dn连接反应的影响因素提高平端连接效率的方法

1、dna1接反应的影响因素 艰高平端连接效率的方法&外源dna和质粒载体的连接反应&端。1人连接接反应1、 连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分： 20-100mmol/l的tris-hcl ,较多用50mmol/l, ph的范围在7.4-7.8 ,较多 用7.8, 目的是提供合适酸碱度的连接体系； 10mmol/l 的 mgcl2， 作用是激活酶反应；1-20mmol/l的dt1较多用10mmol/l,作用是维持还原性 环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的bsa作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/l的a

2、tfp现多用1mmol/l,是酶反应 所必需的。2、ph的影响：一般将缓冲液的ph调节到7.4-7.8 ,较多用7.8。 有实验表明，若把ph为7.5-8.0时的酶活力定为100%那么体系偏碱（ph为8.3）时仅为全部活力的65%当体系偏酸（ph为6.9）时 仅为全部活力的40%。3、atp浓度的影响：连接缓冲液中atp的浓度在0.5-4mmol/l之间， 较多用1mmol/l。研究发现，atp的最适浓度为0.5-1mmol/l ,过浓 会抑制反应。例如，5mmol/l的atp会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%抑制；还有报道，当atp的浓度为0.1mmol/l时，去 磷酸载体的自环比例

3、最大。由于atpb易分解，所以当连接反应失败 时，除了 dnaw酶的问题外，还应考虑 atp的因素。含有atp的缓冲 液应于 -20 保存， 溶化取用后立即放回。 连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起atp分解。与限制酶缓冲液不同的 是，含atp的连接缓冲液长 期放置后往往失效，所以也可自行配制 不含atp的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的atp母液。4、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的dnax链间有氢键的作 用， 所以温度过高会使氢键不稳定， 但连接酶的最适温度又恰为37。为了解决这一矛盾，在经 过综合考虑后，传统上将连接温度定为16， 时间为 4-16h 。 现

4、经实验发现， 对于一般的黏性末端来说，2030min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20c60min能使连接反应进行得更完全一些。对于平末端是不用考虑氢键 问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。5、酶浓度的影响：日常使用的 dnat度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100 倍。进行黏末端连接时需先行稀释， 稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似， 稀释液 中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。6、dna浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物， dna浓度不可 过高，一般不会超过20nmol/l。要求线性化的连接产物， dna

5、的浓 度可以高些， 至少是接近推荐的浓度。 在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，dn颂度还应降低，甚至是dna勺总浓 度低至几个nmol/l。另据研究，t4 dna1接酶对dn袜 端的表观km值为1.5nmol/l ,所以，连接时dnat度不应低于 1nmol/l 。即应具有2nmol/l 的末端浓度。提高平端连接效率的方法：1、 低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好， 平端连接需要过夜反应。2、 在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连， 应该可以大大提高平端连接的效率。 足够多的载体和插入片段是最重要的。要看片段具体情况而

6、言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环化的。插入的dn*段的摩尔数是载体摩尔数的5-10 倍，这个很关键。 载体通常 50ng就够了，若载体在10k 左右，可用 50 100ng。3、平端的连接对于离子浓度很敏感，回收的时候多洗洗，加pegffi扩大酶量，22度2小时后4c过夜。4、 尽可能缩小连接反应的体积，最好不超过10 微升，在 5 、 6 微升左右最佳。5、 建议放在四度冰箱连接两天效率更高比 14 度好。（一）外源dn a和质粒载体的连接反应外源dna片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链dna 5 磷酸和相邻的 3 羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都

7、带5磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒dn a已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的 两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入后可被修复。相邻的 5 磷酸和3 羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的dn a连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌d n a连接酶和t4噬菌体d na连接酶。实际上在有用途中，t 4噬菌体dna连接酶都是首选 的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端d n a片 段连接起来。dna一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件 下，其反应速度完全由互相匹配的d n a末端的浓度决定。不论末端位于同一dna分子（分子内连接）

8、还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种d n a ,也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体dna。在瓜作用的底物。如果反应中dna浓度低，则配对的两 个末端同一d n a分子的机会较大（因为d n a分子的一个末端找到 同一分子的另一末端 的概率要高于找到不同d n a分子的末端的概 率）。这倦，在dna浓度低时，质粒dna重新环化将卓有成效。 如果连接反应中d n a浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个d n a分子的末端碰到另一d n a分子末端的可能性也有 所增大。因此在d n a浓度高时，连接反的初产物将是质粒二

9、聚体和 更大一些的 寡聚体。dugaiczyk 等 （1975; 同时参见 bethesda res,lab.出版的focus第2卷，第2、3期合刊）从理论上探讨了dn a浓度 对连接产物性质的影响。 简而言之， 环化的连接产物与多联体连接产物的 比取决于两个参数：j和i。j是dna分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度， j 的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的dna呈随机卷曲。这样，j与dna分子的长度成反比（因为dna越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作 用），因此j对给定长度的dna分子来说是一个常数，与 dna 深度无关。j=3/（3兀lb0）3/2 其中l是d

10、na长度，以cm计，b 是随机卷曲的dna区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移， 而后者可影响dna的刚度。i 是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2nomx10-3末端/ml这里n o是阿佛伽德罗常数， m是dna 的摩尔浓度（单位：mol/l）。理论上，当j=i时，给定 d n a分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当 ji 时，有利于重新环化；当ij ,则有利于产生多联体。图1.9显示了dna区段的 大小与连接反应混合物中j

11、:i之比分别为0.5、1、2和5时所需dn a浓度之间关系（d ugaiczyk等，1985）。现在考虑如下的连接反 应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源dna片 段。 对于一个给定的连接混合物而言， 产生单体环状重组的效率不仅受反 应中末端的绝对浓度影响， 而且还受质粒和外源d n a末端的 相对浓度的影响。当i是j的2 3倍（即末端的绝对浓度足以满足 分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时） 外源有效重组体的产量可达到最大。 这些条什 下，连接反应终产物的大约40%都是由单体质粒与外源dna所形成的嵌合体。当连接混合物中线瘃质粒的量恒定（ j:i=3 ）而带匹

12、配末端的外源dna的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产 量。涉及带粘端的线状磷酸化质粒d n a的连接反应应包含：1）足量的载体dna,以满足j:i1和j:i3。对一个职pucil 般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体dna为20-60区g/ml 。2）未端浓度等于或稍高于载体dna的外源dna ,如外源dna浓度比载体低得多， 在效连接产物的数量会很低， 这样就很难别小部 分带重组抽粒的转化菌落。 这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒d na或发迹 策略以便通过定向的方法构建重组质粒。（ 二）粘端连接1）用适当的限制酶消化质粒和外源

13、dna。如有必要，可用凝胶电 泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒dna。通过酚：氯仿抽 提和乙沉淀来纯化dna,然后用 te（ph7.6）溶液使其浓度为 100/ml 。2）按如下所述设立连接反应混合物：a.将0.1屋 载体dna转移到无菌微量中，加等摩尔量的外源dnao b.加水至7.5屋，于45c加温5分钟以使重新退炎的粘端解链，将 混合物冷却到0 c。c.加入：10xt4噬菌体dna连接酶缓冲液1 t 4噬菌体nd a连接酶 0.1weiss单位5 mmol/l atp 1 ”于16c温育1 4小时10xt4噬菌体d n a连接酶缓冲液200mmol/l 同 tris.cl（ph7.

14、6）50mmol/k mgcl250mmol/l二硫苏糖醇500 g/ml牛血清白蛋白（组分v .sigma产品）（可用可不用）该缓训液应分装成小份，贮存于 20。另外，再设立两个对照反应，其中含有（1 ）只有质粒载体；（2 ） 只有外源dna片段。如果外源dna量不足，每个连接反应可用 50-100ng质粒dna,并尽可能多加外源dna,同时保持连接反 应体积不超过10。可用至少3种不同方法来测定t 4噬菌体dn a连接酶的活性。大多数制造厂商（除 new england biolabs 公司 外）现在都用 weiss等，1 1968）对该酶进行标化。1个 weiss单位 是指在37c下20

15、分钏内催化1 mmol32双焦磷酸根 置换到丫，（3 -32patp所需酶时，1个 weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐 受试验来定义的单位（ modrich 和 lehman,1970） 或者 60个粘端单位（如new england biolabs 公司所定义）。因此，0.015weiss 单位 的t 4噬菌体dn a连接酶在16c下30分钟内可使50%的入噬菌体 hindin片段 （5g）得以连接。在本书中，丁4噬菌体。1人连接 酶一律用weiss单位表示。par目前提供的t 4噬菌体d n a连接酶 均为浓溶液（1-5 单位 / “），可用 20mmol/l tris.cl（ph

16、7.6）、 60mmol/l kcl、5mmol/l二硫苏糖醇、500区g/ml牛血清白蛋白、50% 甘稀释成 100 单位 /ml 的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的t 4噬体 dna连接酶于-20 c保存3个月可保持稳定。3 ）每个样品各取1 2区l转化大肠杆菌。（三）平端dna连接t 4噬菌体dna连接酶不同于大肠杆菌dna连接酶，它可以催化平端dna片段的连接（sgaramella和 khorana,1972;sgaramella 和 ehrlich,1978 ）,由于dna很容易成 为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的 物性，才 能使任何dna分子彼此相连。然而

17、，相对而言，平端连接是低效反 应，它要求以下4个条件：1 ）低浓度（0.5mmol/l）的 atp（ferretti 和 sgaranekka,1981 ）。 2 ）不存在亚精胺一类的多胺。3）极高浓度的连接酶（50weiss单位.ml）。4）高浓度的平端。1 .凝聚剂在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致d npheiffer 和zimmerman,1983;zimmermarf口 pheiffer,1983;zimmermant harrison,1985) 或氯化六氨全高钻(rusche和howard-flanders,1985 )，可以使如何取得适当浓度的平端dna的总是

18、迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：1)它们可使平端d n a的连接速率加大1 3个数量级，因此可使连接反应在酶dna浓度不高的条件下进行。2)它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化(j:i=10 )的dna浓度下，所有的dn a产物也将是线状多聚体。par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。(1 )聚乙二醇(peg80001 )用去离子水配制的p e g 8000贮存液(40%)分装成小份，冰冻保存， 但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。 在含 15peg8000 的连接反应混合物中

19、，对连接反刺激效应最为显著。除peg800和t 4噬菌体dna连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于0c混合，然后加适当体积的peg 8000(处于室温)，混匀，加酶后于20进行温育。2 )连接混合物中含 0.5mmol/l at可口 5mmol/l mgcl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至atp浓度略有增加或m gcl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度( pheiffer 和 zimmerman,1983)。3)浓度为15%的peg 8000可刺激带粘端的dna分子的连接效率提高至原来的 10-100 倍，反应的主产物是串联的多联体。4) peg 8000可刺激短至8个核甘酸的合

20、成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。(2 )氯化六氨合高钻1 )氯化六氨合高钻可用水配成10mmol/l贮存液贮存于-20 c,它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。 当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5mol/l时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钻可使平端连接的效率大约提高到原来的50幡瓦但只能使端连接的效率提高到原来的 5 倍 (rusche和 howard-flanders,1985 )。2)在单价阳离子(30mmol/l kcl)存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用， 但此时连接产物的分布有所改变。 连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状dn a将点尽优势。3)与peg 8000不同，氯化六氨合高钻不能显著提高合成寡核昔酸的连接速率。一、转化由于外源dna勺进入而使细胞遗传性改变称为转化，早在 1943年， avery等就发现有毒肺炎双球菌的dnaw无毒肺炎双球菌共培养后产 生有毒性的肺炎 双球菌后代的转化现象。但 dnas入细胞的效率很 低， 在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞， 经处 理后的细