醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化

1、 大 学 毕 业 论 文 醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化 breeding of acetic acid bacteria and the optimization of process conditions 2011 年 6 月 01 日 烟台大学 醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化 烟台大学毕业论文任务书烟台大学毕业论文任务书 院（系）：化学生物理工学院 姓名 毕业论文题目醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化 指导教师 具体要求(主要内容、基本要求、主要参考资料等)： 1）认真查阅相关资料，弄清实验目的、意义，搞好整体设计 2）认

2、真探索实验方法，找出实验的关键 3）熟练实验操作技术，保证实验数据的准确性 4）实验数据真实可靠，文献引用要合理，论文撰写要规范 主要参考文献： 1 冯 静, 施庆珊, 欧阳友生, 陈仪本. 醋酸菌多相分类研究进展. 微生物学通 报 sep 20, 2009, 36(9): 13901396. 2 m. ameyama, e.shinagawa, k.matsushita and adachi: agr.biol.chem, 2010, 48: 3099 进度安排： 第 12 周：确定论文题目，布置文献查阅相关事宜。阅读、整理文献，写开题报 告。 第 34 周：进入实验室，熟悉环境、实验仪器。

3、 第 512 周：预试验。正式试验，及整理实验数据。 第 1314 周：论文初稿。 第 15 周：论文修改及定稿。 指导教师（签字）： 年 月 日 院（系）意见： 教学院长（主任） （签字）： 年 月 日 备注： 摘要 本实验从陕西农家醋醅和实验室自制果醋中分离得到两种菌种 a1和 b，以 其为出发菌种，进行诱变以期得到高产酸量的菌株。结果表明：采用紫外诱变处理， 得到 a11和 b11菌株，分别比亲株产酸量提高 18 %和 4.9 %。因起始酒精度、发酵温 度、溶氧量（摇床转速）对醋酸菌的发酵产量有较大的影响。故对 a11和 b11菌株进 行单因素优化，最终得到的最佳条件是： a11 ：初始

4、酒精含量 5 %、摇床转速 150 r/min、发酵温度 28； b11 ：初始酒精含量 6 %、摇床转速 150 r/min、发酵温度 30。 关键词：醋酸菌；分离；紫外线（uv）诱变；单因素试验 abstract: in this study, we got two kinds of strains, a1 and b, from shan xi peasant vinegar and laboratory fermented homemade fruit vinegar in the experiment. started by them as bacteria, we hope to

5、get strains that could make high yield on acid consumption. the results show that: we got a11 and b11 strains by the ultraviolet mutation processing, and their consumption of acid increased by 18% and 4.9 %. starting alcohol degrees, fermentation temperature and oxygen (the speed of the wave bed) ha

6、ve great influence on the acetic acid bacteria fermentation yields. we made single factor optimization on a11 and b11 strains, and we got the best condition is: a11: 5 % of the initial alcohol content, rotation speed 150 r/ min, fermentation temperature 28 ; b11: 6 % of the initial alcohol content,

7、rotation speed 150 r/min, fermentation temperature 30 . key words: acetic acid bacteria, separation, ultraviolet (uv) mutagenesis, single factor test 目目录录 1 前前 言言.1 1.1 概述.1 1.1.1 醋酸菌的简介.1 1.1.2 醋酸菌的培养及保藏.1 1.2 诱变育种.1 1.2.1 物理诱变紫外线诱变.2 1.2.2化学诱变甲基磺酸乙酯(ems)诱变.2 1.3 醋酸菌生产性能的研究进展.3 1.3.1 影响醋酸菌生长的生态因子.3

8、 1.3.2 生产性能的有关研究.3 1.4 果醋的营养保健功能.4 1.5 研究的目的和意义.4 1.6 课题创新点.4 2 材料与方法材料与方法.5 2.1 主要材料.5 2.1.1 样品.5 2.1.2 醋酸菌培养基.5 2.1.3 主要仪器设备.5 2.2 主要操作方法.5 2.2.1 醋酸菌的分离与纯化.5 2.2.2 诱变方法.5 2.2.3 单因素试验.6 2.2.4 醋酸菌的鉴定及检测方法.7 2.2.5 醋酸菌的生长曲线.7 3 结果与分析结果与分析.8 3.1 醋酸菌原始菌株的筛选.8 3.1.1 分离筛选.8 3.1.2 醋酸菌菌株的定性鉴定.8 3.1.3 醋酸菌生长曲

9、线的绘制.10 3.2 诱变育种.11 3.2.1 紫外线诱变的菌株筛选.11 3.2.2 ems 诱变的结果筛选 .15 3.3 醋酸菌产酸量的影响因素.17 3.3.1 单因素试验设计.17 3.3.2 单因素实验设计检验.21 3.3.3 小结.22 4 结结 论论.23 结论与展望结论与展望.24 参考文献参考文献.25 致致 谢谢.26 1 前 言 1.1 概述 1.1.1 醋酸菌的简介 醋酸菌是一大群革兰氏染色阴性、严格好氧的细菌的总称。醋酸菌最显著的特征 是，在有氧条件下，能将乙醇氧化为乙酸(asia 属除外)。在将乙醇氧化为乙酸后，大 部分醋酸菌还可进一步将乙酸或乙酸盐氧化为c

10、o2 和h2o1。根据能否将乙酸盐和乳 酸盐氧化为co2 和h2o 的能力及鞭毛类型，将醋酸菌分为醋杆菌（acetobacter）和 葡萄糖氧化杆菌（gluconbacter）2。醋酸菌具有多种形态特征，细胞从椭圆到杆状， 单生、成对或成链排列。细胞大小为（0.8 m1.2 m） （1.5 m2.5 m） 。细胞运 动或不运动，若运动则具有周生鞭毛或极生鞭毛这两种类型鞭毛。专性好氧，是需氧 细菌的代表，其中一些能产生色素或纤维素36。 1.1.2 醋酸菌的培养及保藏 醋酸菌适宜的碳源是葡萄糖、果糖等六碳糖，其次是蔗糖和麦芽糖等，不能直接 利用淀粉、糊精等多糖类。酒精、甘油和乳酸是极其适宜的碳源

11、。培养醋酸菌的培养 基需要含糖和酵母膏(vb)，另外添加酒精以适应代谢，加碳酸钙以中和其代谢所生成 的醋酸，保证其繁殖的旺盛。常用培养方式有两种：（1）原菌试管培养，是将培养 基做成试管斜面，接种后于30 32 恒温培养箱内培养48 h，保存于0 4 冰箱， 一般在半月内传代一次。 （2）三角瓶扩大培养，是将液体培养基装入三角瓶中，无菌 操作加入酒精，每只试管斜面接34瓶于恒温培养箱培养5 d 7 d，也可摇床培养24 h，一般测定酸度达到1.5 %2 %即成熟。 在食醋的生产中，醋酸菌菌种多半采用固体斜面的方式进行保藏。但是用这种方 法保藏的醋酸菌退化快，生产性能也不稳定7-9。因此可以将菌

12、种接入20 %甘油中， 用冻干管零下20 保藏，如此可以保藏约六个月，可以防止多次传代引起的菌种退 化。 1.2 诱变育种 诱变育种是通过诱变剂处理菌株，是当前菌种选育的一种重要方法10。提高菌 种的突变率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株。诱变育种和其他育 种方法比较，具有速度快、收效大、方法简便等优点，在生产中应用极其广泛。但是 诱发突变缺乏定向性11，因此诱发突变必须经过大规模的筛选才能得到显著的效果。 诱变育种技术包括两个环节：一是以合适的诱变剂处理大量而分散的微生物细胞 悬浮液，在引起绝大多数细胞致死的同时，使个体在恶劣环境中的变异频率大大提高； 二是设计一种有效的筛选方

13、法淘汰负向变异菌株，并把正变株中少数变异幅度最大的 具有优良性状的菌株巧妙地挑选出来12。可以说目前工业上所用的高产菌株大部分 都是通过这种方法获得的，而且这种方法在抗生素菌种改良中仍是方便、经济有效的， 尤其适用于对那些遗传背景、生物合成途径还不甚清楚的抗生素产生菌；使用该法可 以阻断不必要的酶活力，起到解除负调控、增加基因剂量的作用，不仅可使抗生素产 量得到提高，而且可能使其利用原材料的成本得到降低。 成功的诱变育种需要：1）处理可用于筛选的大的微生物群体；2）预期的特性突 变率高；3）可以用视力诊断或简单测定鉴别突变的有效方法。 1.2.1 物理诱变紫外线诱变 物理因素中目前使用得最方便

14、且十分有效是紫外线，而其此种诱变方法有很多先 例，可以予以借鉴。用紫外线诱变醋酸菌，能使其产量有稳定的提高13。 紫外线是波长 136390 nm 的短于紫外波长的射线，它是一种非电离辐射，能使 被照射物质的分子或原子中的内层电子提高能级跃迁到能量高的外层轨道（称为激发） ，导致分子的理化变化。紫外线辐射最主要的则是引起 dna 形成嘧啶二聚体，他会 阻碍双链的解链和复制，阻碍碱基的正常配对，从而导致基因突变14。它的遗传效 应主要是引起 gcat 的转换或移码突变。由于存在光复活作用，即白光照射能活 化光激活酶并将嘧啶二聚体解而使 dna 恢复正常，故辐照和处理后的培养应避免可 见光照射（应

15、在红光下操作）15。 测定紫外光的剂量有直接法（以尔格/平方毫米表示绝对剂量）和间接法（以辐 照时间或致死率作为相对剂量）两种。微生物所受射线的剂量决定于灯的功率、照射 距离和时间16。如果功率和距离是固定的话，则剂量就和照射的时间成正比，故照 射时间的长短可作为相对剂量。一般用 15w 的紫外灯，距离固定在 30 cm 左右，挑 选出致死率达到 90 %99.9 %所需的辐射时间进行诱变处理。 但各类微生物所需的最适时间不同，一般营养体需要辐照 35 min，芽孢要 10 min，芽孢杆菌的营养体则要 13 min，革兰氏阳性菌和无芽孢菌较易杀死，用 30 s， 放线菌的分生孢子用 30 s

16、2 min 17。 辅射同时要有电磁搅拌设备，以求照射均匀，尤其在菌液浓度较大或菌体、孢子 等较大而重时很容易在处理期间发生沉降，此时电磁搅拌更显重要。照射前紫外灯宜 先开灯预热 2030 min，使光波稳定。 1.2.2化学诱变甲基磺酸乙酯(ems)诱变 ems，即甲基磺酸乙酯，是一种烷化剂，自 1953 年 kolmark 首次发现 ems 的 诱变作用后，ems 便被广泛地应用于动物、植物和微生物育种中，并取得了显著的 成果。但其尚未应用于醋酸菌的诱变育种，故对其在此领域应用的研究具有一定的科 研价值。 （1） ems 诱变育种原理 甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulpho

17、nate，简称 ems)，是一种改变 dna 结构烷化剂， 对生物系统作用的重点主要是核酸，对修复酶的钝化也有一定的作用它与 dna 中的 磷酸嘌呤、嘧啶作用，使之突变。主要原因是烷化剂具有一个或多个活性烷基，这些 烷基能被转移到其他分子上置换氢原子，发生烷化作用。烷基化位点主要在 g(鸟嘌 呤)的 n7 位置上，由于上 n7 的烷基化，使之成为带一个正电荷的季铵基团。这个季 铵基团产生两个效应:一是促进第一位氨基上氢解离。使 g 不再与 c 配对而与 t 配对， 从而造成 gc-at 转换。二是 n7 成为季铵基团后，减弱了 n9 位上的 n-糖苷键， 而产生了去嘌呤作用。大部分的无嘌呤位点

18、都可以被无嘌呤内切酶系统所修复，但是 有时复制在修复之前进行，则在无碱基位置上可以通过插入任何一个碱基，在第二轮 复制以后，则原来的 gc 对可以变为任何碱基对 gc、cg、at、ta，既 有转换，又有颠换。此外，它也可与核苷结构的磷酸反应，形成酯类而将核苷酸从磷 酸与糖分子之间切断，产生染色体的缺失。总之，碱基熔化后易从 dna 链上裂解下 来，造成 dna 的碱基缺失及修补，从而引起突变18-20 。 （2） ems 诱变突变体的鉴定 目前常用的鉴定方法有：形态学方法、细胞学方法、诱变与离体培养技术相结合 方法、生理生化方法、现代分子生物学方法、遗传学方法等21，特别是随着分子生 物学的发

19、展，人们逐渐将从分子水平对变异体进行早期鉴定，其中分子标记辅助选择 技术具有准确、有效等优点，从而减少了选择群体和缩短育种时间。 （3）ems 诱变前景 在今后一段时期内，如何提高诱变频率和选择效率仍是 ems 研究的关键问题，我 们在进一步发挥诱变育种的特长与优势的同时，有必要从各个方面进行深入研究诱发 突变的机理，以提高诱变频率，并结合分子标记及其它生物标记技术，提高选择效率。 1.3 醋酸菌生产性能的研究进展 1.3.1 影响醋酸菌生长的生态因子 醋酸菌的生长需要适宜的生态环境，不同的生态环境，必将影响其正常的活动规 律及其代谢能力，影响醋酸菌生长的因素主要表现在以下几个方面： （1）

20、温度 温度是醋酸菌代谢的主要调节因素，是醋酸菌生长繁殖和产酸的必要条件。醋酸 菌的最适生长温度为 2537。但是微生物生长速度最快时的温度未必是发酵积累 产物最多的温度22。 （2） 初始酒精浓度 酒精是醋酸菌生长代谢所需能量的提供者，但较高的酒精浓度对醋酸菌的生命活 动有一定的抑制作用23，因此，在醋酸发酵过程中要根据醋酸菌耐酒精的能力，将 酒精浓度控制在一定的范围内。 （3） 溶氧量 醋酸菌为严格好氧微生物，只有在有氧的条件下才能生长。生产中只有通气良好， 才能正常发酵。在含有较高浓度乙醇和醋酸的环境中，菌种对缺氧非常敏感，中断供 氧会造成菌体死亡。 1.3.2 生产性能的有关研究 醋酸菌

21、只有在合适的条件下才能生长和发酵良好，故在人工培养醋酸菌时，要了 解菌种性能以控制合适的发育和发酵条件，取得较好的发酵效果。黄仲华等对所分离 出的优势醋酸菌进行了耐乙醇能力、分解乙酸盐能力、耐食盐能力和耐高温能力的试 验研究；祖国仁、施安辉等对分离出的优势醋酸菌进行了产酸速度、耐酒精度、耐温 度、酒精转化率等性能的试验研究；国外用多种不同菌种混合发酵，不仅发酵速度加 快，还能形成其他有机酸与酯类物质，增强了产品的香味和固形物成分。 1.4 果醋的营养保健功能 食醋含有丰富的有机酸、糖分、氨基酸、b 族维生素和水溶性钙、磷、铁、锌、 等矿物质，以及醇、醛、酚、酯等微量成分。现代营养学、医药学研究

22、表明，醋对人 体健康有很多益处24 水果中含有丰富的糖资源，是酿醋用的上等原料，与粮食醋相比，果醋的营养成 分更为丰富25。果醋中富含有机酸、醇、酷类等以及维生素、氨基酸和矿物质，这 使得果醋具有丰富的营养价值，且有多种保健功能，如可预防高血压、高血脂，促进 血液循环、增强钙质吸收、延缓衰老、开胃消食等功效29。 1.5 研究的目的和意义 我国是水果生产大国，而且果醋及果醋饮料逐渐兴起为第四代饮料产品，将有巨 大的市场发展潜力。但水果实际加工量很低，水果加工滞后于种植业的发展。开发高 质量的果醋及果醋饮料，不但可以节约粮食，充分利用水果资源，还可以解决水果销 路难的问题，增加果农收入。同时，开

23、发高质量的果醋及果醋饮料对提高我国水果资 源综合利用价值，发展我国的水果加工业有一定的帮助。综上总结则选育高产醋酸菌 为重中之重。 正如所有发酵工业主要是利用微生物的转化作用一样，食醋中微生物及其酶的作 用对发酵制品质量及风味也有重要的影响。总结目前食醋生产现状，存在如下问题： (1) 菌种的产酸量不够高，因此导致大生产过程中原料的损失较多，导致成本高； (2) 菌株发酵过程代谢产物过于单一，导致成品醋的口感不良； (3) 醋酸发酵条件的不确定，造成发酵浪费。 故此，微生物高产菌种的选育及其优良特性的充分发挥，对酿醋工业尤为关键。 传统食醋酿造在漫长一个历史时期，是利用自然界野生的有益微生物，

24、产品质量高低 不一，质量没法保持稳定 。因此设法提高醋酸菌的生产质量是当务之急。 1.6 课题创新点 传统的诱变方式主要有亚硝酸诱变处理、吖啶橙诱变处理、5-溴尿嘧啶诱变处理、 2-氨基腺嘌呤诱变处理、盐酸羟胺诱变处理及紫外线诱变处理等，都取得了不错了效 果。本课题首先是采用了传统的紫外诱变处理菌种，第二种诱变方法是采用了甲基磺 酸乙酯（ems）诱变育种，ems 诱变其他菌株如酵母菌或者植物如玉米等已有很多 先例，但是用于醋酸菌的诱变育种是首例，经过对其他实验的总结进行醋酸菌的 ems 诱变的尝试实验设计，其诱变结果充分验证了此种育种方法用于醋酸菌株的可 行性。 2 材料与方法 2.1 主要材

25、料 2.1.1 样品 陕西农家醋醋醅、实验室自制果醋以及分离出的菌种 2.1.2 醋酸菌培养基 基础培养基：1 % 酵母粉，1 % 葡萄糖，ph 4.5，0.1 mpa 灭菌 20 min，使用前 加入 3 % （v/v）无水乙醇。 分离培养基：1 % 酵母粉，1 % 葡萄糖，1 % 碳酸钙，1.5 % 琼脂，ph 4.5，0.1 mpa 灭菌 20 min，使用前加入 3 % （v/v）无水乙醇，分装制成 caco3平板分离培 养基。 斜面保藏培养基：1 % 酵母粉，1 % 葡萄糖，1 % 碳酸钙，1.5 % 琼脂，ph 4.5，0.1 mpa 灭菌 20 min，使用前加入 3 %（v/v

26、）无水乙醇，摆成斜面即为菌种保 藏培养基。 产酸实验培养基：豆芽汁，1 % 葡萄糖，灭菌后加入 4 %（v/v）无水乙醇。 2.1.3 主要仪器设备 hzq-f160 振荡培养箱 中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司 d-ms-直流磁力搅拌器 天津市华兴科学仪器厂 yc-260-l 医用冷藏箱 ba200 生物显微镜 2.2 主要操作方法 2.2.1 醋酸菌的分离与纯化 取 10 g 研磨好的曲样，10 ml 果醋分别放入富集(基础)培养基中进行摇床培养 48 h，得到 10-1的稀释液，10 倍梯度稀释，取 10-3，10-4，10-5稀释度的样品稀释液

27、涂 布于平板分离培养基上，每一稀释度涂布三个平板，每个平板用 0.1 ml 稀释液，涂 好后 300.5 倒置培养 48 h，挑取 hc 值（溶钙圈与菌落直径之比）较大，菌落丰 厚的单菌落。然后进行划线分离得到纯种菌株，接种于斜面保藏培养基中，300.5 培养 24 h 后保藏于 4 冰箱备用。 2.2.2 诱变方法 2.2.2.1 紫外诱变 采用紫外线照射诱变的方法，对分离出的菌 a 和菌 b 进行形状改良。诱变筛选 流程如下： 始发菌株 活化 紫外线（uv）诱变处理 分离纯化 初筛 复筛 菌种保 藏 诱变处理过程大致如下： （1）制备菌悬液：将培养好的斜面上的菌株用 5 ml0.85 %的

28、无菌生理盐水洗下， 轻轻震荡，使菌苔打散成乳白色悬浊状，配成一定浓度（1108 cfu/ ml）的菌悬液， 将菌悬液注入无菌培养皿中，置于磁力搅拌器上，搅拌十分钟，制成单细胞菌悬液。 （2）紫外诱变：取以上制备好的平皿置于超净工作台中，距紫外灯 30 cm 处，先不 打开皿盖。紫外灯打开预热 20 分钟，以稳定光波。然后打开皿盖使菌液暴露在波长 为 253.7 nm，15 w 的紫外光下照射，磁力搅拌，力求使细胞均匀吸收紫外光波。采 用不同的照射时间（10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s） 。 （3）涂布分离：避光十倍稀释涂布，用黑布包住培养26，防止回复突变，与同步培

29、养的野生型菌株进行比较。 （4）制作致死率曲线：计算致死率(诱变后减少的菌落数诱变前的菌落数100 %)， 做出致死率-照射时间曲线。依据大量资料，醋酸杆菌在偏低诱变剂剂量（70 %80 % 致死率）的情况下发生正突变的几率较高，故由图均选择 75 %致死率时的诱变剂剂 量进行诱变。 （5）初筛：以最佳照射时间处理菌悬液，取 0.5 ml 进行系列梯度稀释，进行平 板涂布后 300.5倒置培养 48 h。选择 hc 值大的菌株进行定性实验。 （6）复筛：以标准 naoh 滴定法测定总酸量，根据总酸量高低确定优良菌种。 2.2.2.2 ems 诱变 采用化学试剂 ems 诱变方法，对分离出的菌

30、a 和菌 b 进行形状改良.诱变筛选 流程如下： 始发菌株 活化 甲基磺酸乙酯（ems）诱变处理 分离纯化 初筛 复 筛 菌种保藏 诱变处理过程如下： （1）制备菌悬液：将培养好的斜面上的菌株用 5 ml0.85 %的无菌生理盐水洗下， 轻轻震荡，使菌苔打散成乳白色悬浊状，配成一定浓度（1108 cfu/ ml）的菌悬液。 （2）ems 诱变处理：取等量菌悬液加入无菌离心管中，每管 2 ml，离心弃去上 清液后加入 2 ml ph7.0 的磷酸缓冲溶液。加入 40 l ems 原液,放入 300.5 摇床 培养，采用不同的反应时间（10 min、20 min、30 min、40 min、50

31、min、60 min） ， 加入 2 ml 5 %硫代硫酸钠溶液终止反应。 （3）涂布分离：离心弃去上清液并用无菌生理盐水洗涤离心三次后稀释涂布，培 养。与同步培养的野生型菌株进行比较，计算致死率，作出致死率-照射时间曲线。 （4）初筛：溶钙圈法，及醋酸菌的定性定量实验。 （5）复筛：以标准 naoh 滴定法测定总酸量，根据总酸量高低确定优良菌种。 2.2.3 单因素试验 (1) 温度对醋酸产量的影响 分别向温度为 25、28、30、32、35的产酸培养基中接入接种量为 5 % 的菌种，摇床培养，醋酸发酵结束测定其产酸量，并分析不同温度对醋酸菌醋酸发酵 的影响。 (2) 溶氧量对醋酸产量的影响

32、 按照以确定温度的优化条件将醋酸菌按 5 %的接种量接入产酸培养基中，在转速 为 120 r/min、130 r/min、140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min 下振荡培养，醋 酸发酵结束测定其产酸量，并分析不同溶氧量对醋酸菌醋酸发酵的影响。 (3) 初始酒精度对醋酸产量的影响 按照以确定温度和溶氧量的优化条件，分别向初始酒精度为 3 %、4 %、5 %、6 %、7 %、8 %（v/v）的产酸培养基中接入菌种，摇床培养，发酵结束测定其产酸量， 并分析不同酒度对醋酸菌醋酸发酵的影响。 2.2.4 醋酸菌的鉴定及检测方法 2.2.4.1 鉴定方法 (一)采用

33、碳酸钙平板，根据是否有透明圈产生来判断是否产酸，分离出 hc 值较大的醋酸菌，然后进行革兰氏染色及定性实验来具体确定是否为醋杆菌属醋酸菌。 (二)革兰氏染色：将上述试管斜面上的菌株连续活化 2 次，在第 2 次活化 24 h30 h 后，进行革兰氏染色，枯草芽孢杆菌作阳性对照、大肠杆菌作阴性对照。 (三)定性试验：将上述斜面菌株活化 2 次，在第 2 次培养 48 h 后，接种于装 有 10 ml 产酸试验培养液的(18180) mm 的试管中（各接两支） ，300.5 静置培养， 培养 4 d 时各取出一支，3000 r/min 离心 5 min，除去菌体，用氢氧化钠中和，加入 10 %氯化

34、铁 23 滴，在火焰上煮沸，能形成红褐色溶液者为产醋酸的菌株27。 2.2.4.2 检测方法 酸度的测定：标准 naoh 溶液滴定法28。 总酸的测定：酸碱滴定法29。 2.2.5 醋酸菌的生长曲线 菌株接种于产酸培养基中，30 120 r/min 振荡培养，每天补加 1 %（v/v）无水 酒精，每天取样用血球计数板进行菌体计数，绘制醋酸菌的生长曲线，从而确定产酸 定量测定的时间，应在对数中后期或稳定前期进行产酸量测定。 3 结果与分析 3.1 醋酸菌原始菌株的筛选 3.1.1 分离筛选 经过对醋醅和果醋的富集培养、分离纯化和筛选得到如下菌株，其形态特征见表 1 和表 2。 表表 1 醋醅中的

35、产酸菌形态醋醅中的产酸菌形态 tab. 1vinegar grains in the form of acid bacteria 菌体形态 morphology 菌落特征 colony characteristics 编号 number基本形态 the basic form 形状 shape 表面 surface 边缘 edge 隆起形状 bulge shape 颜色 color hc 值 hc value 1# 椭圆，对生 ellipse, opposite 斑点 spotted 光滑 smooth 整齐 tidy 突起 convex 乳黄色 cream 41 2# 短杆，对生 short

36、iron, opposite 圆形 round 不光滑 not smooth 不整齐 irregular 突起 convex 白色 white 52 3# 椭圆，对生 ellipse, opposite 圆形 round 光滑 smooth 整齐 tidy 扁平 flat 乳白色 milky 3.92.7 4# 椭圆，对生 ellipse, opposite 缺刻 nick 不光滑 not smooth 不整齐 irregular 扁平 flat 乳白色 milky 5.65 表表 2 2自制果醋中产酸菌的形态自制果醋中产酸菌的形态 tab.2the morphology of strains

37、 of vinegar made in laboratory 菌体形态 morphology 固体培养菌落特征 colony characteristics of solid culture 编号 number 基本形态 the basic form 形状 shape 表面 surface 边缘 edge 隆起形状 bulge shape 颜色 color hc 值 hc value b 椭圆，对生 ellipse，opposit e 圆形 round 光滑 smooth 整齐 tidy 突起 convex 乳黄色 cream 2.81.2 3.1.2 醋酸菌菌株的定性鉴定 3.1.2.1 形

38、态特征 醋酸菌具有多种形态特征，细胞从椭圆形的到杆状，单生的、成对或成链排列， 菌落特征为乳白色或乳黄色，圆形或斑点状，表面湿润，边缘比较整齐。优良的醋酸 菌产酸量较高，这可以通过溶解碳酸钙产生的溶钙圈的直径与菌落直径之比来判断， 可以看出 1#、2#菌种的 hc 值比较大，即产酸量可能会比较大，其他两种菌的 hc 值 比较小，但是 2#菌种菌落表面不光滑，不符合醋酸菌菌落特征。而且具体产酸量的 大小与 hc 值之比是否符合还有待验证。 3.1.2.2 生理生化实验 挑选出产透明圈的菌株进行革兰氏染色，其染色结果如下各图所示： 图图 1镜检结果镜检结果 1# 图图 2镜检结果镜检结果 2# f

39、ig.1microscopic exam result of 1# fig.2microscopic exam result of 2# 图图 3 镜检结果镜检结果 3# 图图 4镜检结果镜检结果 4# 图图 5镜检结果镜检结果 b fig.3 microscopicexam fig.4microscopic exam fig.5microscopic exam result of 3# result of 4# result of b 从图 1 到图 5 五个照片中可以看出：1#、2#、b 三株菌均为革兰氏阴性菌，且形 状为棒状短杆菌或杆菌且都为对生的，与醋酸菌的特征相符。根据氧化葡萄糖生成

40、葡 糖酸能力的强弱，将醋酸菌分为葡糖杆菌属和醋杆菌属，定性实验即从这两种醋酸菌 中鉴别出醋杆菌属醋酸菌。根据醋酸铁溶液呈红褐色这一现象可以区分。由图 6、图 7、图 8 可以看出上述挑选的菌株只有 1#、b 两种菌有红褐色溶液产生。将 1#改标记 为 a，即该实验的结果为选育出 a、b 两种醋酸菌。 b 图图 6 6 实验结果实验结果 1# 图图 7 定性实验结果定性实验结果 b fig.6 results of 1 # fig. 7results of 图图 8 实验结果实验结果 2# fig. 8 results of 2# 3.1.3 醋酸菌生长曲线的绘制 (1)用显微镜直接计数法测得的

41、菌 a 的生长曲线： 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 02468 图图 9菌菌 a 生长曲线生长曲线 fig.9the growth curve of a 时间/d log10(菌体数目) 由图 9 可知，在开始的 1 d 内，醋酸菌增长较缓慢，此时醋酸菌处于延迟期；从 第 2 d 开始醋酸菌数量激增，到第 4 d 醋酸菌数达到最大，这段时间内醋酸菌处于对 数生长期；第 4 d 到第 5 d 醋酸菌数虽略有下降，但变化不大，此时醋酸菌处于稳定 期；从第 5 d 起醋酸菌处于衰亡期，活菌数不断下降。在稳定前期（即第 4 d）滴定 测其产酸量为 27.42 g/l

42、。 (2) 用显微镜直接计数法测得的菌 b 的生长曲线： 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 051015 图图 10菌菌 b 的生长曲线的生长曲线 fig. 10the growth curve of b 由图 10 可知，在开始的 1 d 内，醋酸菌增长较缓慢，此时醋酸菌处于延迟期； 从第 2 d 开始醋酸菌数量激增，到第 8 d 醋酸菌的数目达到最大，这段时间内醋酸菌 处于对数生长期；第 8 d 到第 12 d 醋酸菌的数目虽略有下降，但变化不大，此时醋酸 菌处于稳定期；从第 12 d 起醋酸菌处于衰亡期，活菌数不断下降。在稳定前期（即 第 8 d）滴定测其产

43、酸量为 64.65 g/l。 3.2 诱变育种 3.2.1 紫外线诱变的菌株筛选 3.2.1.1 紫外线诱变致死率曲线及最佳诱变时间的确定 菌种 a 的致死率-照射时间曲线如下图所示： log10(菌体数目) 时间/d 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 020406080 图图 11紫外诱变对紫外诱变对 a 菌致死率的影响菌致死率的影响 fig.11the death rate of a by using uv mutagenesis 由图 11 可以看出，在 13 s 的时菌 a 的致死率达到 75 %，因此选定 13 s 为最佳 诱变时间。 用同样的方法对菌 b 进行紫外诱变

44、，致死率-照射时间曲线如下图： 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 020406080 图图 12 紫外诱变对紫外诱变对 b 菌致死率的影响菌致死率的影响 fig.12 the death rate of b by using uv mutagenesis 由图 12 可以看出，在 25 s 时 b 的致死率为 75 %，因此选择 25 s 为最佳诱变时 间对该菌种进行诱变。 3.2.1.2 紫外诱变后的初筛 在最佳诱变时间对两种菌株进行诱变，根据 hc 值的大小进行初筛。菌体诱变前 和诱变后的形态见表 3。 表表 3诱变前后醋酸菌的形态诱变前后醋酸菌的形态 tab.3th

45、e form of acetic acid bacteria before and after mutation 编号 number 菌体形态 morphology 固体培养菌落特征 colony characteristics of solid culture 时间/s 致死率/% 致死率% 时间/s 致死率% 时间/s 致死率% 时间/s 时间/s 致死率% 基本形态 the basic form 形状 shape 表面 surface 边缘 edge 隆起形状 bulge shape 颜色 color hc 值 hc value a 椭圆，对生 ellipse, opposite 斑点

46、spotted 光滑 smooth 整齐 tidy 突起 convex 乳黄色 cream 41 a11椭圆，对生 ellipse， opposite 斑点 spotted 光滑 smooth 整齐 tidy 突起 convex 乳黄色 cream 51.3 b椭圆，对生 ellipse, opposite 圆形 round 光滑 smooth 整齐 tidy 突起 convex 乳黄色 cream 2.81.2 b11椭圆，对生 ellipse， opposite 圆形 round 光滑 smooth 整齐 tidy 突起 convex 乳黄色 cream 4.51.3 b12椭圆，对生 e

47、llipse， opposite 圆形 round 光滑 smooth 整齐 tidy 突起 convex 乳黄色 cream 4.01.5 b13椭圆，对生 ellipse， opposite 圆形 round 光滑 smooth 整齐 tidy 突起 convex 乳黄色 cream 4.21.8 通过表 3 的对比发现，诱变后的 hc 值明显变大。此类菌株有可能为高产醋酸菌， 故挑选此类菌株进行定性实验。对 a11、b11、b12、b13进行定性实验结果如下图所示： 图图 13 a11实验结果实验结果 图图 14 b11实验结果实验结果 fig.13results of a11 fig.

48、 14 results of b11 图图 15 b12实验结果实验结果 图图 16 b13实验结果实验结果 fig.15results of b12 fig.16 results of b13 由图 13、图 14、图 15、图 16 的实验结果可以看出，定性实验培养液均变为红 褐色溶液，并与对照培养液形成鲜明对比，故此四种菌均为醋酸菌。但是仅凭定性实 验和 hc 值的大小并不能确定产酸量的变化情况，须通过对如上的几种菌进行复筛实 验以验证诱变的效果。 3.2.1.3 复筛 紫外诱变得到四种新菌种 a11、b11、b12、b13，将四种菌接入定量实验培养基， 于 300.5 下 120 r/

49、min 摇床培养，待菌种到达稳定期后，立即用 0.1 mol/l 的氢氧 化钠溶液滴定酸度。紫外诱变前和诱变后的菌株的生长曲线如下： 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 02468 系列1 系列2 图图 17a、a11生长曲线生长曲线 fig.17the growth curve of a and a11 8 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 05101520 系列1 系列2 系列3 系列4 图图 18b、b11、b12、b13生长曲线生长曲线 fig.18the growth curve of b、b11 、b12 a

50、nd b13 图 17 中系列 1 为诱变前菌株 a，系列 2 为诱变后所得菌株 a11。如图可以看出， 诱变前后两株菌的生长期基本没有变化，只是诱变后的繁殖力增强，因此在对数期， 菌株的数目增大的幅度比较大。与此同时，产生的结果可能是在保证培养基中营养物 质足够用的前提下，产酸量会发生较大的变化。 图 18 中系列 1、2、3、4 分别为 b、b11、b12、b13。如图所示诱变后产生的三株 醋酸菌的生长期基本与诱变前一致，只是繁殖力有所提高，因此单位时间内产生的菌 体数目比诱变前有提高。另外，除了 b12在对数期的增殖速率减小外其他的均变化不 明显，因此，在保证培养基中的营养物质充足的条件

51、下，产酸量均有可能增加。 对以上挑选的菌株进行总酸的测定，其诱变前后的产酸量见表 4。 时间/d log10(菌体数目) log10(菌体数目) 时间/d 表表 4 4诱变前后醋酸菌产酸量比较诱变前后醋酸菌产酸量比较 tab. 4mutation acid production of acetic acid bacteria before and after comparison 编号 number 产酸量/(g/l) the amount of acetic acid (g/l) a27.42 a1132.36 b64.65 b1167.80 b1262.83 b1367.26 由表 4 可

52、以看出，诱变后所得的菌种的产酸量发生了明显的提高。a 菌株的产酸 量有了很大的提高，在原来的基础上提高了约 18 %，b 菌株诱变产生的新菌株中 b11 的产酸量提高最大,约为 4.9 %，b13次之，b12发生负向突变，产酸量降低。 3.2.2 ems 诱变的结果筛选 3.2.2.1 ems 诱变致死率曲线及最佳诱变时间的确定 对菌 a、菌 b 进行 ems 诱变，做出致死率-反应时间曲线，选择最佳诱变时间进 行诱变 。 （1）菌 a 的致死率曲线如下： 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 020406080 图图 19菌菌 a 致死率曲线致死率曲线 fig.19leth

53、ality curve of a 由图 19 可以看出，在约 17 min 时菌 a 致死率为 75 %，因此选择此时刻为最佳 诱变时间对菌株 a 进行 ems 诱变。 （2）菌 b 致死率曲线如下： 致死率% 时间/min 致死率% 致死率% 时间/min 时间 /min 时间/min 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 010203040506070 图图 20b 致死率曲线致死率曲线 fig.20lethality curve of b 由图 20 得菌 b 在约 10 min 时致死率为 75 %，因此选择此时刻为最佳诱变时间 进行 ems 诱变。 3.2.2.2 ems

54、诱变后的初筛 在最佳诱变时间对两种菌株进行诱变，根据 hc 值的大小对诱变后的菌株进行初 筛。其诱变前和诱变后的结果见表 5。 表表 5诱变前后醋酸菌的形态诱变前后醋酸菌的形态 tab.5the form of acetic acid bacteria before and after mutation 菌体形态 morphology 固体培养菌落特征 colony characteristics of solid culture 编号 number 基本形态 the basic form 形状 shape 表面 surface 边缘 edge 隆起形状 bulge shape 颜色 colo

55、r hc 值 hc value a椭圆，对生 ellipse, opposite 斑点 spotted 光滑 smooth 整齐 tidy 突起 convex 乳黄色 cream 41 a21 椭圆，对生 ellipse， opposite 斑点 spotted 光滑 smooth 整齐 tidy 突起 convex 乳黄色 cream 5.01.2 b椭圆，对生 ellipse, opposite 圆形 round 光滑 smooth 整齐 tidy 突起 convex 乳黄色 cream 2.81.2 b21椭圆，对生 ellipse， opposite 圆形 round 光滑 smoot

56、h 整齐 tidy 突起 convex 乳黄色 cream 5.51.5 b22椭圆，对生 ellipse， opposite 圆形 round 光滑 smooth 整齐 tidy 突起 convex 乳黄色 cream 5.01.5 由表 5 可以看出，诱变后所得到的三株菌 a21、b21、b22的 hc 值比诱变前有一定 的改变，即说明诱变后的菌株的产酸量可能会提高，至于 hc 值与诱变后的产酸量变 化是否吻合还需要经过后期的复筛实验予以确认。 对挑选出的 a21、b21、b22进行定性实验，其定性结果如下： 时间/min 致死率% 致死率% 时间/min 时间 /min 图 21 左侧试

57、管为定性实验结果，右侧为未加热的对照组，其他两图均左侧为对 照组，右图为定性实验结果。由实验结果可以看出：a21、b21、b22三株菌种均为醋 杆菌属。 3.2.2.3 复筛实验 ems 诱变得到的新菌种 a21、b21、b22，现需要通过复筛实验选出高产菌株。将 结果同诱变前进行比较，以验证诱变的效果。 表表 6 6诱变前后醋酸菌产酸量比较诱变前后醋酸菌产酸量比较 tab.6mutation acid production of acetic acid bacteria before and after comparison 编号 number 产酸量（g/l） the amount of

58、acetic acid (g/l) a27.42 a2131.40 b64.65 b2165.65 b2263.65 由表 6 可以看出，在诱变后，菌 a、菌 b 的产酸量都有所提高，其中菌 a 的产 酸量发生了较大的变化，而且为正向突变，提高了 14.5 %，菌 b 虽然有变化，但是 变化不大。而且 b22还发生了反向突变。但总的结果还是提高了菌株的产酸量。 图图 22 b21实验结果实验结果 fig.22 result s of b21 图图 21 a21实验结果实验结果 fig.21 results of a21 图图 23 b22实验结果实验结果 fig.23 results of b

59、22 3.3 醋酸菌产酸量的影响因素 3.3.1 单因素试验设计 （1）温度对醋酸产量的影响 将菌种接入产酸培养基中，振荡培养结束后，进行酸碱滴定，分别得到结果如下 表： 表表 7a11耐温度试验设计及结果耐温度试验设计及结果 tab.7test design and results of temperature-resistant by a11 试验号 test no. 温度/ temp/ 乙醇浓度/% alcohol /% 溶氧量/r/min speed/ r/min 时间/h time / h 产酸量/g/ml total acidity / g/ml 125312014426.53 2

60、28312014435.13 330312014429.98 432312014425.26 535312014418.55 表表 8 b11耐温度实验设计及结果耐温度实验设计及结果 tab.8test design and results of temperature-resistant by b11 试验号 test no. 温度/ temp/ 乙醇浓度/% alcohol /% 溶氧量/ r/min speed/ r/min 时间/h time / h 产酸量/g/ml total acidity / g/ml 125312026427.9 228312026431.97 3303120