抗人宫颈癌单链抗体的表达,结构预测及功能分析

1、期刊文献 抗人宫颈癌单链抗体的表达、结构预测和功能分析 B作者：王莹；李旭；陈葳（西安交通大学第一医院 医学实验中心，陕西西安 710061） 摘要：目的扩增、表达抗人宫颈癌单链抗体（ScFv）基因；对ScFv蛋 白进行活性鉴定、二级结构、三维结构预测和理化性质分析。方法采 用基因重组技术构建抗人宫颈癌ScFv基因，进行TG1和HB2151两个原核 体系的表达；SDS-PAGE Western blotting、竞争抑制实验、免疫组化反 应检测 ScFv；用 Antheprot 4.3 软件、Swiss-model、3dpssm 进行蛋白理 化性质分析和立体结构模拟。结果抗人宫颈癌可溶性ScF

2、v大小为32 000左右，与预计蛋白相对分子质量相符；可溶性和展示性ScFv均可与人 宫颈癌细胞株细胞膜表面抗原结合。免疫组化显示能与宫颈癌组织特异性 结合而不与正常宫颈组织和其他肿瘤组织结合。ScFv蛋白等电点预测值为 7.215，属于a + 3蛋白；VH和VL区均有多个蛋白激酶 C磷酸化位点和酪 氨酸激酶II磷酸化位点。三维结构预测显示linker 贴近，使VL和VH形 成一个疏水的“口袋”，这一结构有利于抗原的结合。结论经基因工程 方法制备的抗人宫颈癌 ScFv具有与亲本单克隆抗体相似的抗体活性和特 异性。抗人宫颈癌ScFv构建为进一步构建双特异性ScFv和双功能ScFv基 因创造了条件

3、；其成功的表达为人宫颈癌的早期诊断和特异性治疗打下了 基础。计算机对ScFv蛋白的空间结构的模拟和理化性质的分析为ScFv的 进一步改建和抗原、抗体反应的研究提供了宝贵的资料。 关键词：宫颈癌；单链抗体；二级结构；三维结构 中图分类号：R737.33文献标识码：A文章编号： 1673-4254（2006）01-0016-06 an alysis of muri ne Expressi on, structurepredicti on and functional sin gle-cha in fragme nt variable an tibody aga inst huma n cervic

4、al cancer WANG Ying LI Xu ; CHEN Wei Medical Laboratory Center, First Hospital of Xi an Jiaotong University, Xi an 710061, China Abstract:Objective To amplify and express the gene encoding murine sin gle-cha in fragme nt variable (scFv) an tibody aga inst huma n cervical cancer and predict the sec o

5、n dary structure and three-dime nsional structure of the an tibody. Methods The gene fragments coding for the variable region of the heavy and light chains of scFv antibody against humancervical cancer were amplified respectively using recomb inant DNAtech niq ues from CsA125 hybridoma cells, and sp

6、liced together using a flexible linker to the antibody. The scFv genes were the n cloned into the expressi on vector pCANTAB 5E and expressed in E.coli HB2151 and TG1, respectively. The scFv antibody obtained was assayed using SDS-PAGE,Western blotting,and immun ohistochemical an alysis, with its se

7、c on dary structure and three-dimensionalstructure predicted with Swiss-model and 3dpssm. The physicochemical properties of the an tibody were an alyzed with Antheprot software. Results The expressed scFv antibody was soluble and phage-displayed. The specific binding capacity of the soluble and phag

8、e-displayed scFv antibody to the surface-associatedantigen of huma n cervicalcancer cell line were further con firmed. The scFv an tibody had a relative molecular mass of 32 000 as was con siste nt to theoretical predict ion, with pI of 7.215 and characterized to belong to a + 3 protein. The antibod

9、y contained many protein kinase C phosphorylati on sites and case in kin ase II phosphorylati on sites in both the VH and VL doma ins. Computer graphic modeli ng in dicated that the linker was isolated from the VHand VL domains, which formed a hydrophobic pocket in the molecule to facilitateantigen

10、binding. Conclusions The soluble and phage displayed scFv antibody expressed in E.coli aga inst huma n cervical cancer shows high and specific affinity to the cervical cancer cell line surface-associatedantigen. The con struct ionand an alysis of the molecular model of the an tibody may facilitate f

11、urther studies in engineering of the antibody and exploration of the mechanism of the antigen-antibody interaction. Key words: cervicalcancer; single-chainfragment variableantibody; sec on dary structure; three-dime nsional structure 收稿日期：2005-07-12 基金项目：陕西省自然科学基金项目(99SM52) Supported by Natural Scie

12、nee Foundation of Shaanxi Province (99SM52) 作者简介：王 莹(1971-)，女，在读博士研究生，电话：, E-mail: ywa 通讯作者：李旭，教授，电话E-mail: 宫颈癌是妇女中最常见的恶性肿瘤之一，近年来，虽然诊断和治 疗方法有了飞速的进展，但是如何提高宫颈癌的远期生存率仍是临床和基 础研究的重要课题1。随着基因工程技术、尤其是噬菌体展示技术的进一 步发展2，基因工程抗体在疾病诊断和治疗中的研究和应用越来越广泛。 我们实验室建立了多株抗人宫颈癌杂交瘤细胞株，其中CSA125杂交瘤细胞 株

13、能特异性分泌高亲和性和高特异性的mAb CsAb125并经动物实验有较 好的靶向性。我们以CsA125为原料，应用分子生物学技术构建了抗人宫颈 癌mAbCsAb125的ScFv基因，并进行原核表达和空间结构预测，为宫颈癌 的预防、导向诊断和治疗打下了基础。 1材料与方法 1.1 质粒、细胞来源以及试剂盒 抗人宫颈癌CSA125杂交瘤细胞株、宫颈癌细胞株Cs12133由本 室自建。pMD18-Tvector购自大连宝生物工程公司；pCANTAB5表达载体、 TG1和HB2151表达体系以及linker全长基因为大连理工大学胡学军博士 惠赠。3-full RACE试剂盒、5-Full RACE 试

14、剂盒、PCR片段回收试剂 盒均购自大连宝生物工程公司；即用型免疫组织化学超敏S-P试剂盒购自 福州迈新生物技术开发公司。 1.2 引物 引物由大连宝生物工程有限公司合成。 表1 CsA125引物 Tab.l CsA125 primers Primer Sequence Primer Sequent Fl 5 -GGTTCAGAAGnCAACTAGTTGA 5GGGCGGCCGCTmAmCCA3l CATTCTGATGACCCACTCTCCT-31 f2 5 -GCCCCCATCCCGGCCCAGGTCCG y-AGACCCACCACCAGCGCGCriAAG CTTCAGCACTCI-3, T

15、TCTGAGGAGACGCTGAMCAM-31 1.3 生物学软件 基因比对与分析网站 http:/www. ncbi. nlm .n /blast； 蛋白综合分析软件 Antheprot由http:/ 提供；二级结 构预测网站http:/www.sbg.bio.ic.ac.uk/3dpssm/。三级结构预测工作 站SWISS-MODE由GlaxoSmithkline公司提供。三级结构观察软件为 PdbViewer 3.7 ， MDLChime和 Rasmol软件；截图软件为 HyperSnap DX-4. 1.4 ScFv基因的构建及结构分析 1.4.1 VL基因片段的扩增用3R

16、ACE和5RACE法进行扩 增4。ScFv的构建：重叠延伸连接法将VH和VL用一段linker连接起来 。 142基因片段测序和同源性分析分别登陆NCBI BLAST 基因和蛋白数据库，进行基因和蛋白的同源性分析。应用蛋白序列分析软 件包ANTHEPROT 4分析该基因所编码的蛋白氨基酸组成、等电点、疏水 性、抗原性等理化性质。应用ANTHEPROT 4.3和 3dpssm分别对编码蛋白 进行二级结构预测。SWISS-MODE进行蛋白的3D结构预测。 1.5 ScFv基因与pCANTAB-5E表达载体进行连接和转化 抗人宫颈癌ScFv基因与pCANTAB-5E表达载体进行连接反应，并 转化感受

17、态细胞 TG1和HB2151菌。 1.6 ScFv基因的表达 IPTG 1 mmol/L , 30 C进行诱导，培养上清中含可溶性ScFv。可 溶性ScFv经硫酸铵初步纯化后进行进一步检测。取重组 ScFv基因转化菌 TG1,用辅助噬菌体 M13K07进行援救，培养上清含噬菌体展示型ScFv。 1.7 ScFv的鉴定 1.7.1 10% SDS-PAGE口 Western blot 进行 ScFv 相对分子质 量的鉴定 一抗为ScFv,二抗为鼠抗E-tag抗体，三抗为地高辛标记的 羊抗鼠抗体，DAB显色。阴性对照为未经诱导的HB2151。 1.7.2 ScFv的亲和活性检测（竞争结合抑制试验）

18、宫颈癌 Cs1213细胞悬液加初步纯化的 ScFv封闭抗原后，加亲本 mAb CsAb125孵 育后，加入FITC标记的兔抗鼠抗体经固定，上流式细胞仪检测。以宫颈癌 Cs1213细胞加亲本mAb CsAb125为阳性对照，正常鼠IgG为阴性对照。 阳性平均强度X百分数-封闭 组平均强宸X百分数 抑制活性（）X100% 阳性平均强度X百分数 1.7.3 ScFv抗原结合活性检测a:常规制备Cs1213宫颈癌 细胞和正常宫颈上皮细胞涂片，SABC法检测可溶性ScFv和噬菌体ScFv的 免疫活性。设立宫颈癌 Cs1213细胞加亲本mAbCsAb125作为阳性对照，正 常宫颈上皮细胞涂片分别加亲本mA

19、bCsAb125和正常鼠IgG作为阴性对照， PBS代替一抗做空白对照，同时设立RLC-310肾癌细胞涂片、HC-108肝癌 细胞涂片和C0C1卵巢癌细胞涂片做无关对照。b:免疫组织化学：宫颈癌 和正常宫颈组织标本由本院病理科提供，分化程度好（高、中分化）20例, 分化程度差（低分化）3例，正常宫颈组织标本10例，常规固定、封闭，一 抗先后为ScFv及鼠抗E-tag抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠单抗，底物为 DAB着棕色者为阳性，深棕色为强阳性。对照设置：正常鼠IgG代替 ScFv作阴性对照；亲本抗体作为阳性对照；肾癌、肝癌、胃癌组织切 片为无关对照；PBS代替ScFv作空白对照。 2 结果

20、2.1 基因产物分析 2.1.1 PCR结果VL基因扩增产物带有部分lin ker基因和 NotI酶切位点，片段大小为 360 bp左右；VH基因扩增产物5端和3端分 别带有SfiI酶切位点和linker的部分序列，片段大小为 390 bp； ScFv基 因产物片段大小约 830 bp （图1）。 图1ScFv PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图 Fig.1 PCR products of the engineered ScFv gene from CsA125 hybridroma cells La nes 1,3: DL2000 DNA marker; La ne 2: ScFv gene 2.

21、1.2 测序结果 与Gen Ba nk中的序列进行比较，与登陆的 ScFv有73%的同源性。证实PCR产物测序结果确实为抗人宫颈癌 ScFv基因 （图 2）。 A A I P A QVQLQQS CAE LAK F ECE ECCATC CEC EC(2 CAG CTC CACCTTCA CCAC TCT CCC OCT CAA CTC CCA AAA CC s/H A S V K MSCKA S G Y T F T S Y W M GCC TCA GTG AAGATC TCC TCC AA C OCT TCT CGC TACA CC T7TA CM CC TA E Td TG OKI WVK

22、Q RPG QG L E W I G Y I NFS TOG CTA AAA CAG ACC CCT GGA CAG COT CTC CAA TCC AFT 心Pred:二级结 构预测;AA:氨基酸残基) Fig.3Predicted sec on dary structure of ScFv an tibody 2.4 三级结构 经序列比对，发现1NQBA和1NQB7 ScFv与目的ScFv同源性达 到73.44%,经SWISS-Mode8自动比较，运用同源建模法获得蛋白的三级 结构。ScFv重链可变区主要由9个卩片层组成，轻链可变区主要由10个 卩片层组成。其三级结构中连接肽卷曲形成“索状

23、”结构将VH和VL牵拉 而相互靠近，形成“口袋”或“凹陷”的沟槽结构，有利于抗原的结合（图 4、5) o 图4ScFv的三级结构模型 Fig.4 Tertiary structure model of the ScFv antibody 图5ScFv的表面模型 Fig.5 Graphic model of surface of the ScFv antibody 2.5 ScFv的鉴定 细胞培养上清液和周质腔提取液在32 000左右位置上均有明显条 带，而预计ScFv在29 000左右，这是由于表达的 ScFv带有E-Tag尾标签， 增加了相对分子质量。培养上清液和周质腔提取液位于32 000

24、左右有条明 显的条带。竞争抑制实验检测亲和活性ScFv封闭实验组荧光标记细胞阳 性率为95.6%, Mean值为1.83，亲本抗体阳性对照组荧光标记率为99.8%， Mean值为3.72，经公式计算抑制率为 53%即ScFv能与宫颈癌Cs1213细 胞特异性结合并封闭亲本抗体53%勺亲和活性。免疫化学 SABC去结果显示 可溶性ScFv和噬菌体展示性 ScFv均能与宫颈癌细胞特异性结合，阳性部 位主要定位于细胞膜上，呈棕褐色，与亲本抗体结合活性相似。非靶细胞 设立的无关对照和正常鼠IgG对照均为阴性。实验表明制备的抗宫颈癌 ScFv较好地保持了亲本抗体的活性 （图6）。20/23例宫颈癌呈阳性

25、反应， 其中3例分化程度低标本呈强阳性，3例高分化标本未见阳性反应；正常 宫颈组织标本均呈阴性；无关对照和空白对照标本也呈阴性。 图6免疫组织化学结果 Fig.6Result of immun ohistochemical detecti on of the scFv an tibody(Orig inal magn ificati on :10 x 40) 1: Soluble ScFv; 2: Phage-displayed ScFv; 3: Negative con trol (IgG) 4: CsAb125; 3 讨论 宫颈癌是最常见的恶性肿瘤之一，由于其病因复杂、预后差，死 亡率高，

26、因此探明宫颈癌的致病因素，寻找特异、敏感、有效的早期诊断、 早期治疗方法是基础和临床研究的重点。我们制备的分泌抗人宫颈癌的单 克隆抗体的CsA125杂交瘤细胞,单抗经初步鉴定，证实具有较高的特异性 和亲和力,并在动物模型中显示了明显的靶向性。因McAb分子大，免疫原 性强，难于进入组织等缺点，限制了它的使用。近年来出现的ScFv由于分 子小，无Fc端，免疫原性低，穿透力强，体内易于清除等特点，应用价值 优于McAb在疾病预防、诊断和治疗中显示了光明的前景。目前国内外已 经研制出多种ScFv，并用于临床9。而在宫颈癌诊断和治疗的研究上， 至今尚未见抗人宫颈癌 ScFv的构建和应用的报道。 通常构

27、建ScFv有两种方法，一种是在没有制备杂交瘤条件或没有 现成的杂交瘤细胞时，采用构建ScFv库的技术10，通过多轮淘筛，获得 亲和力较高的ScFv。此方法受构建抗体库库容和多轮淘筛过程的限制，易 于丢失信息，所以获得的ScFv只能达到中等亲和力11。另一种方法以分 泌高特异性McAb的杂交瘤细胞株为原料，该方法能很好地保留ScFv的亲 本McAb的高亲和力、高特异性，避免了淘筛抗体库的繁琐工作，获得了亲 和力和特异性均较高的 ScFv12。本实验从抗人宫颈癌的杂交瘤细胞株中 克隆并构建了抗人宫颈癌 scFv。结果证实所得到ScFv具有较高的亲和力。 实验采用大肠杆菌为基因表达的宿主菌，生长快，

28、可大量生产重 组蛋白，是较简单的表达系统。表达载体选用Pharmacia公司的噬菌粒载 体PCANTAB5P3。pCANTAB5 E是经丝状噬菌体改建的一种噬粒，在多克 隆位点与g III蛋白编码区之间有1个E-tag序列和琥珀终止密码子（UAG）。 当噬菌体感染非琥珀突变抑制的菌株（HB2151）时，则UAG为终止密码子， 多肽链终止于E-tag，形成可溶性的ScFv-E-tag融合蛋白，分泌到外周质 中。在含有琥珀突变抑制基因的菌株 （TG1）中表达时，UAG密码子被读为谷 氨酸，从而与gIII蛋白融合，在辅助噬菌体的超感染下，组装成噬菌体， 并可将ScFv以融合蛋白形式展示于噬菌体的表面

29、，即展示性ScFv。经免 疫组织化学证明制备的可溶性 ScFv和噬菌体展示性ScFv可以与宫颈癌细 胞表面抗原特异性结合并能与宫颈癌组织特异性结合，具有较强的亲和活 性、结合活性。 由于HB2151首先分泌ScFv入胞质，随后进入培养液，本实验发 现培养上清与胞质提取物的ScFv活性均较强，并且培养上清活性更佳，进 一步证实ScFv以可溶性的形式表达于培养上清和细胞周质腔，能够完成抗 体的自然立体折叠，从而很好地保留了单抗的活性。ScFv的可溶性表达更 益于ScFv的大量生产、制备和纯化，使ScFv用于诊断、治疗成为可能。 噬菌体展示性ScFv是ScFv基因型和表型的统一，产量高，制备方法简单

30、， 不需纯化，是研究ScFv的很好形式，并能进一步用于制备更高亲和力ScFv。 总之，我们获得的具有较高活性的Scfv为进一步的动物实验和体外实验提 供了材料，为宫颈癌的预防、基因诊断、基因治疗做了有意义的基础研究 工作。 随着生物信息学的发展，计算机数字化分析系统成为蛋白质工程 研究中必不可少的工具。我们应用此技术对ScFv蛋白疏水性、等电点、抗 原性等理化性质以及三维结构进行预测，结果与ScFv检测结果基本吻合， 符合ScFv的特点，说明我们所用的分析预测体系较可靠。在VH和VL区发 现多个蛋白激酶C磷酸化位点和酪氨酸激酶II磷酸化位点，可能与抗体的 功能有关，有待进一步地研究。从计算机模

31、建的三维结构可以看出，单价 ScFv的VH和VL结构域互相靠近，形成一个较为致密的分子，VH和VL形 成一个“口袋样凹陷”结构14，有利于抗原的结合。这些预测结果的综 合应用为ScFv表达、纯化和活性研究等后续实验提供了大量宝贵的信息； 并为ScFv进一步改建、研究抗原抗体反应机制，甚至于设计、改造抗原和 抗体提供了宝贵的信息。 参考文献: 1Dillner J. Trends over time in the incidenee of cervical neoplasia in comparison to trends over time in human papillomavirus in

32、fectionJ. J Clin Virol, 2000, 19(1-2): 7-23. 2Azzazy HM, Highsmith JW. Phage display tech no logy: cli nical applicati ons and recent innovationsJ. Clin Biochem, 2002, 3李旭，陈 的建立及其生物学特性J. 4王莹，李 35(6): 425-45. 葳,杨玉琮，等.人宫颈癌细胞株 CS1213 中华妇产科杂志，2003, 38(10): 614-17. 旭，陈 葳.反向PCR去扩增抗人宫颈癌 单克隆抗体重链可变区序列J. 细胞与分

33、子免疫学杂志，2001, 18(5): 489-90. 5 Warrens AN, Jones MD, Lechler RI. Splicing by overlap exte nsion by PCR using asymmetric amplificati on: an improved tech nique for the gen erati on of hybrid prote ins of immuno logical in terestJ. Gen e, 1997, 186(1): 29-35. 6 阎隆飞，孙之荣.蛋白质分子结构M.北京：清华大学出版 社,1999: 215-33. 7 PizarroJC, Vulliez NB, Riottot MM,et al. Structural and functional characterizati on of a monoclonal an tibody specific for the preS1 region of hepatitis B virusJ. FEBS Lett, 2001,509(3): 463-68. 8 Schwede T, Kopp J, Guex N, et al. SWISS-MODEL: An automated prote in homolo