液相色谱_四极杆飞行时间质谱法分析头孢拉定中的主要杂质_潘芳芳

1、药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33( 1) 133 液相色谱 四极杆飞行时间质谱法分析头孢拉定中的主要杂质1 ，2 ，2 ，1，2*潘芳芳朱培曦黄巧巧杨伟峰( 1 浙江工业大学化学工程与材料学院，杭州 310014; 2 浙江省食品药品检验研究院，杭州 310004)摘要目的: 采用液相色谱 四极杆飞行时间串联质谱法( HPLC Q TOF MS) 分析头孢拉定中主要杂质并对其结构进行鉴定。方法: 色谱柱为 Kromasil 100 5C18 ( 250 mm 4. 6 mm，5 m) ，流动相为甲醇 10 mmolL 1 醋酸铵溶液( 30 70) ; 离子源:

2、 ESI 离子源; 扫描模式: 正离子扫描。结果: 本方法通过四极杆 飞行时间二级质谱图特征碎片的分析确定了头孢拉定中1. 32% 的未知杂质为双氢头孢拉定，同时推测该杂质可能是中间体双氢苯甘氨酸中的杂质( 四氢苯甘氨酸) 参与合成引进的。结论: 本方法鉴定了头孢拉定中的 1 个未知杂质，进而可以对药品杂质控制和工艺优化提供参数。关键词: 内酰胺抗生素; 头孢拉定; 有关物质; 双氢头孢拉定; 杂质结构鉴定; 液相色谱 四极杆飞行时间串联质谱法; 高分辨率; 安全监测中图分类号: R917文献标识码: A文章编号: 0254 1793( 2013) 01 0133 06HPLC Q TOF M

3、S identification of major impurities in cefradine1 ，2 ，2 ，1，2*PAN Fang fangZHU Pei xiHUANG Qiao qiaoYANG Wei feng( 1 College of Chemistry Engineering and Materials Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China; 2 Zhejiang Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 310004，China)Ab

4、stractObjective: To establish an HPLC Q TOF MS method for the identification of major impurities incefradine Methods: The HPLC was performed on a Kromasil 100 5C18 column( 250 mm 4. 6 mm，5 m) with methanol 10 mmolL 1 a mmonium acetate ( 30 70) as mobile phase Data was collected under positive ion mo

5、des with ESI as ion resource Results: The method identified an impurity with the content of 1. 32% as di-hydrocefradine based on analysis the feature fragmentation from Q TOF It was speculated that the impurity was introduced by intermediate dihydrophenylglycine impurities involved in the synthesis

6、process Conclusion: The method identified an unknown impurity in cefradine，and thus provide reference to its quality control and process optimizationKey words: lactam antibiotics; cefradine; related compounds; dihydrocefradine; impurity structure identification; HPLC Q TOF MS; high resolution; safet

7、y monitoring头孢拉定( cefradine，结构见图 1) 是第 1 代头孢菌素类中一种广谱、耐酶抗生素，用于治疗产青霉素酶金葡菌及某些革兰阴性菌感染，临床应用本品不良反应的发生率约为 6% ，腹泻、恶心、呕吐等胃肠1。头孢拉定中的杂质道反应较为多见，次为药疹2，故杂质研究是 内酰胺可能导致其不良反应类抗生素的重要研究内容之一。 内酰胺类抗生素一般由微生物发酵、纯化、精制以及化学修饰等过程制得，与一般化学合成药物相比生产过程更加复杂，其纯度一般也较化学药品低，而且该类抗生素对热、光和湿的稳定性较差，因此更应该对其杂质进行图 1头孢拉定结构图Fig 1The structure of

8、 cefradine*通讯作者Tel: E mail: ywfhz 163. com 134 药物分析杂志 Chin JPharm Anal 2013，33( 1)3 4。王维等应用凝胶色谱法测定了头min 1，柱温 30 ，检测波长 254 nm，进样体积 10 L。深入研究5。查阅相关文献，2. 2质谱条件 质谱仪使用 ESI 离子源，在正离子孢拉定胶囊中的高分子杂质头孢拉定中的主要杂质还有头孢氨苄、双氢苯甘模式下采集数据，数据采集范围 m /z 100 1800，离氨酸和 7 氨基去乙酰氧基头孢烷酸 ( 7 AD-子源前进样分流比为 3 1。毛细管电压: 3.

9、8 kV; 锥CA) 6 7。孔电压: 65 V; 喷雾气压: 0. 24 MPa; 干燥气( 氮气)中国药典 2010 年版二部收载了头孢拉定的有流量: 10 Lmin 1 ; 干燥气温度: 350 ; 裂解电压7，并对上述已知杂质含量用外标150 V。关物质检查方法法进行了控制，但在实验时发现有一主要杂质成分2. 3溶液的制备不明。为此运用高分辨率串联质谱法对此未知杂质2. 3. 1供试品溶液 精密称取头孢拉定约 20 mg，进行了结构确定，提出其质谱可能的碎裂机理，推测置于 20 mL 量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇其可能的来源，并为药物的杂质控制和工艺优化提匀，即得。供参数。2.

10、 3. 2对照溶液 取供试品溶液 1. 0 mL，置 2001仪器与试药mL 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。1. 1仪器Agilent 1290 HPLC 高效液相色谱仪、2. 3. 3定位溶液 分别取对照品 7 ADCA、双氢Agilent 6538 Q TOF 质谱仪、Mettler AE240 电子分苯甘氨酸、头孢氨苄、头孢拉定约 20 mg，分别置析天平。20 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，1. 2试药甲醇( 色谱纯，Merck 公司) ，醋酸铵和即得。醋酸( 分析纯，国药集团化学试剂有限公司) ，Milli2. 4实验结果 Q 纯化水，头孢拉定( 宁波大红鹰药

11、业有限公司提根据“2. 1”项下色谱条件分析样品得到色谱供，批号 051008 20173) ，对照品 7 ADCA( 批号图( 图 2) 。根据定位结果分析得到图中 1、2、3 号30416 200605) 、头孢拉定( 含量 91. 8% ，含头孢氨峰分别是头孢氨苄、头孢拉定和未知杂质，其中标苄 1. 0% ，批号 30427 200306 ) 、头孢氨苄 ( 含量示框内的峰中有 7 ADCA 和双氢苯甘氨酸，框内94. 4% ，批号 130408 200710) 、双氢苯甘氨酸( 含7头孢拉定质量的峰在中国药典 2010 年版二部量 98. 8% ，批号 130434 200202) 均

12、购自中国食品标准中主要采用杂质对照品进行定位和测定，此药品检定研究院。次研究未对其进行进一步的分析。以 0. 5% 的自2方法与结果身对照法计算样品中保留时间为 15. 163 min 的杂2. 1色谱条件采用 Kromasil 100 5C18 ( 250 mm 质含量达 1. 32% ，ICH 提出任何未知杂质限度超，) 色谱柱，流动相为甲醇 1过 0. 1% ，应对该杂质进行结构确定和生物安全性4. 6 mm 5 m 10 mmolL8 9醋酸铵( 用醋酸调节 pH 至 4. 0) ( 3 7) ，流速 1. 0 mL。验证图 2样品的液相色谱图Fig 2Chromatogram of

13、sample药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33( 1) 135 取“2. 3”项下供试品溶液进行质谱分析得到质则三者含有奇数个氮原子; 三者都具有加 1 的同位谱图( 图 3、4) ，并且将分子离子峰及各碎片离子的素峰，且相对丰度分别为 19. 9% 、18. 8% 、19. 7% ，8 9结果分别列于表+实际值与理论值的误差计算根据表 1 中的M + H 结构式得到的分子式计算理1、表 2 中。从图 3 可以看出，一级质谱中头孢氨苄论的相对丰度均为 19. 6% 和不饱和度为 10、9、8。从有稳定的加氢峰 m /z 348. 1017 和加钠峰 m /z图 4

14、 可以看出，在设定的 ESI 条件下三者二级质谱中370. 0833，头孢拉定有稳定的加氢峰 m /z 350. 1162的分子离子峰依稀可见且得到的碎片离子信息清晰和加钠峰 m /z 372. 0992，未知杂质有稳定的加氢峰可见，碎片断裂信息主要集中在不稳定的 内酰胺m /z 352. 1323 和加钾峰 m /z 390. 0885，表明化合物四元环、氨基、酰胺键。比较表 1、2 的计算结果，表明A、B、C 的相对分子质量为 347、349、351，根据氮规理论值与实验值非常接近，偏差均小于5 10 6 。图 3样品中 3 个化合物在正离子模式下获得的一级质谱图Fig 3MS1 spec

15、tra of the three compounds in the test under positive ion modeA 头孢氨苄( cephalexin)B 头孢拉定( cefradine)C 未知杂质( unknown impurity)图 4样品中 3 个化合物在正离子模式下获得的二级质谱图Fig 4MS2 spectra of the three compounds in the test under positive ion modeA 头孢氨苄( cephalexin)B 头孢拉定( cefradine)C 未知杂质( unknown impurity) 136 药物分析杂志

16、 Chin J Pharm Anal 2013，33( 1)表 1一级质谱中分子离子峰理论值与实验值的偏差计算Tab 1 Deviation calculation of theoretical values and experimental values of molecular ion in MS1化合物( compounds)M + H+实验值( experimental values) m /z理论值( theoretical values) m /z偏差( deviation) / 10 6头孢氨苄( cephalexin)C16H18N3O4S348. 1017348. 10131

17、.1头孢拉定( cefradine)C16H20N3O4S350. 1162350. 1169 2.0未知杂质( unknown impurity) *C16H22N3O4S352. 1323352. 1326 0.8* 其分子式由软件根据分子离子峰以及同位素峰计算而来，匹配分值为 98. 67( The molecular formula is calculated by software according to the molecular ion peak and isotope peak and the matching score is 98. 67)表 2二级质谱中主要的碎片离子峰

18、理论值与实验值的偏差计算Tab 2Deviation calculation of theoretical values and experimental values of the main fragment ion in MS2化合物( compound)M + H+实验值( experimental values) m /z理论值( theoretical values) m /z偏差( deviation) 10 6头孢氨苄( cephalexin)C16H18N3O4S348. 1005348. 1013 2. 3C10H8NO2174. 0550174. 05500.0C6H8NO

19、2158. 0269158. 02700.6C7H8N106. 0654106. 06512.8头孢拉定( cefradine)C16H20N3O4S350. 1170350. 11690.3C16H17N2O4S333. 0906333. 09040.6C10H13N2O2193. 0970193. 0972 1. 0C10H10NO2176. 0707176. 07060.6C6H8NO2158. 0270158. 02700.0C8H10NO136. 0755136. 0757 1. 5C7H10N108. 0811108. 08082.8未知杂质( unknown impurity)C

20、16H22N3O4S352. 1334352. 13262.3C16H19N2O4S335. 1075335. 10604.5C10H12NO2178. 0861178. 0863 1. 1C6H8NO2158. 0272158. 02701. 3C7H12N110. 0968110. 09643. 63讨论m /z 108. 0811碎 片 中 的 推 断 是 成 立 的，m /z3. 1头孢拉定裂解分析 由于 3 个化合物的不饱108. 0811 碎片结构相对简单，侧链中无法再增加 2和度依次差 1，结合表 2 和图 4 分析可得，3 个化合个 H 原子，那么同样可以推测增加 2 个双键的

21、结物具有同一的 m /z 158. 0270 的离子碎片，推断该碎构为头孢拉定中环己二烯基换成环己烯基的结构片是由 内酰胺环断裂产生，故 H 原子的增加或即为双氢头孢拉定。可能是 1、2 位双键打开，也减少与此碎片无关，即此结构为三者都有; 根据图 4有可能 4、5 位双键打开，还有 2 种杂质同时存在，中方框标示可以看出增加或减少 2 个 H 原子发生双氢头孢拉定的可能裂解机理见图 6。可以看出在头孢拉定 m /z 108. 0811、176. 0707、333. 0906 碎四极杆 飞行时间串联质谱具有高分辨率、高准片中，同时可以说明这 3 个碎片中有共同的结构片确度，可以获得待测物质的准

22、确分子量，并产生可段。根据头孢拉定的结构推测 m /z 108. 0811 碎片能的分子式，根据二级裂解碎片信息推测分子可的来源如图 5 所示，已知头孢氨苄结构是头孢拉定能的结构，为药物杂质鉴定提供一种快速、灵敏、的环己二烯基换成苯基，故减少 2 个 H 原子发生在10 13。准确的方法图 5头孢拉定其中 1 条裂解途径Fig 5Proposed fragmentation pathway of cefradine药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33( 1) 137 图 6双氢头孢拉定可能的裂解机理Fig 6Plausible fragmentation pathw

23、ay for dihydrocefradine3. 2 测未知杂质的可能来源 根据参考文献15的合成路线，可以推测杂质双氢头孢拉定是由于初始原料双氢苯甘氨酸中的杂质参与合成引进的，双16，氢苯甘氨酸由苯甘氨酸还原而来在还原过程中图 7双氢苯甘氨酸的合成Fig 7The synthesis of dihydrophenylglycine故作为头孢拉定合成的重要中间体的双氢苯甘氨酸的制备工艺和纯化工艺有待进一步探索和改善，使双氢苯甘氨酸的纯度更高才能降低头孢拉定中该杂质的组成，为用药安全提供源头上的保证。参考文献1 WANG Wei( 王维) Determine polymer impurity

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