核移植技术与动物克隆[稻谷书苑]

1、第六章第六章 核移植技术与动物克隆核移植技术与动物克隆 山东师范大学生命科学学院 1教育教学 一、什么是动物克隆？一、什么是动物克隆？ 动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的 技术。发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体 细胞，经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中 之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚 胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中， 可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的经过核移植而产生的 动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不这种不 经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传

2、结构 与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克 隆。隆。 2教育教学 核移植技术：核移植技术：所谓核移植技术就是利用显微操作技所谓核移植技术就是利用显微操作技 术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两 个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造 无性杂交生物新品种的一项技术。无性杂交生物新品种的一项技术。 3教育教学 胚胚 胎胎 克克 隆：隆：使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段 的胚胎，叫做的胚胎，叫做胚

3、胎克隆胚胎克隆。 体细胞克隆：体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动物体，叫做使用的核供体细胞来自动物体，叫做 体细胞克隆体细胞克隆。 4教育教学 5教育教学 6教育教学 7教育教学 8教育教学 二、两栖类细胞核移植 1938年Spemann最先提出将多细胞胚胎的每一个细胞核移植到 去掉核的卵母细胞中，使它们重新发育成胚胎的设想。 1952年，Briggs和King沿用Spemann的思路和实验技术，首次 获得两栖动物美洲豹蛙胚胎细胞核移植的后代 核供体为囊胚期的胚胎细胞实验成功 核供体为原肠胚期的中胚层和内胚层细胞实验失败 9教育教学 n1958年到年到1962年，英国剑桥大学的年，英国剑桥大学

4、的John Gurdon和和Machineer利用爪利用爪 蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾 n1970年年John Gurdon以同样的方法，用青蛙脚蹼角质化细胞进行移核以同样的方法，用青蛙脚蹼角质化细胞进行移核 试验，蛙卵发育成了蝌蚪。试验，蛙卵发育成了蝌蚪。 10教育教学 三、鱼类的核移植 从1961年开始，童第周等以金鱼和鳑鮍 鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移 植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细 胞核在发育功能上的差异，以及细胞质对细 胞核的影响 11教育教学 1979年，中国科学院武汉水生物研究所 利用鲫鱼做移核试验。

5、他们把鲫鱼囊胚期细 胞经过385天59代连续传代培养后，再将此 种培养细胞的细胞核移植到同种鲫鱼的未受 精卵中。到1980年4月，他们成功地培育了 两尾无性繁殖的幼鱼，其中一条发育正常。 12教育教学 1989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细 胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同 种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核 鱼”新品种。 13教育教学 四、哺乳类的细胞核移植 1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实 验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只 单亲小鼠。 14教育教学 u将卵细胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后 放入加有适量细胞松驰B的溶液中。 u经此番处理的卵细胞的染色

6、体复制后出现了两个核，将此 双核细胞放入正常培养液中培养。 u卵中的双核细胞自动融合，并且细胞开始分裂。 u将此种胚胎移入母鼠子宫培育。 u生产出7只单亲小鼠。 15教育教学 1981年，瑞士日内瓦大学和美国杰克逊实验室 合作，首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。他们 将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经 培养移核卵发育至囊胚期，再将此胚胎移入同步孕 鼠子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可 育的个体。 16教育教学 17教育教学 五、核移植技术的一般操作程序五、核移植技术的一般操作程序 核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主要 包括核受体和核供体的处理和制备、核移植、 重组胚的体外或体

7、内培养、核移植胚胎移入 代孕母畜（寄母）等步骤 。 18教育教学 1 1核受体细胞的准备核受体细胞的准备 去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。这是因为在 卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中所含 有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了的细胞重新回 到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程。 卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超 排处理，从输卵管冲出体内成熟的M卵母细胞。二是从屠宰 场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，在 体外培养成熟后作为受体。 19教育教学 2核供体细胞的准备核供体细胞的准备 20教育教学 3 3细胞核移植细胞核移植

8、21教育教学 4激活激活 卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精引起的卵卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精引起的卵 母细胞激活还是人工的激活，都会引起卵母细胞发生一系列母细胞激活还是人工的激活，都会引起卵母细胞发生一系列 的反应，这些反应是胚胎发育所必需的。其激活原理是通过的反应，这些反应是胚胎发育所必需的。其激活原理是通过 电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MIIMII期中解放出来，期中解放出来， 并转到并转到“受精受精”的状态。的状态。 22教育教学 5重组胚的体内或体外培养重组胚的体内或体外培养 经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体

9、外培养，经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养， 观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养 方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入 休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d4-7d，发育至桑椹胚和，发育至桑椹胚和 囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内 培养培养7d7d，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔

10、的核移植胚多作体外培 养，发育至桑椹胚或囊胚。养，发育至桑椹胚或囊胚。 23教育教学 6 6胚胎移植胚胎移植 重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种 不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理， 按常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。 24教育教学 六、六、 核移植技术的应用核移植技术的应用 1制备转基因克隆动物，制备转基因克隆动物， 进行生物药物生产；进行生物药物生产； 2培育优良畜种，扩大良种种群培育优良畜种，扩大良种种群 ； 3开展异种动物克隆，拯救濒危动物；开展异种动物克隆，拯救濒危动物； 4与干细胞技术结合，开展治疗性克隆与干细胞技术结合，开

11、展治疗性克隆 5利用核移植技术，研究生物学的基本问题利用核移植技术，研究生物学的基本问题 。 25教育教学 七、克隆羊与体细胞核移植 26教育教学 a.胚胎細胞株胚胎細胞株, b.胚胎纖維母細胞胚胎纖維母細胞 c.乳腺上皮細胞乳腺上皮細胞, d.PCR microsatellite 27教育教学 28教育教学 第一步第一步 取妊娠期的6岁母绵羊（Finn Dorset白品种母羊） 的乳腺细胞作核供体细胞，用饥饿法使其进入休眠 状态而使全部基因具有活性。 29教育教学 第二步第二步 注射促性腺激素，促使母羊（Sottish Blackface黑 面母绵羊）排卵，2833小时取其未受精卵，快速去

12、核，放入10%FCS、1%FCS和0.5%FCS连续5天，使其 进入G0期做受体细胞。 30教育教学 第三步第三步 乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中，在微电 流的作用下，将乳腺细胞融入卵中，形成一个含有 新的遗传物质的卵细胞。 31教育教学 第四步第四步 新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6 6天天 后发育为桑椹胚或囊胚（后发育为桑椹胚或囊胚（816816个细胞）。个细胞）。 32教育教学 第五步第五步 将此早期胚胎移入假孕母羊子宫中，产下多利 即为6岁母羊的复制品，也为白色。 33教育教学 34教育教学 35教育教学 为何是突破性的工作：为何是突破性的工作：

13、 第一，解决了使供 体细胞与核受体细 胞（去核卵细胞） 同步的方法。 第二，解决了用体 细胞做核供体与转 基因的问题。 36教育教学 这一成果的重要生物学意义：这一成果的重要生物学意义： 第一，它证明了一个已经完全分化了的动物体 细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并 且经此技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性形 成完整个体。 37教育教学 第二，多利是世界上首例利用成年哺乳动物体 细胞作为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复 制品。它的成功提示我们可以进一步做到，在培育 体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术精确 地诱发核基因的遗传改变或精确地植入目的基因， 再用选择技术准确地挑选那

14、些产生了令人满意变化 的细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。也就 是说，我们可以按照人的意志去改选、生产物种。 38教育教学 第三，在现代生物学领域中，沿有任何一项研 究成果能够比通过对基因进行有规律地控制而解决 更多的问题的先例。多利羊的诞生及生长表明，利 用克隆技术复制哺乳类动物的最后技术障碍已被突 破，在理论上已成为可能。 39教育教学 八、克隆技术存在的问题 理论问题理论问题 分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭， 细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚； 克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。 克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。 在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。 40教育教学 实践问题实践问题 克隆动物的成功率还很低克隆动物