第九章原生质体培养

1、第九章原生质体培养 Plant Tissue Culture 第九章原生质体培养 第九章 原生质体的培养 第九章原生质体培养 目的要求：目的要求： (1)了解原生质体培养的意义；了解原生质体培养的意义； (2)掌握原生质体分离的大致步骤；掌握原生质体分离的大致步骤； (3)掌握原生质体培养的方法；掌握原生质体培养的方法； (4)掌握原生质体融合的方法。掌握原生质体融合的方法。 第九章原生质体培养 一、原生质体一、原生质体(protoplast) 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部 分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从分，是能存活的植物细胞的最小单位。

2、自从1960 年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以 来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之 一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质 体仍然具有体仍然具有全能性全能性，可以经过离体培养得到再，可以经过离体培养得到再 生植株。生植株。 第一节第一节 原生质体培养的意义原生质体培养的意义 第九章原生质体培养 原生质体的分离研究较早，原生质体的分离研究较早，1892年年Klereker首先首先 用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受用机械的方法分离得到了原

3、生质体，但数量少且易受 损伤。损伤。1960年，英国植物生理学家年，英国植物生理学家Cocking首先用酶首先用酶 解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用 一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶 液降解细胞壁。然而，直至液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶年纤维素酶和离析酶 成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为 一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可 分离得到原生质

4、体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、 茄子、番茄等茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。种植物的原生质体再生成完整的植株。 此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛 的应用。的应用。 第九章原生质体培养 二、原生质体培养的意义二、原生质体培养的意义 (1)再生植株再生植株 由原生质体再生生成植株，不论在进由原生质体再生生成植株，不论在进 行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究 上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：上，还是在组织培养实践中，

5、都有一定的优点： 可利用均一的分化细胞群体；因无细胞壁，可利用均一的分化细胞群体；因无细胞壁， 试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量， 以使反应产物能较快的分离出来；在理论和实以使反应产物能较快的分离出来；在理论和实 践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培 养养210个细胞，但在大田种植需要个细胞，但在大田种植需要4亩地；亩地； 第九章原生质体培养 n可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需12个个 小时。小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，原生质体培养可在遗传学方面

6、进行基因互补， 不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激 活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用 一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的 不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分 化条件等。化条件等。 第九章原生质体培养 (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。 这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的 育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂育种方法。两

7、个亲缘关系较远的植株用一般杂 交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法 却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异 核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂， 发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的 杂种。杂种。 第九章原生质体培养 要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、 纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。在纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。在 本世纪前期是采用分离机械法。即将叶肉细胞，本

8、世纪前期是采用分离机械法。即将叶肉细胞， 愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液 中，使之质壁分离，原生质体收缩成球形。然后中，使之质壁分离，原生质体收缩成球形。然后 用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁获得少量完整用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁获得少量完整 的原生质体。不过这种方法分离的原生质体太少，的原生质体。不过这种方法分离的原生质体太少， 而且只能适于部分组织，而且只能适于部分组织，Cocking发明的酶解法，发明的酶解法， 开创了大量分离原生质体的新技术，所以目前普开创了大量分离原生质体的新技术，所以目前普 遍采用酶分离法来获得原生质体遍采用酶

9、分离法来获得原生质体 第二节第二节 原生质体的分离原生质体的分离 第九章原生质体培养 一、植物材料一、植物材料 一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、 花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作 为分离原生质体的材料。但是，要获得高质量的为分离原生质体的材料。但是，要获得高质量的 原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织 作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定 性因素之一。性因素之一。 第九章原生质体培养 n1.细胞悬浮培

10、养物细胞悬浮培养物 在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养 愈伤组织。即取用成熟种子胚、未成熟胚、幼愈伤组织。即取用成熟种子胚、未成熟胚、幼 穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在 26黑暗条件下，在含黑暗条件下，在含2，4-D24mgL的的 MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔24d 转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的 愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体 培养基的培养基的l00ml三角瓶中进行悬

11、浮培养。三角瓶中进行悬浮培养。 第九章原生质体培养 n 具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在 80120rmin，在，在25土土1下暗培养。悬浮下暗培养。悬浮 培养初期应每隔培养初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸继代一次，一个半月后，吸 取取45ml悬浮细胞转到悬浮细胞转到250ml三角瓶的三角瓶的40ml新新 鲜培养中，以后每隔鲜培养中，以后每隔7d继代一次。通常经悬浮继代一次。通常经悬浮 培养培养34月后，悬浮培养细胞的大小变得较为月后，悬浮培养细胞的大小变得较为 一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生 质体

12、。质体。 第九章原生质体培养 2. 叶肉细胞叶肉细胞 叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料， 用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株 的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态 对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片， 有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。 3. 植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用 花粉四分体和花粉壁细胞。花粉四分体和花粉

13、壁细胞。 第九章原生质体培养 二、酶二、酶 1.酶的种类酶的种类 构成植物细胞壁的三个主要成分是：纤维素，构成植物细胞壁的三个主要成分是：纤维素， 占细胞壁干重的占细胞壁干重的25至至50不等；半纤维素，不等；半纤维素， 平均约占细胞壁干重的平均约占细胞壁干重的53左右；果胶质，一左右；果胶质，一 般占细胞壁的般占细胞壁的5。分离原生质体最常用的酶有。分离原生质体最常用的酶有 纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。 第九章原生质体培养 n 纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合 酶制剂，主要含有纤维素酶酶制剂，主要含有纤维素酶C1，作用于

14、天然，作用于天然 的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作 用，还含纤维素酶用，还含纤维素酶Cx，作用于定形的纤维素，作用于定形的纤维素， 可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木 聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素， 得到裸露的原生质体。得到裸露的原生质体。 第九章原生质体培养 果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果 胶质降解，把细胞从组织内分离出来。

15、胶质降解，把细胞从组织内分离出来。 半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖 或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于 花粉母细胞和四分体细胞。花粉母细胞和四分体细胞。 第九章原生质体培养 ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型纤维酶是上海植物生理研究所从野生型 绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的 复合物，含有纤维素酶复合物，含有纤维素酶(包括包括C1、Cx、B-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 等等)，果胶质，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较，果胶质，半纤维素酶等，

16、分离细胞壁的效果较 好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等， 就可以分离出植物原生质体。就可以分离出植物原生质体。 日本产的日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，纤维素酶常和果胶酶结合使用， 可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶 处理降解细胞壁。即二步法降解。处理降解细胞壁。即二步法降解。 第九章原生质体培养 2.酶溶液的酶溶液的pH值值 酶溶液的酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影值对原生质体的产量和生活力影 响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始响很大。用菜豆叶

17、片作培养材料时，发现原始pH 值为值为50时，时， 原生质体产生得很快，但损坏较严原生质体产生得很快，但损坏较严 重，并且培养后大量破裂。当重，并且培养后大量破裂。当pH值提高到值提高到60时，时， 最初原生质体却产生少，但与最初原生质体却产生少，但与pH值为值为50时处理时处理 同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始 pH值提高到值提高到7.0时生活的原生质体数量进一步增时生活的原生质体数量进一步增 加，损伤的原生质体也少得多。加，损伤的原生质体也少得多。 第九章原生质体培养 三三.渗透稳定剂渗透稳定剂 植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除植物

18、细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除 细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透 压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶 液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内 的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大 些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生 质体的分裂。质体的分裂。 第九章原生质体培养 n 因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定

19、 量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定， 避免破裂。避免破裂。 n常用的两种系统为：糖溶液系统：包括甘露醇、山常用的两种系统为：糖溶液系统：包括甘露醇、山 梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.400.80molL。 本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分 裂；盐溶液系统：包括裂；盐溶液系统：包括KCl、MgS04和和KH2PO4等。等。 其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而 材料不必在严格的控制条件下栽培

20、，不受植株年龄的材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的 影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。 第九章原生质体培养 n 另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解 壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐 溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作 渗透稳定剂的培养基中培养。渗透稳定剂的培养基中培养。 此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾， 它可提高原生质体的稳定性。这种物质可使它可提高原

21、生质体的稳定性。这种物质可使 RNA酶不活化，并使离子稳定。酶不活化，并使离子稳定。 第九章原生质体培养 四四.植物材料的预处理植物材料的预处理 对原生质体材料进行预处理能提高原生对原生质体材料进行预处理能提高原生 质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材 料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。 这些处理包括：暗处理、预培养、低温处这些处理包括：暗处理、预培养、低温处 理等。理等。 第九章原生质体培养 n 把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让 材料在黑暗中的一定湿度条件下放材料

22、在黑暗中的一定湿度条件下放12d，这样得到，这样得到 的原生质体存活率高，并能继续分裂。的原生质体存活率高，并能继续分裂。 n 在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先 去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预 培养培养7d，然后再去壁。经预培养的叶片分离的原生质，然后再去壁。经预培养的叶片分离的原生质 体高度液泡化，叶绿体也解体。体高度液泡化，叶绿体也解体。 n 龙胆试管苗的叶片只有用龙胆试管苗的叶片只有用4低温处理后分离得到低温处理后分离得到 的原生质体才能分裂。的原生质体才能分裂。 n 在很多

23、情况下材料不必经过专门的预处理。在很多情况下材料不必经过专门的预处理。 第九章原生质体培养 五、原生质体的分离五、原生质体的分离 分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸 附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料 分离成单细胞，然后分解细胞壁。采用将酶液减分离成单细胞，然后分解细胞壁。采用将酶液减 压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增 加酶液与纤维素分子接触的机会。加酶液与纤维素分子接触的机会。 第九章原生质体培养 酶处理目前常用的多是酶处理目前常用的多是“一步法一步

24、法”，即把，即把 一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成 混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分 离的原生质体。离的原生质体。 植物材料须按比例和酶液混合才能有效地植物材料须按比例和酶液混合才能有效地 游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少， 而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液 1030ml不等。不等。 第九章原生质体培养 由于不同材料的生理特点不同，在研究游由于不同材料的生理特点不同，在研究游 离条件时，必须试验不同渗透压浓

25、度的细胞，离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞， 找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦悬浮细找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦悬浮细 胞的原生质体的酶液中须加入胞的原生质体的酶液中须加入055molL甘甘 露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中 只加只加0.40.45molL的甘露醇，两者差别较的甘露醇，两者差别较 大。大。 第九章原生质体培养 酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表 皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表 皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉皮的

26、方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉 轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将 材料切成小细条，放入酶液中。材料切成小细条，放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不 均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将 原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行 酶解。酶解。 第九章原生质体培养 n 酶解处理一般在黑暗中静止进行，在处理过程中酶解处理一般在黑暗中静止进行，在处理过程中 偶尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组

27、织等难游偶尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游 离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进 酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体 游离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所游离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所 以一般不应超过以一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的。酶解温度要从原生质体和酶的 活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度 在在4050但这个温度对植物细胞来说太高，所以但这个温度对植物细胞来说太高，

28、所以 一般都在一般都在25左右进行酶解。左右进行酶解。 第九章原生质体培养 若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用 053次氯酸钠和次氯酸钠和70酒精进行表面灭菌，然后切酒精进行表面灭菌，然后切 成成2cm见方。把见方。把4g叶组织置于含有叶组织置于含有200ml不加蔗糖和不加蔗糖和 琼脂的培养基琼脂的培养基500ml三角瓶中。在三角瓶中。在4黑暗条件下培黑暗条件下培 养养1624h，以后叶片转入含有纤维素酶、果胶酶、，以后叶片转入含有纤维素酶、果胶酶、 无机盐和缓冲液的混合液中，无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为值为56，通常在，通常在 酶液中使用的

29、等渗剂为酶液中使用的等渗剂为05506mol甘露醇。然后，甘露醇。然后， 酶液真空渗入叶片组织。在酶液真空渗入叶片组织。在28条件下，每分钟条件下，每分钟40转转 的旋转式转床上培养的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离。后，叶片组织可完全分离。 第九章原生质体培养 若用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，若用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理， 因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。 取悬浮细胞放人取悬浮细胞放人10ml的酶液中的酶液中(3纤维素酶，纤维素酶， 14蔗糖，蔗糖，pH值值5060)，在，在25-33条件条件 下酶解下酶解24h。原

30、生质体。原生质体-酶混合液用酶混合液用30um的尼的尼 龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。 第九章原生质体培养 六、影响原生质体分离的因素六、影响原生质体分离的因素 1.酶制剂活力和纯度酶制剂活力和纯度 粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质， 它们对原生质体的活力是有害的。因此，在使用它们对原生质体的活力是有害的。因此，在使用 之前须将这些酶纯化，一般利用凝胶柱使酶制剂之前须将这些酶纯化，一般利用凝胶柱使酶制剂 脱盐纯化。酶的活性还与脱盐纯化。酶的活性还与pH值有关。值有关。Onoznka 纤维素酶纤维素酶R-10和离

31、析酶和离析酶R-10的最适宜的最适宜pH值分别值分别 为为56和和45。不过实际上酶溶液的。不过实际上酶溶液的pH值经常调值经常调 节节4.76.0之间。之间。 第九章原生质体培养 2.渗透稳定剂的作用渗透稳定剂的作用 在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护 原生质体结构及其活力的作用。糖溶液系统可原生质体结构及其活力的作用。糖溶液系统可 使分离的原生质体能再生细胞壁，并使之能继使分离的原生质体能再生细胞壁，并使之能继 续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作 用。盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严用。盐溶液系作渗透稳定剂

32、时对材料要求较严 格，且使原生质体稳定，使某些酶有较大活性。格，且使原生质体稳定，使某些酶有较大活性。 但是易使原生质体形成假壁，同时使分裂后细但是易使原生质体形成假壁，同时使分裂后细 胞是分散的。胞是分散的。 第九章原生质体培养 七、原生质体的净化和活力测定七、原生质体的净化和活力测定 在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片， 维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及 微生物等。这些混杂物的存在会对原生质体产生微生物等。这些混杂物的存在会对原生质体产生 不良影响。此外，还需去掉酶溶液。以净化原生不良影响。

33、此外，还需去掉酶溶液。以净化原生 质体。质体。 第九章原生质体培养 原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大 致如下：致如下： 1) 将原生质体混合液经筛孔大小为将原生质体混合液经筛孔大小为40100tm的滤网过的滤网过 滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集 滤液。滤液。 2) 将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等 仍悬浮在上清液中为准，一般以仍悬浮在上清液中为准，一般以500rmin离心离心15min。 用吸管谨慎地吸

34、去上清液。用吸管谨慎地吸去上清液。 3) 将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中(除不含酶外，除不含酶外， 其他成分和酶液相同其他成分和酶液相同)，再次离心，去上清液，如此重复，再次离心，去上清液，如此重复 三次。三次。 4) 用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密 度进行培养。一般原生质体的培养密度为度进行培养。一般原生质体的培养密度为104106ml。 第九章原生质体培养 在原生质体培养前，常常先对原生质体的活在原生质体培养前，常常先对原生质体的活 性进行检测。测定原生质体活性有多种方法，如性进行检

35、测。测定原生质体活性有多种方法，如 观察胞质环流、活性染料染色、荧光素双醋酸酯观察胞质环流、活性染料染色、荧光素双醋酸酯 (FDA)染色等。这些方法各有特点，但现在一般染色等。这些方法各有特点，但现在一般 用的是用的是FDA染色法。染色法。FDA本身无荧光，无极性，本身无荧光，无极性， 可透过完整的原生质体膜。一旦进入原生质体后，可透过完整的原生质体膜。一旦进入原生质体后， 由于受到脂酶分解而产生有荧光的极性物质荧光由于受到脂酶分解而产生有荧光的极性物质荧光 素。它不能自由出入原生质体膜，因此有活力的素。它不能自由出入原生质体膜，因此有活力的 细胞便产生荧光，而无活力的原生质体不能分解细胞便产

36、生荧光，而无活力的原生质体不能分解 FDA，因此无荧光产生。，因此无荧光产生。 第九章原生质体培养 FDA染色测活性的方法如下：染色测活性的方法如下： 取洗涤过的原生质体悬浮液取洗涤过的原生质体悬浮液05ml，置于，置于 10100mm的小试管中，加入的小试管中，加入FDA溶液使其溶液使其 最终浓度为最终浓度为001，混匀、置于室温，混匀、置于室温5min后后 用荧光显微镜观察。激发光滤光片用用荧光显微镜观察。激发光滤光片用QB24， 压制滤光片用压制滤光片用JB8。发绿色荧光的原生质体为。发绿色荧光的原生质体为 有活力的，不产生荧光的为无活力的。由于叶有活力的，不产生荧光的为无活力的。由于叶

37、 绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有 活力的，发红色荧光的为无活力的。活力的，发红色荧光的为无活力的。 第九章原生质体培养 将有生活力的原生质体在适当的培养基和培将有生活力的原生质体在适当的培养基和培 养条件下培养，很快就开始出现细胞壁再生和细养条件下培养，很快就开始出现细胞壁再生和细 胞分裂的过程。约胞分裂的过程。约12个月后，通过细胞的持续个月后，通过细胞的持续 分裂，在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞分裂，在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞 团长到团长到2-4mm左右，即可转移到分化培养基上，左右，即可转移到分化培养基上， 诱导芽和根长成

38、完整的植株。诱导芽和根长成完整的植株。 第三节第三节 原生质体的培养原生质体的培养 第九章原生质体培养 n一、培养原生质体的方法一、培养原生质体的方法 原生质体的培养方法大体和细胞培养相同，有原生质体的培养方法大体和细胞培养相同，有 固体培养、液体培养及周液结合培养等几种方固体培养、液体培养及周液结合培养等几种方 法。法。 第九章原生质体培养 1.固体培养法固体培养法 该法是将悬浮在液体中的原生质体悬液与热融的该法是将悬浮在液体中的原生质体悬液与热融的 含琼脂的培养基等量混合，使琼脂的最终浓度为含琼脂的培养基等量混合，使琼脂的最终浓度为06 左右，冷却后原生质体包埋在琼脂培养基中。由于左右，冷

39、却后原生质体包埋在琼脂培养基中。由于 原生质体被机械地彼此分开并固定了位置，避免了细原生质体被机械地彼此分开并固定了位置，避免了细 胞间有害代谢产物的影响并便于定点观察，追踪单个胞间有害代谢产物的影响并便于定点观察，追踪单个 细胞的发育过程。细胞的发育过程。 饲养培养是固体培养法的引伸。将一些射线处理过的饲养培养是固体培养法的引伸。将一些射线处理过的 原生质体用一薄层琼脂培养基固定在下层，而活的原原生质体用一薄层琼脂培养基固定在下层，而活的原 生质体固定在上层。这种方法允许原生质体密度低于生质体固定在上层。这种方法允许原生质体密度低于 能生长的密度，因为它们可以从被处理过的原生质体能生长的密度

40、，因为它们可以从被处理过的原生质体 那里获得一些有益的物质。那里获得一些有益的物质。 第九章原生质体培养 固体共培养方法也是饲养培养的一种方式，固体共培养方法也是饲养培养的一种方式， 即把一种已知能快速生长的原生质体和一种难以即把一种已知能快速生长的原生质体和一种难以 培养的原生质体相混合，然后用琼脂培养基固定培养的原生质体相混合，然后用琼脂培养基固定 共同培养。这种方法使难以培养的原生质体得益共同培养。这种方法使难以培养的原生质体得益 于快速生长的原生质体所产生并易扩散的物质。于快速生长的原生质体所产生并易扩散的物质。 第九章原生质体培养 n 由于琼脂熔点较高，因此，在固定培养中由于琼脂熔点

41、较高，因此，在固定培养中 保持琼脂培养基较高的温度和相对剧烈的摇动保持琼脂培养基较高的温度和相对剧烈的摇动 是使原生质体在培养基中分布均匀的前提。此是使原生质体在培养基中分布均匀的前提。此 外，琼脂对原生质体是有毒害的，只能是一些外，琼脂对原生质体是有毒害的，只能是一些 生命力较强的植物原生质体才可以用这种办法生命力较强的植物原生质体才可以用这种办法 来培养。为此，人们不断寻求低毒并可在常温来培养。为此，人们不断寻求低毒并可在常温 下凝固的物质来代替琼脂，下凝固的物质来代替琼脂， 第九章原生质体培养 n 近年来很多实验证明，琼脂糖是一个良好的培养近年来很多实验证明，琼脂糖是一个良好的培养 基凝

42、胶剂，它不仅具有熔点低的特点，而且具有促进基凝胶剂，它不仅具有熔点低的特点，而且具有促进 原生质体再生细胞分裂的作用。原生质体再生细胞分裂的作用。 n 研究发现在琼脂中不能分裂的天仙子属的品种能研究发现在琼脂中不能分裂的天仙子属的品种能 在琼脂糖中能持续分裂并且比在液体培养基中形成细在琼脂糖中能持续分裂并且比在液体培养基中形成细 胞团的频率高。胞团的频率高。 n 在琼脂糖培养基中，烟草原生质体发育到细胞团在琼脂糖培养基中，烟草原生质体发育到细胞团 所需的接种密度要比在琼脂或液体培养基中的低。在所需的接种密度要比在琼脂或液体培养基中的低。在 水稻原生质体培养中也证实，提高琼脂糖的浓度可以水稻原生

43、质体培养中也证实，提高琼脂糖的浓度可以 明显地提高原生质体引起的出芽现象，从而提高了培明显地提高原生质体引起的出芽现象，从而提高了培 养初期的原生质体的成活率。因此，琼脂糖作为一种养初期的原生质体的成活率。因此，琼脂糖作为一种 优良的凝胶剂，在原生质体培养中的应用越来越广泛。优良的凝胶剂，在原生质体培养中的应用越来越广泛。 第九章原生质体培养 2.液体培养液体培养 液体培养法是在培养基中不加凝胶剂，原生液体培养法是在培养基中不加凝胶剂，原生 质体质体 悬浮在液体培养基中，常用的是液体浅层悬浮在液体培养基中，常用的是液体浅层 培养法，即含有原生质体的培养液在培养皿底部培养法，即含有原生质体的培养

44、液在培养皿底部 铺一薄层。这种方法操作简便，对原生质体伤害铺一薄层。这种方法操作简便，对原生质体伤害 较小，日便于添加培养基和转移培养物，是目前较小，日便于添加培养基和转移培养物，是目前 原生质体培养工作中广泛应用的方法之一。其缺原生质体培养工作中广泛应用的方法之一。其缺 点是原生质体在培养基中分布不均匀，容易造成点是原生质体在培养基中分布不均匀，容易造成 局部密度过高或原生质互相粘连而影响进一步的局部密度过高或原生质互相粘连而影响进一步的 生长发育并且难以定点观察，很难监视单个原生长发育并且难以定点观察，很难监视单个原 生质体的发育过程。生质体的发育过程。 第九章原生质体培养 在固体培养法中

45、提到的饲养培养和共培养，也可以用于液体培在固体培养法中提到的饲养培养和共培养，也可以用于液体培 养的方法。养的方法。 微滴培养法是液体培养的一种方式。将悬浮有原生质体的培微滴培养法是液体培养的一种方式。将悬浮有原生质体的培 养液用滴管以养液用滴管以0.1ml左右的小滴接种在无菌且清洁干燥的培养皿左右的小滴接种在无菌且清洁干燥的培养皿 卜由于表面张力的作用，小滴以半球型保持在培养皿表面，然卜由于表面张力的作用，小滴以半球型保持在培养皿表面，然 后用后用Paratilm封口，防止干燥和污染。如果把培养皿翻转过来，封口，防止干燥和污染。如果把培养皿翻转过来， 则成为悬滴培养。由于小滴的体积小，在一个

46、培养皿中可以做很则成为悬滴培养。由于小滴的体积小，在一个培养皿中可以做很 多种培养基的对照实验。如果其中一滴或几滴发生污染，也不会多种培养基的对照实验。如果其中一滴或几滴发生污染，也不会 殃及整个实验。同时也容易添加新鲜培养基。其缺点也是原生质殃及整个实验。同时也容易添加新鲜培养基。其缺点也是原生质 体分布不均匀，容易集中在小滴中央。此外由于液滴与空气接触体分布不均匀，容易集中在小滴中央。此外由于液滴与空气接触 面大，液体容易蒸发，造成培养基成分浓度的提高。解决蒸发问面大，液体容易蒸发，造成培养基成分浓度的提高。解决蒸发问 题最简单的办法就是在液滴上覆盖矿物油。题最简单的办法就是在液滴上覆盖矿

47、物油。 第九章原生质体培养 有些研究工作需要进行单个原生质体培养。如选择出特定的原生质体和有些研究工作需要进行单个原生质体培养。如选择出特定的原生质体和 经融合处理后数量很少的融合体等。已有实验证实，单个原生质体的单独培经融合处理后数量很少的融合体等。已有实验证实，单个原生质体的单独培 养的关键在于培养基原体积要特别小。如油菜单个的原生质体须培养在养的关键在于培养基原体积要特别小。如油菜单个的原生质体须培养在50ml 的培养基中，这种比例相当于每毫升培养基有的培养基中，这种比例相当于每毫升培养基有2X104个原生质体，在这种条个原生质体，在这种条 件下，原生质体的再生细胞可以持续分裂直到形成愈

48、伤组织。这样小体积的件下，原生质体的再生细胞可以持续分裂直到形成愈伤组织。这样小体积的 微滴，是极易蒸发的，为此，微滴，是极易蒸发的，为此，Koopt设计了一个特殊的装置：首先，在一个设计了一个特殊的装置：首先，在一个 长度为长度为3350um。并绝对洁净的盖玻片上滴。并绝对洁净的盖玻片上滴50滴滴20molL蔗糖小滴，每滴蔗糖小滴，每滴 1ul，分布成，分布成10行，每行的距离为行，每行的距离为3.4um。然后把盖玻片在硅溶液中浸一下，。然后把盖玻片在硅溶液中浸一下， 使得蔗糖小滴占领的圆点外的全部盖玻片被硅化。硅化的目的是防止以后的使得蔗糖小滴占领的圆点外的全部盖玻片被硅化。硅化的目的是防

49、止以后的 矿物油滴相互连通。硅化后，用水小心地把蔗糖液滴洗去，然后使盖玻片干矿物油滴相互连通。硅化后，用水小心地把蔗糖液滴洗去，然后使盖玻片干 燥并灭菌。在原来蔗糖液滴占领的圆点区域加上燥并灭菌。在原来蔗糖液滴占领的圆点区域加上1um的矿物油滴，再把已悬的矿物油滴，再把已悬 浮有原生质体的培养液用注射器注到矿物油滴中。这样制备好的盖玻片放到浮有原生质体的培养液用注射器注到矿物油滴中。这样制备好的盖玻片放到 一个双环培养皿中，培养皿的外环加满一个双环培养皿中，培养皿的外环加满0.2molL的甘露醇溶液，最后封口。的甘露醇溶液，最后封口。 由于有矿物油并且盖玻片相当于保持在一个湿润的小室中，保证了

50、微小培养由于有矿物油并且盖玻片相当于保持在一个湿润的小室中，保证了微小培养 基不会蒸发，从而可以达到单个原生质体培养的目的。基不会蒸发，从而可以达到单个原生质体培养的目的。 第九章原生质体培养 3、固液结合培养法、固液结合培养法 最简便的固液结合培养方法是在培养皿的底部最简便的固液结合培养方法是在培养皿的底部 先铺一薄层含凝胶剂的固体培养基，再在其上进先铺一薄层含凝胶剂的固体培养基，再在其上进 行原生质体的液体浅层培养。这样，固体培养基行原生质体的液体浅层培养。这样，固体培养基 中的营养成分可以慢慢地向液体中释放，以补充中的营养成分可以慢慢地向液体中释放，以补充 培养物对营养的消耗，培养物所产

51、生的一些有害培养物对营养的消耗，培养物所产生的一些有害 物质，也会被固体部分吸收，对培养物的生长更物质，也会被固体部分吸收，对培养物的生长更 有利。已证明这种方法对烟草和矮牵牛原生质体有利。已证明这种方法对烟草和矮牵牛原生质体 的再生细胞起到了促进分裂的作用。考虑到有效的再生细胞起到了促进分裂的作用。考虑到有效 地吸附培养物所产生的有害物质，在下层固体培地吸附培养物所产生的有害物质，在下层固体培 养基中添加活性炭，结果使原生质体形成细胞团养基中添加活性炭，结果使原生质体形成细胞团 的数量提高了的数量提高了23倍。倍。 第九章原生质体培养 由于很多实验已证实了琼脂糖比琼脂更适于原生由于很多实验已

52、证实了琼脂糖比琼脂更适于原生 质体培养，近年来又发展了琼脂糖固体培养和液体培质体培养，近年来又发展了琼脂糖固体培养和液体培 养相结合的方法。用几种植物的原生质体做实验，发养相结合的方法。用几种植物的原生质体做实验，发 现尽管琼脂糖提高了植板率，但到细胞团阶段后就难现尽管琼脂糖提高了植板率，但到细胞团阶段后就难 以再继续发育。这可能是由于培养物把固体培养基中以再继续发育。这可能是由于培养物把固体培养基中 的营养耗尽所造成的。他们发展一种的营养耗尽所造成的。他们发展一种念珠培养念珠培养法，法， 即把含有原生质体的琼脂糖培养基切成块放到大体积即把含有原生质体的琼脂糖培养基切成块放到大体积 的液体培养

53、基中，并在旋转摇床上振荡以利于通气。的液体培养基中，并在旋转摇床上振荡以利于通气。 使用大体积的液体是为了防止琼脂糖块过渡破碎。使用大体积的液体是为了防止琼脂糖块过渡破碎。 第九章原生质体培养 用这种方法不仅进一步提高一些种用这种方法不仅进一步提高一些种(如番茄原如番茄原 生质体生质体)的植板率，而且使一些以前从来超过细胞团的植板率，而且使一些以前从来超过细胞团 阶段的种，如芜菁和矮牵牛原生质体能够持续地分裂。阶段的种，如芜菁和矮牵牛原生质体能够持续地分裂。 在水稻原生质体培养中使用的琼脂糖泡培养法也是固在水稻原生质体培养中使用的琼脂糖泡培养法也是固 液结合的一个好方法。把含有原生质体的琼脂糖

54、念球液结合的一个好方法。把含有原生质体的琼脂糖念球 养基以大约养基以大约50ul一滴，滴在直径一滴，滴在直径55cm的培养皿中，的培养皿中， 待其固化后，再向其中添加待其固化后，再向其中添加3ml液体培养基。这样，液体培养基。这样， 琼脂糖滴就处于液体培养基的包围之中。在培养过程琼脂糖滴就处于液体培养基的包围之中。在培养过程 中，可以通过改变液体培养基的渗透浓度来逐渐降低中，可以通过改变液体培养基的渗透浓度来逐渐降低 固体培养基的渗透浓度，以便使培养物持续地生长发固体培养基的渗透浓度，以便使培养物持续地生长发 育。育。 第九章原生质体培养 二、影响原生质体培养的因素二、影响原生质体培养的因素

55、1.培养基成分培养基成分 原生质体培养和其他组织培养一样，培养基中需要氮、原生质体培养和其他组织培养一样，培养基中需要氮、 磷、钾、钙、镁、硫及铁等大量元素，以及锰、锌、钼、磷、钾、钙、镁、硫及铁等大量元素，以及锰、锌、钼、 铜和钴等微量元素营养源。同时还需要糖类物质和许多有铜和钴等微量元素营养源。同时还需要糖类物质和许多有 机营养，以及添加适当浓度的激素。由于和细胞培养相比，机营养，以及添加适当浓度的激素。由于和细胞培养相比， 只去除了细胞壁，因此，原生质体培养基一般是加以改变只去除了细胞壁，因此，原生质体培养基一般是加以改变 的细胞培养基。如原生质体培养经常使用的的细胞培养基。如原生质体培

56、养经常使用的KM-P培养基培养基 就是以就是以B5，培养基为基础；，培养基为基础；N6培养基则以培养基则以MS培养基为基培养基为基 础。但原生质体无论在结构上和代谢生理上和细胞毕竟有础。但原生质体无论在结构上和代谢生理上和细胞毕竟有 很大差异，在培养原生质体时，单纯地模仿细胞培养基往很大差异，在培养原生质体时，单纯地模仿细胞培养基往 往不能达到满意的培养效果，需要考虑到原生质体的独特往不能达到满意的培养效果，需要考虑到原生质体的独特 要求。要求。 第九章原生质体培养 2.渗透压稳定剂渗透压稳定剂 由于去除了细胞壁，原生质体培养基中须有一定由于去除了细胞壁，原生质体培养基中须有一定 浓度的渗透压

57、稳定剂来保持原生质体的稳定。常用的浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定。常用的 是甘露醇、山梨醇、蔗糖及葡萄糖等糖类。因为这类是甘露醇、山梨醇、蔗糖及葡萄糖等糖类。因为这类 物质既保持培养基的渗透浓度，又是原生质生长发育物质既保持培养基的渗透浓度，又是原生质生长发育 的碳源，因此其种类和浓度会影响培养效果。对原生的碳源，因此其种类和浓度会影响培养效果。对原生 质体培养来讲，蔗糖不如葡萄糖。用葡萄糖代替甘露质体培养来讲，蔗糖不如葡萄糖。用葡萄糖代替甘露 醇，可提高原生质体的植板率。近年来许多实验证实醇，可提高原生质体的植板率。近年来许多实验证实 葡萄糖是原生体培养中比较理想的渗透压稳定剂和碳葡

58、萄糖是原生体培养中比较理想的渗透压稳定剂和碳 源。源。 第九章原生质体培养 不同的糖类，只对培养效果发生影响，在不同的糖类，只对培养效果发生影响，在 游离时，并无显著影响。说明在原生质体发育游离时，并无显著影响。说明在原生质体发育 时，对碳源有一定的要求。随着细胞壁的再生时，对碳源有一定的要求。随着细胞壁的再生 和细胞的持续分裂，渗透剂的浓度须不断降低，和细胞的持续分裂，渗透剂的浓度须不断降低， 才对培养物的生长有利。用添加鲜培养基的方才对培养物的生长有利。用添加鲜培养基的方 法进行杨树原生质体培养，每周使渗透剂的浓法进行杨树原生质体培养，每周使渗透剂的浓 度降低度降低01molL，导致了培养

59、物的持续生，导致了培养物的持续生 长，易发育成愈伤组织并分化成再生植株。长，易发育成愈伤组织并分化成再生植株。 第九章原生质体培养 3.无机盐无机盐 无机盐以离子状态存在于培养基中，易于被无机盐以离子状态存在于培养基中，易于被 植物细胞吸收和利用，无机盐是培养基的主要构植物细胞吸收和利用，无机盐是培养基的主要构 成成分，根据其含量，可分头大量元素和微量元成成分，根据其含量，可分头大量元素和微量元 素两部分。素两部分。 在大量元素中，对原生质体培养效果影响最大的在大量元素中，对原生质体培养效果影响最大的 是是Ca2+和和 NH4+。较高的。较高的Ca2+浓度能提高原生浓度能提高原生 质体的稳定性

60、，这是由于质体的稳定性，这是由于Ca2+能保持原生质体质能保持原生质体质 膜的电荷平衡。因此很多游高原生质体的酶液中膜的电荷平衡。因此很多游高原生质体的酶液中 都添加一定量的都添加一定量的Ca2+和其他阳离子。在培养中，和其他阳离子。在培养中， 较高浓度的较高浓度的Ca2+对原生质体的生长发育同样有利。对原生质体的生长发育同样有利。 因此，在很多植物的原生体培养中，应用大量元因此，在很多植物的原生体培养中，应用大量元 素减半的素减半的MS培养基时，但培养基时，但Ca2+的浓度未降低，的浓度未降低， 仍保持不变。仍保持不变。 第九章原生质体培养 MS培养基中所用的浓度。培养基中所用的浓度。 虽然