拮抗化疗药物体外免疫抑制模型的建立及活性成分筛选

1、拮抗化疗药物体外免疫抑制模型的建立及活性成分 筛选以小鼠脾淋巴细胞为试验材料 , 将有丝分裂原刀豆蛋白A(ConA)或细菌脂多糖(LPS)与化疗药物5氟尿嘧啶(5 Fu)联合 使用建立了体外免疫抑制模型，并比较了多糖样品对5 Fu抑制淋 巴细胞增殖的拮抗作用。结果表明 , 在供试样品中 ,F1 1 龙须菜 (Gracilaria lemaneiformis)中分离多糖和BW沪农灵芝1号(Ganoderma lucidum) 子实体中分离 对 5 Fu 产生的轻度抑制有 完全拮抗作用,19号沪农灵芝1号(G. lucidum)子实体中分离 样品刺激淋巴细胞增殖活性最好 , 但对 5 Fu 产生的

2、抑制基本无拮 抗作用 , 表明样品刺激淋巴细胞增殖的活性与拮抗化疗药物抑制 淋巴细胞增殖的活性无正相关性。免疫抑制 ; 化疗药物 ; 多糖肿瘤是危害人类健康的严重疾病 , 对其发生机制及治疗手段 的研究一直是医学领域的热点 1 。目前化疗仍是临床上治疗肿 瘤的三大有效手段之一 , 化疗在杀灭患者体内的癌细胞方面有很 好的效果 , 但均有不同程度的毒副作用 , 如化疗后往往会出现白 细胞减少 , 特别是中性粒细胞减少 , 血小板减少等情况 2, 严重 的会造成人体免疫功能降低甚至是免疫功能缺陷 3, 限制了化 疗药物的使用 , 影响到癌症的治疗效果。 因此 , 寻找能减轻化疗药 物免疫抑制副作用

3、的活性成分 , 对提高化疗药物的治疗效果和扩大其适用范围有重要的意义。研究表明 ,多糖具有免疫调节和抗肿瘤活性 , 其抗肿瘤活性 主要是通过调节机体的免疫功能而间接实现的 4, 实验表明多 糖在减轻化疗药物免疫抑制副作用方面效果明显 5 。如今多糖 药物作为免疫调节剂已经成为辅助化疗、 放疗和手术治疗肿瘤的 重要组成部分。但多糖种类繁多、结构复杂 , 为了更好地对其进 行开发利用 , 需要建立有效的活性筛选模型。常用的筛选减轻化 疗药物免疫抑制副作用的模型多为动物体内模型 6,7, 结果可 信度高 , 但由于其耗时长、 费用高、所需的样品量大等缺点 ,不适 用于大量样品的初筛及样品分离过程中各

4、组分活性的跟踪检测。 若利用高效的体外细胞筛选模型进行初步筛选 , 获得相关的线索 后再进行体内试验验证 , 将能大大提高活性成分的筛选效率。雷 林生等 8 利用不同品系小鼠淋巴细胞相互作用后会引起淋巴细 胞增殖这一特性 , 在细胞水平上考察了灵芝多糖拮抗抗肿瘤药物 免疫抑制作用的效果 ,但该模型应用少、 操作较复杂 ,因此需要建 立方便、有效的筛选体系。5 氟尿嘧啶 (5 Fu) 为临床上常用的化疗药物 , 主要副作用为 骨髓抑制 , 对在体内处于增殖状态的免疫细胞损伤较大。为了筛 选拮抗化疗药物免疫抑制作用的样品 , 本研究取用小鼠的脾淋巴 细胞,通过外加有丝分裂原刺激其增殖 , 模拟体内

5、免疫细胞快速 增殖的状态 ,再与 5 Fu 合用,建立免疫抑制模型。常用的有丝分 裂原刀豆蛋白A(ConA)和细菌脂多糖(LPS)分别刺激T淋巴细胞 和 B 淋巴细胞增殖 , 为考察样品对不同淋巴细胞亚群的影响 , 本 试验选用ConA和LPS两种工具药，建立体外拮抗化疗药物免疫抑 制作用的筛选模型。 该模型的建立为从多糖中开发辅助化疗的药 物奠定了基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品来源供试样品均为本研究室分离纯化得到的多糖。 其中 FB1 为灰 树花 (Grifola frondosa) 子实体中分离获得 ( 制备方法见文献 9),F11 为龙须菜 (Gracilaria le

6、maneiformis) 中分离获得 ( 制备方法见文献 10),BW 、glpds1a 、19号为灵芝 (G. lucidum) 沪 农灵芝1号子实体中分离获得(BW制备方法见文献 11,glpds1a 、 1 9制备方法见文献 12) 。刘艳芳, 等: 拮抗化疗药物体外免疫抑制模型的建立及活性 成分筛选1.1.2 实验动物BALB/c 小鼠, C57BL/6j 小鼠, 购自上海斯莱克实验动物有限 责任公司，许可证号为SCXK沪)2007 0005,812周龄，体重20 25 g, 雌雄不拘。1.1.3 试剂与仪器刀豆蛋白A(ConA)、细菌脂多糖(LPS)、5氟尿嘧啶(5 Fu)均购自 S

7、igma 公司;Alamar Blue Assay kit 购自 Biosource 公 司;RPMI1640培养基、0.25%胰蛋白酶、台盼蓝、胎牛血清 （FBS）购自 Gibco 公司 ; 青霉素和链霉素购自 Amresco 公司 , 其它试剂 均为国产分析纯试剂。Coulter Z series 细胞计数仪 （Coulter Electronics 公司）,Synergy HT酶标仪（BioTek 公司）,CO2 培养箱（Thermo Forma 公司 ）, 倒置显微镜 （Olympus 公司 ） 。1.2 方法1.2.1 试剂配制RPMI1640培养液:取RPMI1640培养基粉末一包，用无菌超纯水定容至1 L,待粉末充分溶解后，加入NaHCO3 2 g,同时分别加 入青霉素和链霉素至其浓度为30卩g/mL和100卩g/mL,用NaOH调节pH至7.2,过0.22卩m滤膜后分装，于4C保存，使用时加 入 10%灭活的胎牛血清。红细胞裂解溶液:9