生化分离技术(主要内容)

1、生化分离技术：描述回收生物产品分离过程原理和方法的术语，是指从动植物组织培养液或微生物发酵液中分离、纯化生物产品过程中所采用的方法和手段的总称。生化分离过程是生物技术转化为生产力不可缺少的重要环节，其技术进步程度对生物技术的发展有着举足轻重作用，为突岀其在生物技术领域中的地位和作用，常称它为生物技术的下游工程。毗t广誓iWW Flaln4ihar (Hrnvmnraimn m maaarMBraarar ii那产掷j离心介离WpH研荃ft为鼻干Ji结 岂阳:1生凉曲术下舒忙寸坦时阳棘野麻扯牌单元扭中分离纯化过程的难点：目的产物在细胞或反应液中含量不高，杂质种类多，数量大；杂质性质与产物相似；产

2、物稳定性不高。生化分离技术的主要种类：沉淀分离（盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性沉淀、非离子聚合物沉淀）；膜分离（透析、微滤、超滤、纳滤、反渗透）；层析分离（吸附、凝胶、离子交换、疏水、反相、亲和层析）；电泳分离（SDS-PAGE、等电聚焦、双向电泳、毛细管电泳）；离心分离（低速、高速、超速离心分离技术） ，生化分离的特点：成分复杂；含量甚微；易变性 /易被破坏；具经验性；均一性的相对性。预处理需注意的条件： 温度尽可能低提取液的量要保证充分浸入”加入足量酚类吸附剂加入足量氧化酶抑制剂搅拌转速要恰当 pH控制在合适范围，一般 5.571i1版纤F吐JR4+5E 皐，康 ft.山s；2*叵空西-即

3、幵ftWV增報巧乃世 血妙睥过K事ffl aa 他感曲臓讨槌的滸妻细胞的破碎：用一定方法（机械/物理/化学/酶法）打开细胞壁或膜，使细胞内含物有效释放出来。 *34堀艷罐碑的方法细胆的磁碎4I1HM岸机梟Iff倬剪切 +Tti一-;1超声at机昨拌压力研講旅力1化于M硏*和硏1Hu Rhea空弋希茁从百母淮机.喪曲tit嘩血帥忖忸舟1机x佯带相.fitChaikcffFLK挤压：微生物细胞在高压下通过一个狭窄的孔道高速冲岀，因突然减压而引起一种空穴效应，使细胞破碎沉淀：溶液中溶质由液相变成固相析出的过程。本质：通过改变条件使胶粒发生聚结，降低其在液相中的溶解度，增加固相中的分配率。作用：分离、

4、澄清、浓缩、保存广 业析/ | 带机牡倒況.健厂乂匸臨于華茉佯起班注 1； （ 2）理论塔板数N尽可能大；（3） k工0 o 对极性组分： 用极性较小溶剂溶解样品 /上样 /吸附；用极性较大 的溶剂作洗脱剂。凝胶过滤层析原理：利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 据被分离物分子大小不同进行分离 .凝胶过滤层析优点：分离条件温和；样品回收率高；实验重复 性高；操作时间短，简便，经济 o 凝胶参数：排阻极限（用 A 类分子中最小分子量表示） ；工作（分级）范围（ B 类分子的分子量范围） o溶质洗脱的异常：分配系数Kd 1 :凝胶对溶质分子可能有吸附作用（疏水、亲和、静电作用） 惰性； 稳定； 色

5、谱性能好。单体：丙烯酰胺 CH2=CH-CONH2 交联剂：N,N -甲叉双丙烯酰胺CH2=CH-CONH-CH2-NHCO-CH=CH2型号Bio-Gel p-x中，x范围：2300其中x=工作范围上限/1000（二）稳定性1 、化性稳定pH范围2112、物性同 Sephadex（三）色谱性能1、 总工作范围：10040万2、吸附：离子 I 0.02 mol/L 交联丙烯基葡聚糖（ Sephacryl）一）结构单体：烯丙基右旋糖苷 交联剂：N,N -甲叉双丙烯酰胺 凝胶：较硬，强度大型号： Sephacryl S-200， S-300， S-400， S-500， S-1000型号愈高，孔径

6、愈大，其分子量分离范围可查表（二）稳定性pH 2 11较 Sephadex 抗压（三）色谱性能工作范围：10007亿吸附性： I 0.05 mol/L琼脂糖凝胶（ Sepharose）一）结构B -D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的 线性多聚糖糖浓度越大，网孔越小型号：Sepharose 2B 4B、6B表示糖浓度 2%Bio-Gel A 0.5150M 表示工作范围上限 （二）稳定性1 、化性稳定pH范围4.59.02、物性抗热性：较差，只能在 045 C使用 抗压性：较好，与浓度有关凝胶过滤色谱应用： . 分离1. 组别分离：A类与B类、B类与C类、A类与C类间2. 分级

7、分离：B类分子间的分离（三）色谱性能总工作范围：1034X 107 （4000万）吸附性：I 0.02 mol/L交联琼脂糖（ Sepharose CL-XB ） 结构强碱条件下用 2,3二溴丙醇或环氧氯丙烷进行交联 稳定性化性：pH 314物性：抗热、抗压均提高 色谱性能工作范围： 同 Sepharose吸附性：下降 . 分子量测定：需先作标准曲线，常用VelgMw凝胶过滤色谱实验设计要点：1.高分辨率；2.回收率高（减少峰宽，可提高回收率）；3.减少稀释；4.短时间凝胶过滤色谱应用举例：脱盐；缓冲液交换；测定多聚物的分子量分布；混合物的分级分离；蛋白质的复性离子交换层析 IEC 原理：因溶

8、质分子带不同性质电荷和不同电荷量， 变化，从而达到分离目的的技术。离子交换剂是离子交换技术的核心和基础： 基质：母体和骨架，水不溶性化合物 功能基团：共价结合在基质上 反离子 （平衡离子 ）：与功能基团带相反电荷 功能基团决定了离子交换剂的基本性质：1、功能基团的类型决定离子交换剂的类型 功能基团是酸性基团阳离子交换剂 功能基团是碱性基团阴离子交换剂2、功能基团的解离性质决定离子交换剂强弱 强弱不是指可交换分子与交换剂结合的牢固程度 取决于带电功能基团的 pKa （电离平衡常数 ） 强型及弱型离子交换剂共性：当层析pH远离pKa时，无论强型还是弱型离子交换 剂都能牢固吸附可交换分子；阳离子交换

9、剂应用时有 pH 下限，低于此 pH 功能基团 开始失去负电荷，强酸型 pH 下限低于弱酸型； 弱碱型交换剂应用时有 pH 上限，高于此 pH 功能基团 开始失去正电荷， 季铵基 （任何 pH 都不会失去正电荷 ） 型强碱性交换剂无 pH 上限。交换容量 ：指离子交换剂能结合溶液中可交换离子的能力，常 分为总交换容量和有效交换容量。1、总交换容量 ：指单位质量或体积的离子交换剂中已解离或可 能解离的功能基团的总量，其数值大小取决于离子交换剂的取 代程度即电荷密度；基础参数：对某种特定交换剂，其数值恒可在固定相和移动相之间发生可逆交换作用而使溶质移动速度2、实际 （有效 ）交换容量 ：指每克干介

10、质或每毫升湿胶在一定的 实验条件下吸附某种分子的实际容量。 有效交换容量是变值，论及其数值时应同时给出实验条件； 单位：g溶质/g IE ; g溶质/mL IE 静态容量的测定：试管小样法取若干支试管，分别加入相同体积的已用起始缓冲液 平衡好的离子交换剂；分别加入一系列不同浓度的 Pr溶液，混合振荡确保充 分吸附；分析上清液中是否含 Pr 成分，据能使上清液中无 Pr 的最大 Pr 浓度可推算出每毫升离子交换剂能吸附的Pr 的上限，此即为静态容量。动态容量的测定 （层析条件下 ） 取一定体积离子交换剂装柱，用起始缓冲液平衡；特定流速下加样（样品浓度1 5mg/mL），不停加样至 检测出有 Pr

11、 流出，读数达到最大值一半停止加样 （起 始缓冲液和样品液的读数分别为0、 100）；停止加样，用起始缓冲液将不吸附的Pr洗出；改变缓冲液条件，使 Pr 从柱上解吸；收集洗脱液，测定出其总 Pr，用此总Pr除以离子交 换剂体积可算出该交换剂在此流速下动态容量。离子交换层析的本质： 起始条件下溶液中离子强度较低，上样后，目的物与离子交 换剂的结合能力更强，能取代离子而吸附到交换柱上；洗脱时，提高溶液离子强度来增强离子的竞争性结合能力， 使目的物从交换剂上解析。溶质的电荷性质：蛋白质在离子交换剂上发生吸附是因其表面 带电荷蛋白质分子带电基团的来源：特定的氨基酸或蛋白质 修饰过程中引入；蛋白质分子所

12、带电荷种类和数量并非常数，与溶液pH 直接相关：pHpI 时，蛋白质带净的负电荷 比较样品中目标蛋白和主要杂蛋白的滴定曲线，有助于离子交 换层析起始条件选择。对基本信息不明的蛋白质，常先尝试在略偏碱性条件 下采用阴离子交换剂进行层析分离；Pr 样品等电点信息对层析条件选择很有价值，要选择 分辨率较高的层析条件， 须获得各组分分子电荷随 pH 变化的情况 （Pr 滴定曲线 ）.Pr 等电点测定：等电聚焦电泳法Pr 滴定曲线：电泳法蛋白质层析行为：不仅取决于所带电荷种类和数量 还与蛋白质分子中电荷分布密切相关处于蛋白质分子的内部电荷 （它们可能形成盐键维持蛋 白质的空间结构 ）对蛋白质层析行为并不

13、产生影响， 而取决于蛋 白质的表面电荷。 层析相关区域：蛋白质表面的电荷分布大多不均匀，某些表面 区域内电荷可能较密集，此区域往往就是离子交换时与交换剂 发生接触的区域，称为层析相关区域，此区域的电性质决定了 蛋白质能与何种离子交换剂结合。Z 值是指蛋白质分子上与离子交换剂发生相互作用的带电位点 的数目。进行离子交换层析时：Z 值越大，蛋白质与交换剂的结合越牢固Z 值越小，蛋白质与交换剂的结合越松弛Z 值是多种因子综合作用的平均值：Z 值与蛋白质净电荷间无直接关系，分子量大的蛋白 质与离子交换剂间的接触位点未必多于分子量小的蛋 白质；蛋白质的构象变化将造成电荷分布情况的改变而引起Z 值变化；层

14、析时加样量增加， Z 值会下降。 影响目的物与离子交换剂结合的因素：溶液pH,它决定了目的物的带电状态蛋白质的层析相关区域，即电荷在蛋白质表面的分布情况溶液中离子的种类和离子强度pH 的影响：目的物的 pH 稳定范围：超出此范围会造成目的物活 性丧失、回收率下降唐南效应离子交换剂表面 pH 与溶液 pH 不一致 阳离子交换剂表面 pH 比周围缓冲液低 1 个 pH 单位 阴离子交换剂表面 pH 比周围缓冲液高 1 个 pH 单位 离子种类的影响：不同离子从离子交换剂上将目的物置换下来的能力不 同；离子类型还对分辨率和不同目的物的洗脱顺序产生影 响离子强度的影响： 低离子强度下,目的物通过荷电基

15、团结合至离子交换 剂上带相反电荷的功能基团上； 竞争离子浓度即溶液离子强度逐渐升高时,目的物逐 渐被置换下来, 绝大多数目的物在 1mol/L 的盐浓度下 能被洗脱。离子交换动力学的五步骤 ：（ 1）膜扩散：蛋白质通过扩散穿过水膜到达凝胶表面的过程, 其速度取决水膜两侧蛋白质的浓度差（ 2）粒子扩散： 蛋白质分子进入凝胶颗粒网孔并到达发生交换 的位置的过程（3）蛋白质取代离子交换剂上的反离子而发生离子交换；（4） 被置换下来的反离子扩散到达凝胶颗粒表面,即粒子扩散, 方向与步骤 2 相反；（ 5）反离子通过扩散穿过水膜到达溶液中,也即膜扩散,方向 与步骤 1 相反。目的物的解离曲线已知 pI

16、时,一般首先考虑蛋白质的带电情况：对 pI=5 的酸性蛋白DEAE纤维素柱色谱，可选 pH5.59.0CM纤维素柱色谱则限于 3.54.5对 pI=8 的碱性蛋白CM纤维素柱色谱，可选 pH3.57.5DEAE纤维素柱色谱则限于 8.59.5具体还需考虑（1）目的物的稳定性（ 2）唐南效应 （Donnan）如阴IE pH表面pH溶液 约1个pH单位 阳IE pH表面V pH溶液约1个pH单位 目的物分子大小 其它考虑：吸附选择、流速、经济性、文献影响吸附平衡常数或分布系数a的因素：pH 影响电性与电量I上升，a下降，减弱吸附 溶质的电荷分布、 IE 的电荷分布及位阻效应 与溶质的浓度成反比（2

17、）梯度洗脱：洗脱缓冲液的离子强度或 pH 连续变化，能获得 较高的分辨率峰宽通常小于阶段洗脱拖尾现象明显改善或完全消除 不会造成同一组分被分离称几个峰C 梯度洗脱的策略a 梯度形状的选择线性梯度：目的物首次分离， NaCl 0 0.5mol /L 凸形梯度：梯度末尾部分分辨率不好时使用 凹形梯度：梯度起始部分分辨率不好时使用混合梯度 组分吸附能力相近需改善分辨力的位点提供足够分辨率 分辨力不作要求的位点采用陡峭的梯度缩短时间b 梯度的高度和斜率较低斜率：吸附能力相近组分间分辨率T,峰宽加大，分离时间T较大斜率：快速分离，尖峰，不同组分的分离度差异 减小c 流速 ：适当降低流速可提高层析的分辨率

18、 分离低分子量物质分子：扩散速度快，迅速平衡，流 速仅受到介质机械强度、系统压力的限制 分离生物大分子物质分子：扩散速度慢，达到吸附和 解吸平衡需一定时间，加样和洗脱过程中流速限制d 常用洗脱策略组分不多，相差较大，用阶段洗脱 组分多，相差较大，用简单梯度洗脱组分复杂，线形洗脱 -凸形/凹形洗脱 初次分离，先连续梯度洗脱 （确定样品特性和洗脱条件 ） - 再阶段洗脱色谱 （层析）聚焦 Chromatofocusing ：据生物分子 pI 的不同，在 动相中动速不同进行分离（适于水溶性的两性分子）。 特点：.自动形成pH梯度，不需特殊实验装置；.蛋白质聚焦自身 pI 范围，有浓缩效应，峰宽达 0

19、.04-0.05pH 单位，分辨 率很高 。PB（ polybuffer ）-多组分缓冲液：分子量不同的多羧基多氨基化合物（两性电解质性缓冲剂），特点：不高，但缓冲力强； .缓冲能力是均匀的。PBE（polybuffer exchange） 多缓冲交换剂：以交联琼脂糖 Sepharose CL-6B 为基质， 并在糖上通过醚键偶合上配基而成如 低聚乙烯亚胺。要求：确保很宽的 pH 范围有均衡的缓冲容量。 色谱（层析）聚焦的应用：蛋白质类（包括酶）的分离；蛋白质 类（包括酶）等电点测定。亲和色谱（层析）AC :利用生物分子和其配体之间的特异性生物亲和力可逆结合的特性而建立的色谱分离方法。亲和层析

20、的必要条件：合适的配体（配基、 ligand） ；合适的载 体（ Matrix） ；合适的吸附和洗脱条件配体的选择：1.考虑亲和势（要求KI在10-410-8mol/L之间）；2.与L的偶联不破坏L与S的结合；3.需了解L-S的作用机 制作为配体的条件：亲和力大；具有解离平衡；与载体偶联不失活亲和层析载体的条件：1.亲水； 2.惰性； 3.具有活化基团； 4.大网孔； 5.机械性能好连接臂（Spacer arm）：在载体和配基间引入适当长度的手臂”减少载体的空间阻碍，增加配基的活动度。非专一性洗脱： 改变缓冲液的离子强度 ；改变缓冲液的 pH 值 ； 改变缓冲液的极性 ；使用洗涤剂 ；使用促溶

21、盐（ chaotropic salt）；使用蛋白质变性剂专一洗脱 （亲和洗脱 ）：（1）使用配体；（2）使用能与配体结合的 分子；（ 3）采用酶促反应的多元专一性洗脱 洗脱方式总结：.pH变化（破坏静电引力）；变化（减 弱静电引力、范德华力）；.亲和洗脱；.表面活性剂（减少 疏水作用、范德华力）；.解离试剂（主要破坏氢键，如尿素、 盐酸胍等）;（六）.降低温度t（较高t吸附、较低t洗脱、减少疏水 力）;.电泳解吸（在柱两端连上电极进行电泳）。共价色谱 ：利用形成和破坏共价键能力的差异分离。其共价键 常为二硫键一S-S，主要用于分离分子中含巯基的Pr、多肽。疏水色谱：将疏水的 L 连到 Gel

22、上。作用力 蛋白质的疏水区 与疏水性配基间形成疏水键。 可高盐上柱， 低盐洗脱或高温上， 低温洗。金属螯合色谱 ： His Cys Trp 能与某些金属离子形成复合物，若 将金属离子固定，可将含这些外露AA的Pr吸附。蛋白质分子表面的组氨酸咪唑基、半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环能与铜、 锌、镍离子间形成稳定的螯合物。洗脱方式：采用增加 I 或降 低 pH 或加入 EDTA 。 有机染料亲和色谱：有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具类 似于 NAD+ 的结构。一些需核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些 染料具一定亲和力。 亲和层析应用：抗体和抗原的纯化；酶的纯化；糖蛋白和脂蛋 白的纯化；细胞的纯化 反相层析

23、 RPC ：基于溶质分子与固定相中键合在基质上的疏水 性配基间的疏水相互作用疏溶剂理论假设 ：反相层析介质表面均匀密集覆盖着非极性配基；溶质分子 因受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合至固定相的 非极性配基上；除此之外，溶质与固定相间不存在其他任 何相互作用亲硅醇基效应 硅胶类介质中存在，一定条件下，硅胶表面残余的硅醇基 能与溶质发生相互作用而对溶质的保留行为起决定作用， 此效应常导致溶质保留值重复性较差、洗脱峰脱尾等不良 层析行为；若硅胶表面均匀覆盖非极性配基，对残余硅醇 基屏蔽，可基本排除此效应的影响；新型反相层析介质聚 苯乙烯等高分子聚合材料可根本消除亲硅醇基效应的影 响。有机溶剂又称

24、修饰剂（ modifier ）： 作用：降低流动相极性 要求：能与水互溶；较低的紫外截止波长；较低的黏度 离子对试剂( ion pairing agent )： 作用：通过离子作用与溶质分子结合引起溶质疏水性质改变而 调节溶质保留行为本身是酸或碱，同时起维持流动相 pH 作用 使用浓度范围 0.01%0.1% 或 10100 mmol/L 高浓度有机溶剂中有足够的溶解度对波长 220 nm 的紫外线没有明显吸收，带芳香环离子对 试剂须用荧光、视差折光等检测法 流动相选择须注意问题：反相层析大多在低 pH 下运行，加酸调节； 流动相中添加离子对试剂可改变溶质的保留值和选择性， 获得较好的分离效果

25、：带正电荷溶质应选带负电荷的离子对试剂：三氟乙酸 带负电荷溶质应选带正电荷的离子对试剂：季铵盐 洗脱应注意的问题：流动相中有机溶剂种类、 pH 值、离子对试剂种类等都 会对选择性和分辨率产生影响分离低分子量物质时，升高柱温是常用的改善分辨率的方 法：降低流动相黏度、增加传质速度、减少区带变宽 降低流速一定程度上可提高柱效，同时也增加溶质的纵向 扩散，过低流速反而造成分辨率下降、分离时间延长 。 影响泳动速度 V 的因素： 样品有效迁移率 m? m 是表征物质电泳行为的特征值? 与粒子大小、带电量 Q、环境pH、粘度有关 电压(电场强度)? 因V x E，为缩短时间，可提高E? 但高压电泳需解决

26、散热问题 缓冲液(介质液体)1、pH:主要影响介质带电荷情况(解离度)2、 I (离子强度)应适当0.010.3mol/L 支持物1 、吸附作用:造成样品滞留、脱尾2、电渗:凝胶流汗或变干3、分子筛效应聚丙烯酰胺 Gel 合成原料:丙烯酰胺 Acr ，双丙烯酰胺 Bis1 、化学聚合法? 催化剂:过硫酸铵( AP )? 加速剂: N,N,N,N- 四甲基乙二胺( TEMED ) 影响聚合的因素 O2 会淬灭自由基，需脱气； 加速剂叔胺处在自由碱基状态，需高 pH;温度T, T J, 慢；T T ,快 避免不纯物的影响 有机玻璃、铁氰化钾等会造成无法聚合Gel 要求? 合适的网孔? 一定的机械强

27、度? 良好的透明度? 一定的粘着度 浓缩效应:电泳时， Cl- 很快迁移，后面形成低电导区，使 Gly、 Pr 的离子加速，当稳定建立后，在快离子和慢离子之间形成一 个迅速移动的界面， Pr 就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩 成一个个狭小的中间层。Nature PAGE 是否能测定蛋白质分子量？ 天然 PAGE 测定蛋白分子量需排除电荷影响，需测量蛋白质分 子在不同浓度凝胶中相对迁移率b 先用不同浓度凝胶同时测量未知和已知分子量蛋白质 的相对迁移率；b 对不同蛋白质分子，以其相对迁移率的对数对凝胶浓 度作图，直线斜率为阻滞系数；b 用已知分子量蛋白阻滞系数对其分子量作图得直线， 据未知蛋白质

28、阻滞系数从此直线上可查得其分子量。 双向电泳: 采用两种不同原理的电泳程序 (第一向为等电聚焦， 第二相为 SDS 电泳)，可使分辨率提高几个数量级，并可同时 得到等电点和分子量等信息；是当前蛋白质组分析的关键开门 技术。 免疫电泳:基于抗原的电泳迁移及抗原与抗体的专一性免疫沉 淀反应； 抗原起始时带强负电， 在凝胶中电泳迁移后与抗体发 生免疫反应；最初抗原过量，产生可溶性免疫混合物而继续向 阳极迁移，直至抗原与抗体的浓度达到当量点，形成不溶性免 疫沉淀，沉淀点的高度或面积与抗原量成正比 蛋白质印迹: 把从电泳或层析分离的蛋白质转移到固定基质上， 并用专一性免疫技术探测固定膜上蛋白质的方法，能更有效分 析电泳结果。毛细管电泳(CE):以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通 道，依据样品各组分间迁移率和分配行为上的差异而实现分离 的新型的高效液相分离技术；可将有生物化学意义的复杂化合 物在不改变其性质的前提下进行分离；应用：蛋白质分离、糖 分