生命科学学院63798

1、教 案20 05 20 06 学年 第 一 学期学 院、 系 室生命科学学院生物技术系课 程 名 称生物化学与分子生物学实验专业、年级、班级2002级生物科学、生物技术 2003级生物技术（专升本） 主 讲 教 师甘纯玑、李今煜、谢苗、沙莉福 建 农 林 大 学教案编写说明教案又称课时授课计划,是任课教师的教学实施方案。任课教师应遵循专业教学计划制订的培养目标，以教学大纲为依据，在熟悉教材、了解学生的基础上，结合教学实践经验，提前编写设计好每门课程每个章、节或主题的全部教学活动。教案可以按每堂课（指同一主题连续14节课）设计编写。教案编写说明如下：1、编号：按施教的顺序标明序号。2、教学课型表

2、示所授课程的类型，请在理论课、实验课、习题课、实践课及其它栏内选择打“”。3、题目：标明章、节或主题。4、教学内容：是授课的核心。将授课的内容按逻辑层次，有序设计编排，必要时标以“*”、“#”“？”符号分别表示重点、难点或疑点。5、教学方式、手段既教学方法，如讲授、讨论、示教、指导等。教学媒介指教科书、板书、多媒体、模型、标本、挂图、音像等教学工具。6、讨论、思考题和作业：提出若干问题以供讨论，或作为课后复习时思考，亦可要求学生作为作业来完成，以供考核之用。7、参考书目：列出参考书籍、有关资料。8、日期的填写系指本堂课授课的时间。福 建 农 林 大 学 教 案 编号：课时安排：8 学时教学课型

3、：理论课 实验课 习题课 实践课 其它题目（教学章、节或主题）：理论讲授、学生预习实验、实验预习报告面批教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：掌握实验准备的基本步骤熟悉实验操作步骤掌握实验中需要溶液的配制熟悉实验内容教学内容（注明：*重点 # 难点 ？疑点）：（*）实验室规则实验室安全及防护知识（*）实验预习、实验记录与实验报告实验室基本操作（#）缓冲溶液与pH测定生化实验室的基本设施与装备教学方式、手段、媒介： 讲授板书设计：1.1 实验室规则1.2 实验预习、实验记录与实验报告格式1.3 实验室安全及防护知识1.4 缓冲溶液与pH测定1.5 实验室基本操作1.6 生物化学与分子生物学

4、实验室的基本设施介绍讨论、思考题、作业：预习下周安排的实验参考书目：杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001年版周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003年版苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 11月 05日福 建

5、 农 林 大 学 教 案 编号：课时安排：8 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它题目（教学章、节或主题）：实验 酵母的提取与分离教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：掌握冷冻离心机的使用掌握缓冲液的配制熟悉RNA的特性反应及苯酚乙醇提取法做好实验记录教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）：原理酵母细胞置于含有的缓冲液中，加等体积的苯酚水溶液，通过激烈振荡一段时间，将和蛋白质分开，然后离心分层，溶于上层水溶液中，和蛋白质在酚层，可用乙醇沉淀析出。步骤1、取新鲜湿酶母或8g干酵母，加入50一缓冲液，再加入75 苯酚水溶液，在室温下激烈振荡，然后冷却至，以下操作均在进行。

6、2、上述提取液以离心，分离出上层水相，加入体积的乙酸钾溶液，再加入倍体积的乙醇。在一左右放置使沉淀析出。此沉淀可在冰箱中（）长期保存。亦可将沉淀以离心10 ，取沉淀用少许乙醇、醇和无水乙醇各离心洗涤一次，然后将沉淀溶于少量溶液中，保存备用(或真空干燥)。3、含量测定教学方式、手段、媒介： 实验讲授、操作示范、指导板书设计：讨论、思考题、作业：完成实验报告参考书目：杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001年版周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003年版苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年 何忠效，张

7、树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日福 建 农 林 大 学 教 案 编号：课时安排：8 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它题目（教学章、节或主题）：实验大蒜细胞的提取与分离教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：掌握冷冻离心机的使用掌握缓冲液的配制掌握研磨等基本操作熟悉SOD酶的一种提取法做好实验记录教学内容（注明：* 重点 #

8、难点 ？疑点）：原理：超氧化物歧化酶（）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢： 。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的，通过组织或细胞破碎后，可用.磷酸缓冲液提取。由于不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。步骤：1、组织或细胞破碎 称取左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。2、的提取 将上述破碎的组织或细胞，加入倍体积的0.05mol，7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000min下，离心15min，弃沉淀，得提取液。3、除杂蛋白 提取液加入0.25倍体积

9、的氯仿乙醇混合溶剂搅拌15min，5000r/min离心15min，去 杂蛋白沉淀，得粗酶液。4、的沉淀分离 将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min， 5000 rmin离心15min，得沉淀。 将沉淀溶于0.05mol，p7.8的磷酸缓冲液中，于5560热处理15min，离 心弃沉淀，得到酶液。 将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的活力。5、活力测定 取根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。 试 剂 空白管 对照管 样品管 碳酸缓冲液 溶液 蒸馏水 样品液 混 合 均 匀 肾上腺素液 在加入肾上腺素前，充分摇匀并在水浴中预热至恒温。加入肾上腺素（空白管不加），继续保温反

10、应 ，然后立即测定各管在处的光密度。对照管与样品 管的光密度值分别为和。在上述条件下，抑制肾上腺素自氧化的所需的酶量定义为一个酶活力单位。即： 酶活力（单位）(AB)N/A式中 N样品稀释倍数; 抑制肾上腺素自氧化的换算系数（100 / 50）。若以每毫升样品液的单位数表示，则按下式计算 酶活力单位/ml= 2(AB)N/AV/V1=26(AB)N/A式中V反应液体积（6.); V1样品液体积（0.）。最后，根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化过程收率。教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导板书设计：讨论、思考题、作业：完成实验报告参考书目：杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生

11、物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001年版周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003年版苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日福 建 农 林 大 学 教 案 编号：课时安排：8 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它题目（教学章

12、、节或主题）：实验 SDS-PAGE电泳教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：掌握SDS-PAGE的操作掌握电泳测定蛋白质分子量的方法掌握凝胶电泳中各种试剂的作用教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）：原理：SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。由于SDS

13、和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。操作过程：1、准备步骤1）将凝胶板依次用水、SDS、水、无水乙醇、水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。2）试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。3）灭菌枪头、eppendorf管。2、制备凝胶1）安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中，以5%琼脂封底。2）配制10%的分离胶（20ml）：依次将8ml蒸馏水，6.7ml 30%丙烯酰胺贮存液，5ml 1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液，0.2ml 10% SDS溶液，0.2ml 10%过硫酸铵，0.008mlTEMED

14、混合，立即灌胶。3）迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。小心在胶上覆盖一薄层正丁醇。4）在分离胶聚合的过程（约40分钟）中，配制5%的积层胶（8ml）：依次混合5.5ml蒸馏水，1.3ml 30%丙烯酰胺贮存液，1.0ml 1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液，0.08ml 10% SDS溶液，0.08ml 10%过硫酸铵，0.008TEMED。TEMED应在灌胶前才加入。5）分离胶聚合完全后，倒去正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面数次，用滤纸吸干胶面上的残余水。6）灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。7）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极

15、缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。8）在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。3、样品的制备在蛋白溶液中加入等体积的2样品溶解液，使蛋白的终浓度为3-4mg/ml，混合液在沸水浴中加热3分钟，冷却后即可上样。4、上样用微量进样器上样，每加入一种样品，应在下槽中洗涤加样器数次，最后在空白加样孔中加入等体积的SDS样品溶解液。5、电泳装好冷凝水系统，打开电源，初始电压为100-120V，当染料进入分离胶（这段时间约为20min）后，将电压提高到200-220V，继续电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。6、后处理1）固定：从电泳装置上卸下玻璃板，用镊子小心撬开玻璃板，除去积层胶部分，将分离胶

16、移入固定液（固定液的量至少为胶体积的5倍）中固定，直至染料由蓝绿色变为黄色。2）染色：除去固定液，加入染色液（用量同上），室温染色8小时或60染色2小时。3）脱色：回收染色液，将凝胶浸泡于脱色液中，直至背景脱至无色，其间更换脱色液3-4次。结果绘制蛋白图谱，并对其进行必要说明。注意事项N,N-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导板书设计：讨论、思考题、作业：完成实验报告参考书目：杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001年版

17、周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003年版苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日福 建 农 林 大 学 教 案 编号：课时安排：8 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它题目（教学章、节或主题）：实验 凝胶排阻层析教学目的要求（分掌握、熟悉

18、、了解三个层次）：通过杂蛋白的分离，学习分子筛层析的基本原理及操作方法。教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）：原理： 凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着

19、两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外

20、，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。操作过程：1凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。2装柱 纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25100倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，

21、样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为15125；对于纯化蛋白质来说应为1201100。将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0.5N1N）、碱 （0.5N1N）、盐（0.5M1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内部的气泡。关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm高。

22、打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。 最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有23cm高的缓冲液，同时关闭出水口。 3.平衡柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的pH和离子强度）平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为35倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。4加样与洗脱 样品体积不宜过多，最好为床体积的15%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱

23、液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.020.1Mol/L pH 6.98.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。5洗脱液收集 由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5ml / 管。这视具体情况而定。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导板书设计：讨论、思考题、作业：完成实验报告参考书目：杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学

24、与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001年版周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003年版苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日福 建 农 林 大 学 教 案 编号：课时安排：8 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它题目（教学章、节或

25、主题）：实验多糖的水解及水解物的薄层层析测定教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：通过氨基酸的分离，学习薄层层析法的基本原理及操作方法。教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）：原理：多糖是生物体的重要组成成分，是由各种糖单元组成的大分子化合物。在酸或酶的作用下，最终可水解成单糖。由于硅胶对各种单糖的吸附力不同，所以用硅胶制备的薄层层析板可以对单糖混合液进行分离。操作过程：（）样品水解取样品10mg，放入10ml胶木螺口离心管中，在冰水浴上冷却，加入0.1ml 80%硫酸溶液，旋紧螺口盖，于室温下水解18h。再于冷水浴中冷却，加入1.3ml蒸馏水，使硫酸的浓度为1mol/L，旋紧螺口

26、盖，于沸水浴中加热水解5小时。室温冷却，开管。用稍过量的碳酸钙粉末中和，于4000转/min下离心沉淀5min。移取200l清液，置离心管中，于离心真空干燥器中干燥，备用。点样前加0.1ml蒸馏水，将干燥的样品溶解。（）点样将样品分别点在经活化的薄层层析板上，点样量约，分次滴加，使点扩散后的直径不超过3。（）展层将点样后的薄层板置于密闭的薄层层析缸中，用新配制的展开剂，采用上行法展层，至展开剂距薄层板的上端约cm时取出，用吹风机吹干。（）显色采用苯胺二苯胺磷酸（2g二苯胺，加2ml苯胺，10ml 85%磷酸，1ml浓盐酸，100ml丙酮，溶解后混匀）显色剂丙酮溶液喷雾法显色，然后于烘箱中烘分钟

27、，各种糖即呈现出不同的颜色。（）结果计算小心量出原点至溶剂前沿，以及各斑点中心的距离，计算出它们的值。根据标准糖的颜色和值，鉴定出样品中糖的种类，并绘出层析图谱。 原点至斑点中心的距离。原点至展开剂前沿的距离教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导板书设计：讨论、思考题、作业：完成实验报告参考书目：杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001年版周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003年版苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年张龙翔，张庭

28、芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年教师姓名：李今煜 谢苗 沙莉 职称：讲师 助教 助教 2004 年 月 日福 建 农 林 大 学 教 案 编号：课时安排：8 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它题目（教学章、节或主题）：实验 菜花（花椰菜）中核酸的分离和鉴定教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：初步掌握从菜花中分离核酸的方法，和、的定性检定。教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）：原理：用冰冷的稀三氯醋酸或稀高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物质；再

29、用有机溶剂，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。最后用浓盐溶液（氯化钠溶液）和0. 5mol/L高氯酸（）分别提取和，再进行定性检定。 由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用定糖法来定性定量测定核酸。 核糖的测定： 测定核酸的常用方法是苔黑酚 （ 即：，二羟甲苯 ）法（Orcinol反应）。当含有核糖的与浓盐酸及， 二羟甲苯在沸水浴中加热分钟后，有绿色物产生，这是因为脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与，二羟甲苯作用产生绿色物质。 100 浓盐酸二羟甲苯 绿色复合物 FeCl3 、蛋白质和粘多糖等物质

30、对测定有干扰作用。 脱氧核糖的测定： 测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热分钟后，产生蓝色。这是因为嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成羟基酮基戊醛，它再和二苯胺作用产生蓝色物质。 100 少量浓24二苯胺 蓝色物 此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。 上述两种定糖的方法准确性差，但快速简便，能鉴别与，是检定核酸、核苷酸的常用方法。操作过程：一、核酸的分离： 取菜花的花冠20克，剪碎后置于研钵中。加入20毫升乙醇和毫克海砂，研磨成匀浆。然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。 滤渣中加入毫升丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤液。 再向滤渣中加入毫升丙酮，搅拌分钟后

31、抽干（用力挤压滤渣，尽量除去丙酮）。 在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的毫升高氯酸溶液中。搅拌抽滤，弃去滤液。 将滤渣悬浮于毫升乙醇中，抽滤，弃去滤液。 滤渣中加入毫升丙酮，搅拌分钟。抽滤至干，用力挤压滤渣尽量除去丙酮。 将干燥的滤渣重新悬浮在毫升氯化钠溶液中。在沸水浴中加热分钟。放置，冷却，抽滤至干，留滤液。并将此操作重复进行一次。将两次滤液合并，为提取物一。 将滤渣重新悬浮在毫升mol/L高氯酸溶液中。 加热到，保温分钟(恒温水浴)后抽滤。留滤液(提取物二)。二、的定性检定： 二苯胺反应： 管 号 蒸馏水（毫升） 溶液（毫升） 溶液（毫升） 提取物一（毫升） 提取物二（毫升） 二苯胺试剂（毫升

32、） 放沸水浴中分钟后的现象 苔黑酚反应： 管 号 蒸馏水（毫升） 溶液（毫升） 溶液（毫升） 提取物一（毫升） 提取物二（毫升） 三氯化铁浓盐酸溶液（毫升） 2 苔黑酚乙醇溶液（毫升） 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 放沸水浴中10-20分钟后的现象 根据现象分析提取物一和提取物二主要含有什么物质。教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导板书设计：讨论、思考题、作业：完成实验报告参考书目：杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001年版周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003年版苏拔贤主编，生物化学制备

33、技术，科学出版社，1994年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日福 建 农 林 大 学 教 案 编号：课时安排：6 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它题目（教学章、节或主题）：实验 质粒DNA的提取及酶切教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：掌握碱裂解法提取E.coli质粒的原理熟练掌握碱裂解法操作的步骤方法教学内容

34、（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）：重点：碱裂解法的原理难点：移液枪的正确使用、实验操作过程中避免杂质污原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.012.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网

35、状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。提取质粒过程：将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌，37振荡培养过夜。取1.5ml培养物倒入微量离心管中，12000r/min离心30sec。吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。将细菌沉淀悬浮于100L溶液I中，剧烈振荡。加200L溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将离心管放在冰上。加入150L溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置1min。12000r/min，离心1min，将上清夜转至另一离心管中。向上

36、清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置510min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥。10、50LTE缓冲液，其中含有20g/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20保存。p 酶切反应(按顺序依次加入各种组分，尽量在冰盒上操作) 反应体系的建立（10L）提取的质粒 2Lbuffer 1LEcoRI 0.5L水 6.5L教学方式、手段、媒介：板书设计：讨论、思考题、作业：完成实验报告参考书目：杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出

37、版社，2001年版周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003年版苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日福 建 农 林 大 学 教 案 编号：课时安排：6 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它题目（教学章、节或主题）：实验 琼脂糖凝胶电泳检测D

38、NA教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）：重点：琼脂糖电泳技术检测DNA的原理难点：操作中，学生要注意安全问题，避免与致癌物质EB接触原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段

39、泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA,简称CCCDNA），开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂（open circular DNA ,简称OCDNA），线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linear DNA,简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此

40、电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。实验步骤：制备琼脂糖凝胶加样电泳结果观察教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导板书设计：讨论、思考题、作业：完成实验报告参考书目：杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001年版周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003年版苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年 卢圣栋主编

41、，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日福 建 农 林 大 学 教 案 编号：课时安排：6 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它题目（教学章、节或主题）：实验 PCR基因扩增教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：掌握PCR反应的基本原理掌握PCR仪的操作使用教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）：重点：PCR反应的基本原理难点：PCR反应体系中多种组分的作用实验原理讲解：多聚酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）的原理类似于DNA的

42、天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。实验步骤：在0.5ml Eppendorf管内配制25L反应体系：反应物体积/L10buffer2.0引物11.0引物21.0dNTP1.0Taq酶0.5Template1ddH2O13.5石蜡油20按下列程序进行扩增：、95预变性5min、95变性1min、55退火2min、72延伸3min、重复步骤30次；、72延伸10min琼脂糖凝胶电泳分析PCR

43、结果配制0.7%琼脂糖凝胶，取10L扩增产物电泳。保持电流40mA。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果。教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导板书设计：讨论、思考题、作业：完成实验报告参考书目：杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001年版周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003年版苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年 卢圣栋主编，现

44、代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年教师姓名：李今煜 谢苗 沙莉 职称：讲师 助教 助教 2004 年 月 日福 建 农 林 大 学 教 案 编号：课时安排：4 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它题目（教学章、节或主题）：实验 探针制备教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：掌握地高辛标记探针的制备方法教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）：重点：探针制备的方法步骤难点：DIG标记的原理实验原理讲解： 探针实际是已知的基因片段，应该该片段与待测样品杂交，如果靶基因和探针的核苷酸序列互补，就可以根据碱基配对的原则进行核酸分子杂交，从而达到检测的目的。地高辛标

45、记探针利用偶联抗体或抗生物素蛋白的磷酸酯酶检测经修饰的碱基，用氮蓝四唑（Nitro blue tetrazolium, NBT）显色，氮蓝四唑转变为不溶于水的有色物质，沉淀在杂交的原位。采用随机引物法筛标记反应液，以随机合成的六聚体核苷酸（hexanucleotiide）为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和DIG-11-dUTP为合成底物，单链DNA为模板，在Klenow酶的作用下，合成渗入DIG的DNA链。地高辛标记属高效标记反应，以1g DNA探针为例，1h反应可产生0.8g 标记探针，20h可产生2g 探针。同时，该标记方法操作简单，适用于含量10ng-3g ，片段大小100bp-10kb，线性或高度卷曲DNA探针制备。实验步骤：1、 用超纯水稀释1g DNA至总体积16g 。2、 DNA热变性：将DNA置沸水中，水浴10min，迅速插入冰中3min以上。3、 加4l DIG random labeling Mix（高效），混匀后2000rpm离心5min。4、 置37反应至少2h，反应时间越长，产量越高。5、 加入2l 0.2M EDTA或65度10分钟终止反应。反应液可在-20保存至少1年以上，可反复使用。教