荧光定量实验报告

1、RTqPCR比较不同样本中mi R21得相对表达差异一、实验目得1、掌握实时荧光定量PCR得实验原理。2、掌握实时荧光定量PCR相对定量得分析方法。二、实验原理实时荧光定量 PCR （Qua n tit a tiveRe a 1time PCR）就是一种在 DNA 扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量得方 法。通过内参或者外参法对待测样品中得特定DNA序列进行定量分析得方法. 荧光定量PCR最常用得方法就是DNA结合染料SYBR Green I得非特异性 方法与T aqman水解探针得特异性方法。本实验中采用非特异性SYBR Gr een I染料法，SYBR

2、Gr e enl就是一种结合于所有dsDNA双螺旋小 沟区域得具有绿色激发波长得染料，在游离状态下会发出微弱得荧光，但一旦与 双链DNA结合后，荧光大大增强.因此，S YBR Green I得荧光信号强度与双 链DNA得数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在得双链 D NA数量。三、实验仪器、材料与试剂实验仪器：PCR仪、荧光定量PC R仪实验材料：MCF7细胞实验试剂:逆转录试剂盒、SYBR GREEN试剂盒四、实验步骤4、1 MCF7 细胞 RNA 提取（RNAi s o P lu s ）1）将生长至80%得MCF细胞消化为单细胞悬液，准备提取RNA：2）9000 g , 2 mi

3、 n离心，弃掉培养基，加1 ml RNAiso Plu s用移液枪反复吹吸 直至裂解液中无明显沉淀，室温（1 5-30C）静置5分钟；3）加入氯仿（RNAi s o P 1 u s得1/5体积量）,盖紧离心管盖，混合至溶液乳化 呈乳口色，室温静置5min；4）12,00 0 g4C离心15分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三 层,即：无色得上清液（含RNA）、中间得白色蛋白层（大部分为DNA）及 带有颜色得下层有机相。5）吸取上清液转移至另一新得离心管中（切勿吸出口色中间层）。6）向上清中加入0、51倍RNAi s o Plu s体积得异丙醇，上下颠倒离心管充 分混匀后，室温下静置

4、10分钟。7）12,OOOg4C离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现RNA沉淀。8）弃上清，加入I ml DEPC水配制得75%乙醇,充分洗涤管盖与管壁，并轻弹管 底，让沉淀浮起来，并静置35 mi n ；9）打开离心管盖，室温干燥沉淀儿分钟。沉淀干燥后，加入适量（可以根据沉淀得多少确定）得RNase free水溶解沉淀。 测浓度，记录A 2 60 / 28 0。4、2 I %琼脂糖凝胶电泳（取少部分进行跑电泳，留足够得量做反转录）4、3 反转录试剂体积（10pl ）RNA500 ngGene s p e c ifi c primers (2pM)1卩1RT p r i me r5 xR

5、ev e r seT rans c r i p t a s e2plM-MLV B ufferdNTP( 1 OmM)0、5p 1R e vers e T r ansc r i p t a s e0、5 plMMLVInhibi t o r (40U/pl)0、5plRNase-F r ee Wate rU p to 10pl反应条件：温度：4 2 C, 45m i n;7 0 C, 15m i n、4、4 qPCR试剂体积(2 0 pl )2xSYB R G r eenlOplFP (1 Opl)0、5plRP(lOpl)0、5 plc DNA TemplatelplR Nase-f r e

6、 e Wat e r8pl反应程序：1） s t ag e 1：预变性，95C,3min：2 ） S tage 2：循环反应：40个循环9 5 C,10s：60C,3 0s3)溶解曲线:9 5 C, 15s： 6 0 0 1 min;95 C, 15s.五. 实验结果及分析5 1 RNA得质量检测结果2 * 001ng / ul2 60 /28 026 0/23049 7 .31、852、055、2扩增曲线:Melt Curve03 0TO 0T3.0BS D2X03.09S DTemporatura (C)Cycle5、3溶解曲线：0.150.130.110.090.070.050.03Q.

7、DI如图，为单一得峰，说明无非特异性产物，泄量准确。5、4实验结果及数据处理PCR反应结束后，得到如下数据：S a mple NameTarget N am eRep o rt erCtCt M e anMCF7miR2 1SYBR16、9795 3 60 616、975761 4 2MCF7m i R21SYBR16、970 2 7 7 79MCF7miR21SYBR16、9 774 704MCF 7m i R1 3ObSYBR22、8 02 0 0 00522、7 5 5 7 907 1MCF7miR130bSY BR22. 724 4 87 3MCF7m i R130bSYBR22、7

8、4 08 8 4 78MCF7GAPDHSYBR13. 84 177781 3、656 0 06 1 8MCF7GAPDHSYBR1 3、5455 36 9 9MCF7GAPDHSYBR13、580703 7 4注：平行样得Ct值之间得差0、5时表示重复性较好计算如下：ACT (miR21) = 3、319755236ACT (miR130b)= 9、0 997 84533AACT=ACT(miR21) -AC T(miRl 3 Ob)=-3. 319755 2 3 69、099784 5 33= -5. 780029 2 972-45=2- 一、顽2929力=0、0181 9 85 9 27

9、miR21得表达量就是miR 1 3 Ob得0、0 18 1 98 5 927倍六问题与思考1、设计本次实验mi R21与m iR130 b得RT-q P C R引物？miR21： T AGCTT ATCA GAC T G ATGTTGA茎环引物：GTCGT ATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT TCGCACTGGATA CGACTCA AC AF Primer： AGCGTAG CTTATCAGACTGATGTTGR Pr i me r ：CGCAGGGTCCGAGGTATTC (通用引物)引物Blast结果：VMmorOLASTInput PCR tnx(e efe愉 :w am

10、eU u叮Mhe revlsHUDetailed primer reportsPrinMir pair 1AOGGTAOCTTATCACTGAIOTTG1評GCM44 10900)0)CCCAGGGTCCGAGGtAI TC19WJf2 ib5WJO)miRl 3 0 b ： CAGTGCAATGATGAAAGGGCAT茎环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG A CATGCCCF Pr i m er: CAGTGCAA TGATG AAAGGGCAR Prime r : CGCAGGGTCCGAGGTAT T C （通用引物） 引物B 1 as t结果:Q Pitmcr-8LASTnonVc初hudcctldB cc4cik inti （Ctoiramto homeDetailed pilmer gportsPrlmor pair :CAOTAATaATGAAAGCACJCAC33OTCCCKQJWTCUMrm6C021”55 5310SH conipwKiUH/ ” QsatOS2 002.荧光定量P CR与普通PCR有什么异同点？原理不同:荧光定量PCR实时监测与DNA结合得荧光染料激发得荧光;普通PCR 通过检测插入DNA中核酸染料得量来测定PC R最终产物量，一般就是紫外光。反应要求不同：荧光定量对扩增片