%天津市光复精细化工研究所11.00.57280.56685.221.00.525631.00.543941.00

22、.582151.00.6098美国天地有限公司11.0NDND/21.0ND31.0ND41.0ND51.0ND61.0ND注：ND表示未检出。2.3方法加标回收率测定称取未检出苯并（a）芘含量的1号油茶籽油样品，按1.6.3规定方法步骤分别添加5.05 ng、10.10 ng和15.15 ng苯并（a）芘标准物质，测定低、中、高三个不同苯并（a）芘添加水平的方法加标回收率，测定结果见表2。结果显示，低、中、高三个不同添加水平的方法平均加标回收率分别为95.7%、94.5%和95.2%，相对标准偏差（RSD）分别是0.8%、1.5%和0.6%，结果表明方法加标回收率高，结果稳定性好。表2 方法

23、加标回收率测定结果苯并（a）芘加标量/ng试验序号定容体积/mL试样量/g测定值/ng/mL本底空白含量/ng回收量/ng加标回收率/%平均加标回收率/%相对标准偏差（RSD）%5.0511.00.50455.45640.57464.881896.6795.70.821.00.50545.34270.57464.767794.4131.00.50075.42280.57464.848296.0041.00.50115.38560.57464.811095.2751.00.50345.43750.57464.862996.2910.1011.00.516310.35480.57469.78029

24、6.8394.51.521.00.508110.15300.57469.578494.8431.00.499410.13220.57469.557694.6341.00.51109.96250.57469.387992.9551.00.51069.91350.57469.418993.2615.1511.00.514915.12350.574614.548996.0395.20.621.00.500714.90070.574614.326194.5631.00.500715.01240.574614.437895.3041.00.505615.06340.574614.488895.6451.

25、00.499814.89920.574614.324694.552.4方法精密度测定分别称取3号、4号植物油能力验证考核样品和2号油茶籽油样品，按1.6.1规定方法步骤各重复测定8次，测定低、中、高三个不同苯并（a）芘含量的方法精密度，测定结果见表3。结果表明，低、中、高三个不同苯并（a）芘含量测定结果的相对标准偏差（RSD）分别为1.4%、1.8%和2.1%，方法精密度好，适用于不同水平的植物油样品中苯并（a）芘含量测定。表3 方法精密度测定实验结果样品编号测定次数试样量m/g定容体积V/mL苯并(a)芘含量C/ng/mL试剂空白C0/ng/mL测定结果X/g/kg测定结果平均值/g/kg相

26、对标准偏差（RSD）%3号 10.51141.07.831551.749911.8911.81.420.51031.07.761891.749911.7830.50471.07.797901.749911.9840.53221.08.067951.749911.8750.50781.07.657821.749911.6360.52001.08.001031.749912.0270.51011.07.667901.749911.6080.50001.07.548351.749911.604号10.51851.011.441771.749918.6918.71.820.50051.010.9338

27、51.749918.3530.52041.011.557791.749918.8540.50901.011.448621.749919.0550.50331.011.292181.749918.9660.50401.010.981021.749918.3270.50561.010.979621.749918.2680.51391.011.624801.749919.222号10.50151.034.742911.749965.7966.12.120.50871.034.230971.749963.8530.50271.034.094751.749964.3440.51751.036.83617

28、1.749967.8050.51151.036.529311.749967.9960.52161.036.283921.749966.2170.51811.035.951881.749966.0180.50681.035.468931.749966.532.5两种净化柱测定结果比较分别称取3号和4号植物油能力验证样品，按1.6.1规定方法步骤和1.6.2规定方法步骤各重复测定4次，测定结果表4。用分子印迹柱净化试样，3号和4号植物油能力验证样品中苯并（a）芘含量分别为11.7 g/kg和18.8 g/kg，测定结果的相对标准偏差（RSD）分别为0.3%和0.9%；而采用中性氧化铝柱净化试样，3

29、号和4号植物油能力验证样品中苯并（a）芘含量分别为10.5 g/kg和18.2 g/kg，测定结果的相对标准偏差（RSD）分别为8.3%和9.5%。比较结果表明，分子印迹柱的净化效能比中性氧化铝柱的净化效能更加稳定，有更好的结果稳定性，在实际检测应用中更有优势。表4 两种净化柱测定结果比较柱型样品编号试样量m/g定容体积V/mL苯并(a)芘含量C/ng/mL试剂空白C0/ng/mL测定结果X/g/kg结果平均值/g/kg相对标准偏差（RSD）%分子印迹柱3号0.50701.06.654190.7396611.6711.70.30.49861.06.588640.7396611.730.4982

30、1.06.494150.6992311.630.50791.06.609650.6992311.644号0.50781.010.232940.7396618.6918.80.90.50501.010.094460.7396618.520.49511.010.096360.6992318.980.50221.010.145060.6992318.81中性氧化铝柱3号0.30700.410.952532.3957211.1510.58.30.30820.410.641762.3957210.700.32250.412.342103.3746811.120.31630.410.505083.3746

31、89.024号 0.30570.418.518382.3957221.1018.29.50.30900.416.044862.3957217.670.30260.415.853883.3746816.500.30750.416.882353.3746817.572.6参加植物油中苯并（a）芘测定能力验证及评价结果参加植物油中苯并（a）芘测定能力验证，3号植物油能力验证样品中苯并（a）芘含量测定结果为11.6 g/kg，稳健Z比分数为1.38；4号植物油能力验证样品中苯并（a）芘含量测定结果为18.9 g/kg，稳健Z比分数为1.76。两个能力验证样品测定结果的稳健Z比分数绝对值均小于2，评价结

32、果满意。图3 分子印迹柱净化测定油茶籽油中苯并(a)芘的色谱出峰图3 结论研究了分子印迹固相萃取高效液相色谱法测定植物油中苯并（a）芘含量的方法关键点、方法加标回收率和方法精密度。（1）方法关键点为确立荧光最优检测波长和选择无本底含量的试验试剂。确定苯并（a）芘的荧光最优激发波长为362 nm，最优发射波长为410 nm，建议今后修订GB/T 22509-2008时采用此波长条件，可以提高方法灵敏度。试验试剂本身可能含有苯并（a）芘，应对试验试剂进行质量控制，优先选择同批次无本底含量的试验试剂，可以提高检验结果的准确性和稳定性。（2）分别添加5.05 ng、10.10 ng和15.15 ng三

33、个不同苯并（a）芘添加量的方法加标回收实验，方法加标回收率分别为95.7%、94.5%和95.2%，油茶籽油中低、中、高三个不同苯并（a）芘含量的测定结果相对标准偏差分别为1.4%、1.8%和2.1%。结果表明，方法加标回收率高，精密度好，能满足检测要求。（3）通过比较分子印迹固相萃取柱和中性氧化铝固相萃取柱净化效果，比较结果表明分子印迹固相萃取柱更加稳定，在实际检测应用中更有优势。将方法应用于植物油中苯并（a）芘含量测定能力验证，评价结果满意。参考文献1吴丹. 食品中苯并芘污染的危害性及其预防措施J. 食品工业科技，2008, 29 (5): 309-311Wu D. The harm an

34、d prevention measures of benzopyrene pollution in foodJ. Science and Technology of Food Industry, 2008, 29(5):309-3112 GB 27622012. 食品安全国家标准 食品中污染物限量S. 北京：中国标准出版社，2005GB 27622012. National food safety standard-Maximum levels of contaminants in foodsS. Beijing: Standards Press of China, 20053GB 27162

35、005 食用植物油卫生标准S. 北京：中国标准出版社，2005GB 27162005. Hygienic standard for edible vegetable oilS. Beijing: Standards Press of China, 20054GB/T 225092008 动植物油脂 苯并(a)芘的测定 反相高效液相色谱法S. 北京：中国标准出版社，2008GB/T 225092008. Animal and vegetable fats and oils-determination of benzo(a)pyrene reverse-phase high performance liquid chromatography methodS. Beijing: Standards Press of China, 20085刘祺文，熊远福，王锦，等. 分子印迹固相萃取技术研究新进展J. 环境科技，2015, 28（5）:63-69 Liu QW, X