病理制片过程

1、目前能做病理组织切片的地方很多，但要数上海舜田生物做出的病 理切片相对质量上比较好， 该公司有 1 位专业从事病理实验的老师及相关实验技 术人员，积累了丰富的实验经验，所作出的切片及染色效果相当不错。1 正确处理标本的重要性固定正确的固定是病理制片技术中最重要的一步， 这个步骤会影响到后续的每 个环节。如果固定不充分，样品的质量就会有欠缺。组织必须在 选定的固定剂 中浸泡足够长的时间， 使大分子保持固有形态。 正确的固定可以防止样品在脱水 剂中发生变性以及后期处理步骤对于样品造 成的损害。固定不充分可能增加切 片的困难，表现出过度收缩，并且会导致细胞核染色不足和 / 或胞核呈现“泡沫” 状。巨

2、检样品需要修切成薄片， 并尽可能做到均匀， 否则很难在切片机上切出好的 片子。如果样品太厚以至于无法渗透充分， 则必须经过再次处理 才能进行切片。 这样会影响样品的质量， 更浪费时间。 从最初的步骤开始就正确处理会使后面的 工作更简单，因此在大体取材的时候多花 些功夫会为以后的步骤节省大量时间 和精力。备注：包埋盒塞满组织且组织过厚就无法很好的固定， 后续的处理步骤也会效果 欠佳。脱钙为了后期进行石蜡包埋切片， 骨组织需要进行脱钙， 钙必须被完全去除才 能确保切片的完整，并且可以防止刀具的损坏。在用酸溶液进行 脱钙之前，骨 组织必须经过彻底的固定， 这样其中的软组织成分才能够被保护， 且防止细

3、胞核 在酸的作用下被破坏，比如蛋白质水解作用 。组织处理（脱水）组织经过一系列经典的处理过程， 是使原本亲水性的组织最终可以用疏水性的介质进行包埋，比如石蜡，火棉胶和绝大多数树酯。 备注：样品无论是处理不充分还是处理过度，都可能导致切片效果不理想。脱水机 旋转升降式脱水机目前仍有一些病理工作者使用，但是全自动全封闭负压 /压力式脱水机逐渐占据主导地位。后者更有利于保护工作环境 ，更确保组织和 试剂的充分作用， 可以更有效缩短脱水时间。 一些更先进的全自动全封闭脱水机 还可以自动记录 试剂的使用情况，并对试 剂进行智能监控和更 换。有一点非常重要，就是处理过度对组织造成破坏绝对不亚于处理不充分造

4、成 的后果。多种因素，比如试剂的种类，处理步骤的多寡，处理 时间的长短，试 剂的清洁度以及加热、 真空和/ 或压力的使用都会影响具体某个样品的处理程度。 注：不同来源和不同大小的样品最好不要共用同一个处理程序， 这样可以避免其 中部分样品处理过度，而部分处理还不充分。处理步骤：（一）脱水：脱水的关键就是将样品置于脱水试剂中足够长的时间，其中的游离水分子被除 去，但是脱水时间也不宜过长，否则结合水分子也会被除去 ，会导致结构的变 化。而脱水时间过短致使水分还残留在样品中， 就会导致包埋介质无法很好渗透 入样品。但是，脱水过度会导致样品的 皱缩变脆。从过度脱水的组织块上切到 的切片，一旦放入水中，

5、切片就会膨胀最后破碎。如果将整个组织块浸入水中， 则组织的表面会因 为水化而膨胀，这样再进行切片，虽然片子的性状会有所改 善，但是形态学会发生改变， 而且染色后会发生色彩偏淡， 对比度较弱。 最常 用 的脱水剂是乙醇和变性酒精。 甲基酒精有毒性， 会破坏肝脏中的甲醛， 因此不太 单独使用。异丙醇是乙醇最佳替代物，常规在微波处理 中使用。丁醇，剧毒， 适用于较慢的组织处理过程，而且多用在植物和动物组织。无水酒精往往会含有水分， 因此最好能检测一下试剂的纯度。 可以用液体 比重计来测定，也可以将几毫升酒精滴入几毫升二甲苯或甲苯， 如果混合液出 现混浊就表示酒精中至少含有 2的水分。（二）透明： 用

6、来进行透明的试剂和脱水剂以及包埋介质必须非常容易混合。 如果组织在透明 剂中时间不够， 那么组织就会发软甚至呈糊状。 略微延长 时间并/ 或定期更换新 鲜溶液可以避免透明不足的问题。最常用的透明试剂如下：二甲苯：目前仍被广泛使用的一种芳香烃类化合物，能够快速替换组织中的乙醇。 在正确的脱水步骤后，芳香烃能够改变样品的折射率并使组织变 透明。当有水 分存在的时候，二甲苯会变混浊， 这时必须更换。作用时间过长会导致组织变硬， 尤其一些纤维、肌肉中枢神经系统或软骨 组织更容易变硬。如果发现组织在完 成处理后变得太硬或发脆，请减少透明的时间或者寻找二甲苯替代物。请注意， 微波处理过程不需要 使用透明剂

7、，可以降低组织处理过度的风险。 二甲苯替代物：苯烯试剂或者短链脂肪酸碳氢化合物 （烷烃） 也得到了快速普及。 苯烯试 剂不会像二甲苯那样使组织发生硬化，但是前者更容易污染石蜡 ，因此石蜡需 要更频繁的更换。 脂肪族化合物更容易渗透入组织， 相对二甲苯而言， 更容易去 除组织中的脂肪。然而，这类化合物不能接 触到水分，因此在比较潮湿的地区 很难使用。 若放弃二甲苯而使用其替代物， 则重新调整处理的时间和溶液循环使 用次数就显得尤为重要 。 其他透明试剂例如苯，甲苯，氯仿和香精油的应用并不多见。（三）浸蜡（石蜡渗透）： 石蜡是石油裂解物的提取物，属于惰性的碳氢化合物的混合物。在脱水机中使用石蜡，温

8、度最好设定在熔点以上 2 4， 在最后一步石蜡渗透完成后， 脱水缸必须用透明剂彻底清洗， 不能有任何石蜡的残留。 负压可以增强渗透的效果，但是在处理活检样本的 时候，负压和加热都必须慎用。另外还需要注意，即便 有些脱水机增加到了 4 个蜡缸，总的渗透时间不能延长。 在确保渗透效果的基础 上 ，组织在石蜡中停留的时间越短越好。石蜡包埋包埋是将正确定位的组织包裹在一种介质中 （此处以石蜡为例） 然后固化。 每个实验室都会创建一套特有的处理方法，这就决定了样品在 处理后的硬度。 用来包埋的石蜡必须能够和样品的硬度相匹配， 这样才能确保进行切片的蜡块质 地尽可能均匀。另外有两点对于切片也至关重要： 温

9、度和样品的定位。 组织包埋机已被广 泛使用，机器最大的优点就是能够在每个步骤上都达到确的温控 。石蜡熔化并 保持熔化状态的这个温度非常重要， 必须确保一些添加剂完全溶解入石蜡。 模具， 样品和石蜡之间的温差必须控制在几度以 内，这样才能确保石蜡充分包围并支 撑样品。已经包埋的模具最好放置在包埋机的冷台上而不是冰块上， 这样可以使 石蜡固化且不产生裂 缝。样品必须进行正确定位， 从而保证正确的面被切到， 但是对于样品和刀刃 接触的方式必须要经过考虑。对于不同类型的样品，有很多种方 法可供参考， 用来正确定位样品。提高包埋效果的技巧 有些石蜡特别适合用于渗透，有些更适合用于包埋，而有些都适合。可以

10、向供应商查询。石蜡应当在高于其熔点2C至4C的温度下进行熔化和储存，这样其中的 添加剂才能溶解入液体。 如果温度太低， 其中一些较重的添加剂， 比如聚合物就 会沉在底部 ，然后最先流出。熔化的石蜡在流出以前最好先进行搅拌。设定包埋机的参数，确保石蜡流出口过夜的时候处于保温状态。经常清空并 清洗流出口。始终确保流出蜡缸的石蜡是过滤后的。和以往的观点相反，将石蜡设定在高温（大约 85 C）持续数星期，反而是 无害的。尽管石蜡中添加了稳定剂，在氧化作用下，石蜡仍然会变质。最初的征兆就 是颜色转变为草黄色直到黄色。随后可能有异味产生。选择尺寸恰当的模具，确保样品的四周都被石蜡包围，样品置于中心。用压

11、平装置或者弯头镊子的背部轻柔地将样品展平（易碎样品可能 会被压碎）。不 要让样品在模具中撑太满。大或硬的样品必须按照一定角度放置在模具中。如果同一个样品包含多种不 同密度的成分，则包埋的时候要确保样品最硬的部分必须最后 接触到锋利的刀 刃。皮肤往往带有毛发，则包埋的时候必须保证毛发最后才被切到。动物样本中，如果组织的来源不同但是切片的性状相似则可以包埋在同一个 蜡块中，比如肝脏和脾脏，脑组织和脊髓。脱钙的骨组织必须包埋在“硬”石蜡中，样品最窄的一端必须位于蜡块的底边，从而在切片的时候，最先接触到刀刃。（见下图）为了切片的稳定性，模具中必须添加足够的石蜡，确保包埋盒至少充盈一半。如果石蜡漏出，那

12、么在蜡块完全固化之前，必须添加石蜡。石蜡添加剂： 绝大多数市售的用于组织学的石蜡是含有添加剂的，目的在于改善切片的质量，改变硬度或者有利于连片。常见的添加剂如下： 蜂蜡降低结晶的大小，增加粘度和附着力。 橡胶降低脆性，增加粘度，有助于连片 其他石蜡降低结晶大小，使质地更平滑，可以在不改变熔点的前提下提高硬度。塑料增加硬度，对硬组织起到很好的支撑作用，得到更薄的切片DMSQ二甲基亚砜）增强渗透（警告！腐蚀性）熔点和凝固点： 绝大多数用于组织学的石蜡是多种石蜡的混合物，这样可以确保的硬度和指定的凝固点。“凝固点”是制造商使用的术语，其实相当于“ 熔点”。这个温 度是指在石蜡中插入小木棒后， 石蜡开

13、始在木棒上凝固的那个温度。 凝固点和熔点温度往往是同一个温度或者在两个温度 之间。 市售石蜡的特性往往根据其添加物和熔点的不同而有一定差异。56C 到58C这个范围被常规实验室中普遍应用。 较低熔点的石蜡（50 C到53 C）往 往有其特殊的应用 一般情况，低熔点的石蜡往往比较柔软，因此更适合包埋较软的组织。进行 较薄的切片比较困难，但是很容易连片。（可以选购质地较硬 但是熔点较低的 石蜡。）相反的，高熔点的石蜡一般比较硬。对于质地较硬的样品，这样的石蜡有更 好的支撑效果，而且很容易得到薄切片，但是连片就比较困难 了。样品夹具在切片以前，完成包埋的蜡块必须固定到切片机的样品夹具上。夹持力必须

14、确保样品能被完全固定，因此蜡块往往会附着在一个支持物上 ，比如塑料包埋 框或者环行样品夹。 在不使石蜡变形且避免造成切片形状不规则的前提下， 用最 大的力量夹持支撑物。请注意，石蜡块必 须牢固附着于支撑物（例如，在包埋 盒中必须有足够的石蜡充填），并且支撑物的背后必须接触实心物体的表面。塑料最常用的支撑物就是简单并独立使用的一次性包埋盒。与市售的模具配套使用，蜡块的平面会很平整，且边缘能在 X和丫轴向上保持平行。用相同方法包埋的一批组织块不需要对表面进行调节或仅需要很小的调节。环行模具也偶尔会用到，其中必须充填足够的包埋剂，而且不能夹持太紧。 圆形的支撑物经常在塑料包埋时使用。木块：这是廉价的

15、包埋盒替代物。尽可能使用硬质木材（避免使用松软的松木）并进行切割以适合夹具的形状。木块的表面可以开槽，从而增加 黏附力。注意： 木制的支撑物在水中浸泡后会膨胀，导致在样品夹上固定效果欠佳。金属： 金属支撑物在塑料包埋时使用较多。金属支撑物可以重复使用，但是相对比较贵，在使用时需要进行 X/Y 向的定位调节。 而且调节这个 平面有一定的难度。如果组织块附着恰当，这种夹具的稳定性非常好。 使用切片机必须遵从最佳的工作秩序，无论使用钢刀还是一次性刀片，切缘必须锋利，并且不能有任何缺口或杂质附着。2. 切片机及相关附件耗材简介切片机的类型轮转式：轮转式切片机有一个控制精确进样的手轮，手轮进行 360的

16、旋转，控制 样品头竖直向下经过刀刃然后竖直向上回到处于最高点的起始 位置。在到达切 片行程最高点的时候， 样品头会按照设定的切片厚度水平向朝前运动， 然后再开 始向下的行程。这类切片机常规进行石蜡 或塑料包埋样品的切片。 平推滑动式：平推滑动式切片机是一种水平向运动的切片机， 其刀架固定不动。 样品位 于刀的下方，进行切片。这种切片机通常用来切特别大或者特别 硬的样品。 平推雪橇式：平推滑雪橇式切片机是一种水平向运动的切片机， 其样品头固定不动。 刀架在样 品的上方运动，进行切片。一些轻型的切片机可以进行常 规切片，而重型切片 机可以用来切特别硬或者特别大的样品。切片机常见的功能回缩功能：无回

17、缩功能：没有回缩功能的切片机，当样品头下降的时候，组织块就经过刀锋， 随后沿同一平面上返回到起始位置，然后样品头按照指 定的厚度前进重复下进 行下一个动作。有回缩功能：带回缩功能的切片机，当样品头向下移动时和无回缩切片机的动作 完全一样，但是在样品头上升时，样品头会离开原来的平面，朝刀刃的反向移动，从而防止样品表面和刀锋接触。这个功能有很大的好处，因为首先可以延长 刀的使用寿命，还可以减少样品表面 可能的摩擦（从而降低热膨胀），并且防 止碎屑积聚在的刀刃背面并确保切片的一致性。安全功能：手轮锁：切片机一般都配备手轮锁，可以将手轮锁定于任意位置，防止机器闲置 期间意外触及手轮，导致人员意外伤害样

18、或品头撞击刀具 。更人性化的切片机 往往还配备第二手轮锁，手轮把手只能被锁定于最高点，便于在切片过程中随时 更换样品或刀具。刀架护刀器：无论钢刀刀架还是一次性刀片架， 都应当配有牢固的护刀器，在更 换样品或机器闲置的时候用户一定要养成良好习惯， 将护 刀器覆盖在刀刃上方， 对人员和刀具都是一种保护。好的的护刀器必须能安全地覆盖刀刃的全长。自动切片机安全性：自动切片机必须有紧急制动装置，防止在自动操作过程中有 意外发生。人性化的切片机往往无法一键启动，必须依靠 组合键才能使马达运 转，这样可以最大限度避免意外启动造成的人员伤害或机器损坏。操作特点：手动：手动切片机不具备电动切片功能。粗修和切片都

19、必须由操作者手动完成。半自动：半自动切片机往往只有一个驱动马达控制进样，没有切片马达。全自动：全自动切片机有两个驱动马达，既能控制粗进样也能进行切片。刀具分类：重复使用型刀要长时间保持刀刃的锋利，刀必须在不同的阶段进行很好的锻造以达到恰当的平衡。质地较软的刀往往刀刃不锋利，而质地很硬的刀比较脆，容易在切 片过程中刀刃崩裂。 经过锻造的刀通常用来切石蜡包埋、 火棉胶包埋、 冰冻和较 软的工业样品。锋利而无暇的刀刃是获得一张好切片的基础。 磨得比较好的刀， 斜面很小， 从侧面观察，斜边笔直，不会出现锥形。斜边上出现锥形会使 刀刃发生弯曲， 导致刀刃只在某个点上贴近蜡块，而其余部分相对远离。所以减小

20、斜面很重要， 否则刀刃更多的区域就需要进行打磨以避 免刀对样品的刮擦。刀刃上的擦痕显 然会影响切片的质量。放大 100 倍对刀刃进行观察，应该看到一道很细的反光， 呈笔直、不间断的 明亮的细线。 不理想的刀刃看上去是不规则并有中断的线条。刀的角度： 刀刃上用来进行切片的区域是由两个相交的平面组成， 叫做切 面。在这两个平面之间形成的夹角叫做斜角，（通常 27-3 2 ），这个角度 通常大于楔角（通常 15- 18）在切片机上进行角度的调节： 当刀安装到切片机的刀架上时， 必须呈一定 角度，这样才能在刀刃接触组织平面的那个小平面和组织块平面 之间形成一个 间隙。这个角度就是间隙角。 在切片机上都

21、一个数字刻度表示间隙角的大小， 这 个读数在不同的切片机上可能会有差别。更 换了不同的切片刀后，这个数值可 能需要调节。寻找合适角度的方法，最好采取试错法。刀片的宽度同样会影响到间隙角。 经过多次磨刀后， 刀的宽度会变窄， 为 了和样品有一个正确的切入点，刀必须被抬高。刀架必须经过调 节，这样被磨 过（变窄）的刀的刀锋必须处在和新（宽的）的刀锋一样高低的位置。 不同的剖面：“ B型刀的剖面略向下凹，刀刃处很薄。现在除了在柔软的石蜡包埋或者火棉 胶包埋切片中使用外，很少再用到。“C型刀是一种剖面为楔形的标准刀具， 两侧面是一个平整的面（剖面为等腰三 角形）。在常规石蜡切片、 冰冻切片、硬质火棉胶

22、和较 软的工业样品切片中使用。“D型刀剖面呈楔形，两条侧边不对称，刀刃非常锋利。这类刀在较硬组织的 切片时使用，例如塑料包埋样品或者较硬的工业样品。不同的长度：重复使用型切片刀有很多不同的长度。 长度在120mm勺短刀 推荐在冰冻切片时使用，160mn和185mm勺勺刀常规 应用于轮转式切片机，而更 长的刀通常在平推式滑行切片机或平推雪橇式切片机。 注：所有的刀都应当表面涂抹油脂后存放，以免生锈。一次性刀片一次性刀片， 采用优质的不锈钢， 由于其便利性和经济性， 在绝大多数实 验室里作为重复使用型刀的替代品。大多数的切片机都带有集成 的刀片刀架， 但是一次性刀片也可以插入安装在标准钢刀刀架上的

23、刀片夹内使用。 宽型和窄型刀片： 一次性刀片通常区分为宽型和窄型， 这就表明了刀的宽度。 大多数窄型刀宽度为 1/4英寸（约6mm，厚度为英寸（约0 .23mm）;也有制造商采用厚度为英寸 （约）的规格。宽型刀大约宽度为 1/2 英寸（约）， 常规的刀片厚度通常在英 寸（约），重力刀片（硬组织切片专用）厚度可达英寸（约） 。实际的尺寸可 能因为不同的制造商会有很大的差别， 其中可能有些刀片在宽度和厚度上无法适 应刀架。请确保刀片和刀架之间兼容性。无涂层 vs. 带涂层：一次性刀片的表面可以带有很薄的镀层或涂层。 不同制造商可能采用不同 的涂层，但是几乎所有的涂层中都会含有聚四氟乙烯（ PTFE

24、 ）类聚合物中的一 种，这是一种类似 Teflon 的环保型涂层。涂层的好处在于可以防止刀刃氧化， 延长刀片的使用寿命并且可以降低 摩擦力从而减少切片压力。但是如果涂层过 厚也会有坏处， 最初的几张切片可能卷曲或者打卷， 给人造成刀片“过于锋利” 的感觉。 当刀 片切过数张片子后， 涂层被磨去部分， 则卷曲的现象会有所改善。 在一些物体的表面摩擦刀片这种方法不是很值得推荐。有时候，降低涂 层所造 成的摩擦反而会导致连片的困难，切片很容易互相分开。无涂层的宽型或窄型刀片和有涂层刀片除了表面缺少保护性涂层， 通常是 一样的，前者往往涂抹优质的油。这种无涂层刀片有时也被称作 “经济型”刀 片，因为它

25、们比有涂层刀片价格便宜。刀刃夹角：绝大多数窄型刀片会有一个大约35的夹角 （ 每个侧面各自夹角则为17½ ） ，而宽型刀片的夹角为 32到 35。在 制造过程中，夹角可能 会有细微的变化。 刀片一侧的夹角甚至可能和另一侧的角度略有不同。 这就可以 解释为什么有时候刀片某一面切片 的效果比另一面好，或者不及另一面。 切片机上的角度调节：不论是嵌入钢刀架内的一次性刀片夹还是一体化的刀片夹都会有一个用 来调节间隙角的读数指示，这个读数在不同的切片机，不同的刀架 可以有所不 同。当使用不同制造商提供的刀片或者使用不同高度的刀片时， 间隙角可能会需 要进行相应调节。确定一个适当的角度最好的

26、 方法可能就是“试错法”。（试 错法即不断尝试并排除错误可能的方法）。刀片压板的状态： 压板的作用是将一次性刀片固定在恰当的位置，因此压力板必须保持清 洁，也不能有任何损坏。如果在压板表面有明显可见的弧度，而这 部分又会和 刀片接触， 并导致刀片发生弯曲。 因此刀刃会以一种不正常的方式接触阻止块的 表面。同样，刀片上的碎屑也会导致同样的效 果。刀夹的夹力：作用在刀片上的压力必须均匀分布在刀片被覆盖的全部长度。 力度必须足 够大以确保刀片的稳定，防止任何可能的振动。但是也不能夹持 过紧，否则会 导致刀片弯曲而切出不规则的切片。 为了达到这种微妙的平衡， 需要在反复实践 中提高技巧。3. 正确的切

27、片技术：人体工程学和因工造成的肌肉骨骼损伤：工作习惯合并日常生活方式很可能导致职业相关的肌肉骨骼损伤，比如腕管综合症，实用的小诀窍：a. 添置一把符合人体工程学的座椅。 调节座椅高度， 保证手可以轻松够到手轮， 且不占用搁 置腿脚的空间。如果脚不能踏到地板，请使 用脚凳。b. 将水浴缸放置在切片机区域旁L型的延伸段，这样只需要稍微转动身体和椅子就可以够到水浴缸，不必频繁倾斜身体。c. 转动手轮最好完成一周的旋转。最好不要以摆动方式摇手轮（即半刀法）。d. 将精确进样手轮的把手的直径增加到英寸（约35mr）包裹把手的材料可以是有弹性并光滑的物质。e. 使手臂尽量贴近身体， 不要将手靠在工作台的边

28、缘或者任何尖锐的表面。 不要将肘部外展 侧伸出。f. 在进行切片时，保持肩膀处于放松的位置。不要扛着肩膀工作。尽量使颈部的肌肉放松。 颈部肌肉处于紧张状态会阻断该区域的血液 循环，导致神经被压迫。g. 经常稍事休息。做体操或者自我按摩以便恢复血液循环并消除紧张。h. 如果可能，尽量采用自动化。切片机的设置：在切片机上设定的切片厚度即表示了手轮旋转一圈后样品头精确进样的距离。但这并不意味每张切片一定是这个厚度。有很多因素都会影 响到切片的厚度，比如温度、切片速 度、切片压力、 刀的角度、 仪器的润滑程度等。 判断切片厚度的最好办法就是在显微镜下观 察。当然 ，有经验的病理技师在切片时，将切片漂浮

29、在水浴缸中，此时就可以随时识别切 片厚度的变化。样品块的放置（水平 vs. 垂直定位）：样品的定位往往由操作者的判断来决定， 但是实际情况往往是样品块的底部先接触到 刀刃，因此定位应当根据这个实际情况出发。如果样品是包埋在塑料包埋盒上的话，应当转 90。确保夹具均匀夹住两个对等的表面， 即包埋的两个侧面。 如果样品夹竖直夹住包埋盒印有标 记的那个 侧面，这会导致一些样品变得不稳定，因为作标记的侧面往往带有角度并且面积 相对较小。如果切片时发现效果很差，可以尝试将样品旋刀的角度：当刀或者刀片安装在切片机合适的刀架上以后， 刀架必须有一定的倾斜度， 这样刀的 夹角才能和样品表面之间形成一个间隙，这就是间隙 角。如果倾斜度不恰当，刀刃夹角会 因为楔入效应而对组织块的表面造成挤压， 就会导致跳片或者厚薄不均切片的产生。 间隙角 的读数在 不同的切片机会有各种差别。 使用不同的刀或者不同的刀片或者更换不同制造商， 都需要对间隙角进行略微的调节。要找倒合适的角度， 最好的办法就是试错法。 修片厚度：在修块的时候一定要非常小心， 避免把蜡块中的组织不小心剥离出来， 切片上就会出 现一个空洞。修块的厚度