贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍[稻谷书苑]

1、流式细胞仪流式细胞仪 FLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETER 原理及软件介绍原理及软件介绍 Beckman Coulter流式细胞仪发展史流式细胞仪发展史 u1947年年Wallace Coulter发明了库尔特原理，用于血细胞分析发明了库尔特原理，用于血细胞分析 u1953年推出了世界上第一台流式细胞分析仪年推出了世界上第一台流式细胞分析仪Coulter Counter Model A u1972年推出世界上第一台激光流式细胞仪年推出世界上第一台激光流式细胞仪EPICS II u1975年研制出世界上第一台带计算机的流式细胞仪年研制出世界上第一台带计算机的流式细胞仪 u19

2、97年推出世界上第一台单激光四色数字化流式细胞仪年推出世界上第一台单激光四色数字化流式细胞仪EPICS XL/MCL u2000年首先将高精度数字化颜色补偿技术年首先将高精度数字化颜色补偿技术ADC（Advanced Digital Compensation）应用于流式平台，引领流式进入全新的全矩阵补偿、全自动）应用于流式平台，引领流式进入全新的全矩阵补偿、全自动 补偿和脱机补偿时代补偿和脱机补偿时代 u2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细胞仪年推出世界上第一台单激光五色的流式细胞仪FC500/MCL，2005年升级年升级 为为FC500/MPL u2006年推出世界上第一台具有年推出

3、世界上第一台具有EV参数同时进行无成本绝对计数的多功能细胞参数同时进行无成本绝对计数的多功能细胞 分析系统分析系统Quanta SC， 将流式细胞术与库尔特原理完美结合将流式细胞术与库尔特原理完美结合，2007年推出年推出 MPL进样系统进样系统 u2007年收购年收购Dako公司的公司的Moflo和和Cyan，使，使Beckman公司成为高端流式市场的公司成为高端流式市场的 领导者领导者 u2009年，推出世界是第一台三激光十色的分析型流式细胞仪年，推出世界是第一台三激光十色的分析型流式细胞仪Gallios/Navios EPICS XL-ADC QUANTA SC Cytomics FC5

4、00 Beckman Coulter Celllab Family MoFlo XDP Gallios/Navios Cyan ADP FC500硬件硬件 What is flow cytometry? 流式细胞术是单个细流式细胞术是单个细 胞胞/颗粒流过检测装置颗粒流过检测装置 过程中，检测到的物过程中，检测到的物 理和理和/或化学的特性。或化学的特性。 Howard Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd Edition 分类分类 u分析型：只能分析用，液流进入废液筒分析型：只能分析用，液流进入废液筒 u分选型：回收目标细胞，用于后续实验。要求管分选型

5、：回收目标细胞，用于后续实验。要求管 道绝对无菌。道绝对无菌。 基本原理基本原理 流路（液流系统）流路（液流系统） n流动室 n鞘液SHEATH n样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml 光路（光学系统）光路（光学系统） n光源 n滤片 n光电倍增管PMT HV 电路（电路系统）电路（电路系统） n放大电路HV及GAIN 增益 nA/D转换 分析系统：计算机分析系统：计算机 流路构造流路构造 流流 路路 u 单细胞悬液单细胞悬液 u 大多数仪器是在大多数仪器是在50-300 50-300 m m 大小的孔径中大小的孔径中, ,将细将细 胞悬液注射进入鞘液中胞悬液注射进入鞘液

6、中 u这一过程这一过程, ,成为流体动力学聚焦成为流体动力学聚焦 FLOW CELL Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 光路构造光路构造 光光 路路 光源光源 检测信号检测信号 散射光信号散射光信号 FS: 前向角散射光前向角散射光 SS: 侧向角散射光侧向角散射光(90度散射光度散射光) 荧光信号荧光信号 荧光染料荧光染料 光学滤片光学滤片 光光 路路 u光源光源 与通过的细胞聚焦在同一点上与通过的细胞聚焦在同一点上 u 激光激光 空冷空冷 488nm blue, 633nm red, 325n

7、m UV, 514nm green, 空冷空冷/水冷水冷 Enterprise II 水冷水冷 Innova300系列系列Innova70系列系列 常用激光器及其通道分配表常用激光器及其通道分配表 检测信号检测信号 散射光信号散射光信号前向散射光前向散射光(FS) uFS-Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器为前向散射光检测器 uFS的强度与细胞或其他颗粒的大小的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及形状及 optical homogeneity 有关有关 uFS用于检测细胞或其他粒子的表面属性用于检测细胞

8、或其他粒子的表面属性 如如:大小大小 FALS Sensor Laser 前向散射光前向散射光 前向散射光前向散射光 散射光信号散射光信号 侧向散射光侧向散射光 uSS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称也称 为为90度散射光检测器度散射光检测器 uSS用于检测细胞内部结构用于检测细胞内部结构 如如:胞浆内颗粒多少胞浆内颗粒多少, 核质比核质比 FALS Sensor 90LS Sensor Laser 侧向散射光侧向散射光 侧向散射光侧向散射光 90 Degree Scatter 0 200

9、400 600 8001000 Forward Scatter 0 200 400 600 8001000 8 15 20 30 40 50 100 200 1000 Lymphocytes Monocytes Neutrophils Side Scatter Projection Forward Scatter Projection Light Scatter Gating Scale 光路光路-荧光信号荧光信号 u每种荧光染料均有特定的激发波长每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会并激发后会 有发射波长有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射流式细胞仪检测的即是它特定的发射 波长

10、波长. u 利用各种不同波长的光学滤片来收集利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测检测)这些这些 光学信号光学信号 荧光染料的特性 激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION) 常用荧光染料的特性 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红 PI 488 620 DNA染色 橙红 PECy7 488 755 免疫荧光 深红 PerCP 488 670 APC 633 670 5 Color Si

11、ngle Laser (488nm) FITC/PE/ECD/PC5/PC7 荧光染料比较荧光染料比较(平均荧光强度平均荧光强度) Q-Prep / ImmunoPrep 试剂系统试剂系统 PerCP APC FITC ECD PC5 PE CD8-FITC CD8-PECD8-ECD CD8-PC5CD8-PerCPCD8-APC Freq Fluorescence FALS Sensor Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS) 光路光路 - 滤片特性滤片特性 u 长通滤片长通滤片 允许长于设定波长的光通过允许长于设定波长的光通过 u

12、短通滤片短通滤片 允许短于设定波长的光通过允许短于设定波长的光通过 u 带通滤片带通滤片 允许一定带宽的波长通过允许一定带宽的波长通过 光路光路 - 滤片特性滤片特性 u 当以当以 45o 角角放置滤片时放置滤片时,该滤片可以通过一定波该滤片可以通过一定波 长的光长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光同时也可以阻断并折射该波长以下的光 u这种方式的滤片称为二向色性滤片这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter) 滤片滤片 u带通滤片带通滤片 BAND PASS (BP)BAND PASS (BP) l只允许某些波长的光通过只允许某些波长的光通过 u二向色性滤片二向色性

13、滤片 DICHROIC FILTERDICHROIC FILTER l一定波长以上通过，该波长以下折射一定波长以上通过，该波长以下折射 630 nm BandPass Filter Transmitted Light White Light Source 620 -640 nm Light Dichroic Filter/Mirror at 45 deg Reflected light Transmitted Light Light Source Optics - Detectors lPhotomultiplier tube (PMT) n 将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号 不同的脉冲信号被转换成数字通道不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程的过程 Log FITC 1000 100 10 1 11 0 .1 C