人发角蛋白人工腱

1、人发角蛋白人工腱研究进展5人发角蛋白人工腱研究进展肖应庆董为人人发角蛋白(Human Hair Keratin, HHK)人工腱，是一种植入人体内可被降解 吸收、并能诱导自体腱形成的新型生物性支架材料；按其诱导自体腱形成的机 理，也可以称之为 在体HHK组织工程腱(in vivo HHK-engineering tendon)”。 大量的实验研究和临床实践证明，它是目前创伤、矫形和修复重建外科中，腱或 韧带缺损修复和功能重建比较理想的代用品。一、HHK人工腱研究的历史背景由于创伤或疾病所造成的肌腱缺损、短缩、变形、或手部肌腱先天性缺如等导致 的肢体功能障碍，需进行手术修复。传统的修复方法是自体

2、肌腱移植或肌腱转位 术，其最大的优点是无免疫排斥反应，衔接部位能组织愈合，结合牢固，恢复正 常的解剖和组织结构，保持了肢体功能活动所需的生物力学性能。所以，从20世纪初开始，一直延续至今，临床上仍在使用。其不足之处是要牺牲一条或多条 正常肌腱，遇到多条肌腱缺损或缺如的病例，取材就非常困难。再者，从自体切 取肌腱，不仅增加手术创伤，也会影响供肢的功能。而且这种拆东墙补西墙”的方法，也不易为患者所接受。因此，应用肌腱代用品，是解决上述问题的一个途 径。近百年来，国内外先后有人采用丝织品、合金、火棉、钽丝织品、塑料、尼龙、 涤纶、合成纤维、碳素纤维、硅橡胶、动脉管、聚脂纤维、羟基磷灰石和未经改 构处

3、理的人发等用于制作人工腱。其中有些材料组织相容性差，异物反应大而被 排斥；有些材料植入后因萎缩而失败；有些材料随植入时间的延长发生裂解或降 解，拉应力逐渐衰减，不能达到恢复功能的目的；有些材料与受体部位周围组织 发生广泛粘连，严重影响肢体的功能活动；大多数人工腱与受体腱吻合口不能形 成纤维愈合，最终在结合部位发生断裂，因而只能作为暂时的代用品，未能取得 远期成功。总之，未找到临床上有永久使用价值的比较理想的人工腱材料。为研制出一种临床持久性较好的人工腱，戴尅戎等用硫化硅橡胶管作外壳，管芯 充填桑蚕丝织品和两根供缝合用的涤纶线。虽然人工腱的硅橡胶外壳与周围组织 不发生粘连，两端与受体肌腱吻接部有

4、大量纤维组织与丝纤维相互交织，和腱芯 中的丝纤维间能逐渐形成贯通两端的纤维组织，以承担拉力，但仍然存在异物反 应大等缺点。在手部无人区作人工腱移植的 11例患者中，即有5例因排异而失 败。显然，这样的结果，临床很难推广应用。为寻找出一种异物反应小、临床持久性较好的人工腱材料，黄凤鸣等用人发编织 成肌腱，植入兔大腿半腱肌肌腱离断部位。术后局部不出现红肿及炎性渗出物， 结合部纤维母细胞可以长入人发腱内部，并包绕每根人发而牢固愈合，但活动度差，与肌腱下筋膜发生粘连，并且随时间延长粘连逐渐加重。临床应用11例，全身及局部反应均不明显。用于大腿和臀部肌腱修复粘连轻微，但用于手部指肌 腱修复时效果较差。此

5、后，也很少见有临床应用的报道。20世纪90年代前，人工腱的研制实际仍处于实验阶段。为了解决临床的需求， 人们的视线又先后回到了异体腱上。本来早在 20世纪50年代，Peacock等研究 了同种异体腱，由于当时应用的是未经处理的新鲜异体腱，结果发现有明显的炎 性反应和排斥反应，移植腱出现坏死现象。因此，临床难以应用。20世纪80年代，Min ami通过动物实验，提出了肌腱的抗原性主要存在于腱细胞表面的组织相 容性复合物(HLA-Dr)，而不在胶原纤维，并且通过冷冻，可以显著降低其抗 原性。43212基金资助(1)人发角蛋白人工腱诱导机体自体腱形成机理的研究 ”国家自然科 学基金重点项目(M :3

6、9830390)(2) 人发角蛋白的医学应用”国家“863”究项目(M:102090503);(3) 人发角蛋白人工腱”“97国家重点基础研究发展规划项目组织工程基本 科学问题中的子专题(M:G1999054308) (4)人发角蛋白人工腱”广州市科技攻关项目(M:200020170105。作者单位第一军医大学1.生物化学教研室2.组织学与胚胎学教研室，广州，5105156人发角蛋白人工腱研究进展张友乐等5,6对异体腱采用超低温冷冻和冷冻干燥处理，在一定程度上改变肌腱细胞的结构， 抑制和破坏肌腱细胞HLA-Dr的抗原性，但仍然保留了肌腱组织的基本结构及部 分活性，为肌腱移植后修复提供了良好基础

7、，与自体肌腱移植的结果无明显差 异。这样，对异体腱在临床上的应用，无疑是向前推进了一大步，以至于至今临 床应用仍比较普遍。目前，国内外用于临床的异体肌腱基本上均为冷冻和冻干肌腱，但尚存在以下问 题：(1)材料来源困难；(2)严格的无菌操作和供体筛选(包括微生物学、血 清学检测及病理组织检查)，操作复杂，而且仍不能完全排除疾病(特别是 HIV 和HBV等感染）传播的可能性；（3）存在粘连比较严重和潜在的排斥反应；（4）愈合时间长7；（5）拉应力衰减明显8；（6）冷冻处理、建立提供商品化肌腱的组织库需要一定的设备。20世纪80年代，提出了组织工程这一崭新的概念。人们开始转向通过组织工程 途径来解决

8、人体肌腱或韧带的替代材料。项舟等9用人胚腱细胞与碳纤维增强聚羟基乙酸（PGA）外加胶原表面涂层联合培养，腱 细胞贴附于材料上，且增殖，合成胶原，形成网状纤维缠绕。将其移植于动物体 内，桥接肌腱残端。术后4周，观察到植入物间胶原纤维组织趋于致密组织结 构，有大部分胶原纤维已连接肌腱残端。结果表明，碳纤维增强PGA加胶原表面涂层材料作为支架，与腱细胞联合体外培养，可以成为一种永久性的有生命活 性的组织工程肌腱。但组织工程肌腱大批量用于临床尚有许多问题待解决，如种 子细胞的组织相容性、老化和功能退化；支架材料的生物相容性、生物亲和力、 降解速率与细胞生长的同步性；种子细胞来源的选择，构造模拟人体的三

9、维张力 环境等。在上述领域均取得突破性进展以后，还需研究这种材料从实验室过渡到 人体的中间环节，包括这种材料的保存方法、保存后的活力、植入前的复苏，及 其对材料的影响、运输方式、体内植入后的反应等，即产业化研究。为此，人们仍在致力于寻找和研制肌腱永久性替代物 一一理想的人工腱：（1） 组织相容性好，不发生排斥反应；（2）可被机体吸收，同时诱导形成新的自体 腱；（3）腱的衔接部位能组织愈合，拉应力无衰减；（4）可屈性、绕弯性好；（5）无粘连，有良好的滑动性；（6）容易消毒、贮 存。在这种历史背景下，诞生了一种完全新型的人工腱 一一HHK人工腱。 二、HHK人工腱的实验研究HHK人工腱的研究始于1

10、991年，当时主要有第一军医大学生物化学教研室王铁 丹、肖应庆和第一军医大学南方医院骨科曹启迪3人具体参与。在此之前，黄凤鸣等2以未经改构处理的人发代腱，其拉应力不易衰减，组织相容性也较好，但不能被 机体吸收，与周围组织发生粘连，一经感染便成为异物。针对这样的结果，王铁 丹、肖应庆和曹启迪认为解决这一问题的关键是要预先对人发进行改构处理，使 其植入后能被机体降解吸收并诱导形成新的自体腱。根据他们各自的专业特长， 由王铁丹、肖应庆具体负责对人发进行改构的生物化学处理，并对改构处理后人 发的理化性质、生物学性能及生物力学特性进行测定分析；曹启迪具体负责用经 生物化学改构处理过的人发进行动物实验和临

11、床观察。1. 对人发进行改构的生物化学处理 人发中主要成份为a角蛋白，a角蛋白富含半胱氨酸，并且半胱氨酸上的巯基（- SH）与邻近多肽链中半胱氨酸上的巯基（-SH）交联，形成含二硫键（-S - S-） 的胱氨酸，使人发结构处于一种非常稳定的状态。因此，人发能经受得起一定的 拉力，在自然条件下基本不降解。王铁丹和肖应庆10就人发中角蛋白的特殊化学结构，对人发进行序贯的、不同程度的可控制性生物 化学处理（非早期文献中报道的 戊二醛合剂”处理），不同程度地改变HHK的结 构，使其成为在机体内具有慢（Z）、中（B）、快（F）不同吸收速度的三种 HHK组分材料。Z组分处理较缓和，人发结构改变较轻微； B

12、组分处理较剧烈， 人发结构改变较大；F组分处理剧烈，人发结构改变最大。HHK在机体内的吸收 速度与生物化学处理的剧烈程度和人发结构改变的大小成正相关。将Z、 B和F三种组分材料以一定的比例，混合编结成横截面为椭圆形的HHK人工腱。2. HHK人工腱材料的化学成份分析作为植入体内的可吸收生物材料应用于临床，其前提是生物材料的降解产物必须 无毒，终产物能循入机体正常的代谢途径。为此，肖应庆等11 将HHK人发角蛋白人工腱研究进展7人工腱Z、B、F三种组分材料和未经生物化学处理的正常人发彻底水解，对其化 学成份进行分析。结果均是只有1%左右的无机成份，其余全部是氨基酸。其中 胱氨酸含量，未经生物化学

13、处理的正常人发约占 11%，而HHK人工腱Z、B、F 三种组分材料均只有5%左右（由于胱氨酸是采用自然氧化法测定的，此含量中 还有相当一部分是由半胱氨酸氧化而来的，实际胱氨酸的含量还远低于这个 量）。结果表明：（1）Z、B、F三种组分和正常人发基本上均由蛋白质组成。显然， HHK人工腱在体内的降解产物对机体不但无害，而且有益，为HHK人工腱植入人体提供了可行性依据；（2）人发经生物化学处理后，胱氨酸大量丢失。意即 HHK多肽链中大量的二硫键断裂，破坏了人发稳定的化学结构。可能这就是 HHK人工腱在体内能被降解吸收的主要原因。3. HHK人工腱材料的化学性质和生物学性能 HHK人工腱应用于临床，

14、还要使 其化学性质基本不影响机体正常的生理内环境，其生物学性能对机体无论是近期 还是远期都应无不良影响，没有潜在危险。研究者们10从人发原料的采集、清洗到生物化学处理所用试剂及其整个制作过程的设计，都 作了充分、周密的考虑。人发采自无地方流行性疾病、无环境污染的偏远山区、 无染发和烫发的健康年轻女性黑发；清洗不用一般的洗发水（精），而是与生物 化学处理程序有机地结合在一起；所用处理试剂为药典医用，对人体无害。取生 物化学处理后的HHK人工腱材料制备浸提液，对其化学性质和生物学性能进行 检验分析。检验结果12:pH7.0 7.5,金属离子 v 1mg/L,无细菌生长，无热原反应，无毒性反应，溶血

15、率为2.6%，细胞毒性WI级，皮肤致敏率0 %，鼠伤寒沙门氏菌回复突变（Ames）试验阴性，动物骨髓嗜多染细胞 微核试验阴性，小鼠精子畸形检测试验阴性。表明HHK人工腱的化学性质和生物学性能完全符合植入人体的要求。4. HHK人工腱材料的生物相容性和组织相容性 为进一步研究和应用HHK人工腱 材料提供生物学依据，而生物材料中一些易溶出物质又往往是引起炎症反应和组 织反应的主要因素。因此，肖应庆等13、陆声14和傅文玉等15先后分别用HHK人工腱材料的浸提液与L929细胞系、人胚腱细胞（HETC）和人骨髓间充质干细胞（MSCs）共 培养。结果表明：浸提液不但对细胞的生长、增殖、形态、代谢、细胞膜

16、的完整 性、蛋白质含量、I型胶原的表达及超微结构等均无影响，而且浸提液组还优于 单纯生理盐水组。提示HHK人工腱浸提液对细胞不但没有毒性，而且像似具有 一定的营养作用。这可能与细胞摄取 HHK人工腱材料在浸提过程中释放的氨基 酸等营养成份有关。为提供更充分的HHK人工腱材料生物相容性依据，在此基础上还通过直接接触法检测了其生物相容性。陆声14和傅文玉等15先后分别用HHK人工腱材料与HETC和MSCs联合培养，均发现细胞与材料有极好的粘附性和相容 性。是一种比较理想的可吸收生物性支架材料，可作为细胞外基质应用于组织工 程研究。体外细胞培养法检测材料的生物相容性虽具有敏感性高、重复性好、可定量和

17、直 接观察对组织细胞影响等优点，但它是一种短期的离体实验。HHK人工腱材料有无抗原性，植入人体后有无排斥反应，还有必要作进一步的观察。李其训等16用HHK人工腱植入兔体内，于术后不同时间进行淋巴细胞转化试验。结果表明，HHK人工腱基本无抗原性，不能刺激淋巴细胞转化。为了解HHK人工腱材料对机体的直接作用，邹云雯等17将HHK人工腱材料埋植于大鼠皮下。一般观察，伤口愈合良好，未见排斥反应。分别于术后2、8和12周取埋植材料和周围组织进行组织学观察。结果表明：HHK人工腱材料对机体组织的刺激性明显低于正常人发，与动物的组织相容性较好。其后在临床试用期间，以行HHK人工腱移植术的14例患者为实验组，

18、同时选25例行其它骨科手术的住院患者作对 照组，采外周血进行免疫学指标检测。结果实验组与对照组之间，以及实验组自 身术前与术后比较，均无显著性差异。表明 HHK人工腱植入人体不能刺激机体 产生免疫反应。需长期植入体内的生物材料，尤其作为一种可降解的生物材料，需证实其降解产 物对周围组织有无影响。王贵波等18,19、陆声等20,21先后分别将HHK人工腱材料埋植于兔脊旁肌内，进行了系统的观察。结果表明，HHK人工腱材料与周围组织有良好8人发角蛋白人工腱研究进展的相容性。认为HHK人工腱材料是一种理想的可降解医用生物材料。5. HHK人工腱的生物力学性能HHK人工腱作为人体肌腱或韧带的代用品，除了

19、要有良好的生物相容性和组织相 容性外，还需具有一定的抗拉强度。肖应庆等22测定了 HHK人工腱及其各组分材料的主要生物力学性能指标，发现Z、B和F组分在横截面积等同的条件下，断裂拉力、拉应力和刚度均依次递减，而HHK人工腱的断裂拉力和刚度均随横截面积增大而增加，相关系数分别为0.9982和0.9896。提示HHK人工腱的断裂拉力、拉应力和刚度均随生物化学处理程度的加 重和在体内被吸收速度的加快而减小。据此，可以通过控制对人发的处理程度和 HHK人工腱各组分材料组合的比例，来满足人体不同部位肌腱对HHK人工腱拉应力的需要，同时也便于根据不同功能部位选用合适规格型号的HHK人工腱。生物降解材料作为

20、诱导支架，其最低力学性质需维持到缺损组织再生为止。为了 解HHK人工腱从植入机体到形成新的自体腱整个过程中的生物力学性能，王前 等23对其进行了测评。将HHK人工腱、碳纤维腱和自体腱分别植入兔跟腱缺损处， 第12周后，HHK人工腱组最大拉应力均值（12.70MPa）为碳纤维腱组（5.88MPa）的2.16倍，为自体腱移植组（13.44MPa）的94.5%，达到了肌腱修 复术中对结构和功能重建的要求。实验结果表明，HHK人工腱修复肌腱缺损的腱化进程与自体腱相同。腱化过程不仅是一种形态结构的改建，而且是力学性能的 恢复。由于HHK人工腱是由慢（Z）、中（B）、快（F）不同吸收速度的三种 组分材料，

21、以一定的比例混合编结而成，这就保证了使其具有足以供植入人工腱 的肢体、指（趾），从植入人工腱到形成新的自体腱过程中，进行功能活动所需 拉应力的连续性。6. HHK人工腱植入的动物实验人发经生物化学改构处理，编织成 HHK人工腱后，在对其进行理化性质、生物 学性能等分析的同时开始了动物实验。曹启迪等24应用HHK人工腱植入新西兰兔跟腱缺损部位。第6周，植入物被大量胶原纤维包绕分成小块，未吸 收的HHK人工腱材料内已长入胶原纤维，并有巨噬细胞。第 8周，植入 物外观与正常机体腱不易区别，衔接部已不清楚，大部分植入物被吸收并胶原 化。第12周，植入物完全被胶原纤维替代，大部分已腱化为机体腱组织。表明

22、 HHK人工腱植入兔跟腱缺损部位，12周已被吸收并诱导基本形成了新的自体 腱。其后，李其训等16重复了同样的实验。第6周，植入的HHK人工腱被胶原纤维包绕并分割成小块，人发周围可见巨噬细胞和胶 原纤维。第8周，人工腱与跟腱衔接部已不清楚，出现大量的胶原纤维，大部分 植入物被吸收并胶原纤维化。第12周，植入的HHK人工腱基本消失，被成纤维 细胞和胶原纤维取代，排列规则，大量成纤维细胞逐渐转化为纤维细胞，形成了 新的自体腱。在不同的时间段（1996年，1997年），不同的地域（广州，昆明），采用同样 的材料（HHK人工腱）、同样的动物（新西兰兔），进行同样的实验（替代跟腱 缺损3cm），得出了同样

23、的结果：HHK人工腱植入兔跟腱缺损处，逐渐被降解吸 收，同时诱导形成新的自体腱。这一过程，大约需要12周。这样，可以基本证实其结果的真实性和可靠性。随后，朴英杰等25,26、娄莉27和王贵波等18,19先后分别用HHK人工腱替代兔跟腱修复缺损，蒋东 萍等28用HHK人工腱替代兔腓肠肌肌腱修复缺损，胡庆柳等29用HHK人工腱替代兔后腿屈肌腱修复缺损，也都得出了类似的结果。进一步证实了应用 HHK人工腱替代机体肌腱修复 缺损的过程中，在被机体降解吸收的同时，诱导形成新的自体腱这样一个事实的 真实性和可靠性。7. HHK人工腱机理的研究HHK人工腱植入肌腱缺损部位后，可逐渐被机体降解吸收，并诱导自体

24、腱形成。 这是人工腱研究史上的一大突破，引起了国家和地方政府的高度重视，先后注重 资予以大力支持；同时也引起了同行们的浓厚兴趣。于是便开始了探求其机理的 深入研究。(1)体内降解吸收机理如前所述，HHK人工腱的化学本质基本上全是蛋白质，HHK人工腱在体内的降解亦即蛋白质降解。真核细胞的蛋白质降解途径包括泛素依赖途径、溶酶体依赖 途径和Ca2+ 依赖途径等30。朴英杰 等26对HHK人工腱在体内降解过程的观察发现， 人发角蛋白人工腱研究进展9HHK人工腱植入机体后第1周，人发毛皮质外层可见透明的毛小皮层，胞质内充 满胶质蛋白，偶尔可见细胞之间的桥粒结构。毛皮质内见有散在棕色颗粒，与正 常毛发无明

25、显区别。毛小皮层表面散在附着巨噬细胞。第3周，可见人发毛小皮塌陷，毛皮质开始均质并颗粒化。人发周围巨噬细胞三五成群聚集，相互融合成 多核巨细胞，胞内可见被吞噬的人发降解颗粒。第 6周，F组分已完全降解吸 收，这时B组分人发的毛小皮开始脱落，并部分降解吸收。第912周，除剩余少量Z组分外，大部分HHK人工腱材料已降解吸收。因此，同一视野内可同时 观察到不同降解阶段的HHK人工腱材料。泛肽酶标记反应：第 1、3周，在 HHK人工腱材料周围的巨噬细胞、多核巨细胞和成腱细胞内呈强阳性，周围的基 质呈中等阳性；第6周，巨噬细胞和多核巨细胞内仍呈强阳性，周围的基质呈弱 阳性；第912周，大部分HHK人工腱

26、材料降解，被新生的腱组织取代，在基质 中呈弱阳性，而在新生腱细胞中呈中等阳性。形态学观察20,21,27,28表明，HHK人工腱植入后首先是中性粒细胞出现在人发周围，2周之内中性粒细胞消失。这可能与手术造成的创伤或局部感染有关，中性粒细胞并不参与HHK人工腱的降解。与此同时，由于 HHK人工腱的植入导致周围的巨噬细胞和多核 巨细胞处于应激状态。因此，第 36周，人发周围出现大量的巨噬细胞和多核巨 细胞。巨噬细胞和多核巨细胞在静止状态时，胞内溶酶体数量相对较少，一旦与 异物接触，溶酶体数量剧增。在各组分降解的早期，由于HHK人工腱材料体积实在太大，巨噬细胞和多核巨细胞并不参与吞噬。在上面实验26

27、中观察到，第39周均出现了泛肽酶标记反应呈强阳性，并伴随有F、B、和Z组分依次在第39周出现断裂、脱落，进而逐渐呈均质状。显然，细胞的泛素依赖降解途径被激 活，由26S的蛋白体酶在细胞外对 HHK材料进行降解。当HHK材料降解成大小 不等的颗粒后，多核巨细胞将较大的颗粒以胞吞的方式吞噬，而较小的颗粒则由 巨噬细胞吞噬。然后在细胞内形成异噬性内吞体，内吞体与溶酶体融合，在酶的 作用下将其水解。根据形态学的观察结果推断，在 HHK人工腱降解过程中，F组分在第36周到达 降解后期，B组分在第69周达到降解后期，而Z组分则是在第912周达到降 解后期。由此可见，F组分的降解后期可能与B组分的降解中期重

28、叠，B组分的 降解后期可能与Z组分的降解中期重叠。因此，在 HHK人工腱体内降解的整个 过程中，都可观察到人工腱材料被不同程度地降解与自体腱逐渐形成并存的现象16,20,21,25-27,31。综上所述，HHK人工腱在体内的降解方式可以归纳为：在各组分降解早期，主要 是泛素依赖降解途径在细胞外发挥作用；在各组分降解后期，主要是溶酶体依赖 降解途径在细胞内发挥作用。两者间有精确的协同作用。（2）诱导自体腱形成机理 在HHK人工腱的实验研究中16,18,19,23-31，已经观察到HHK人工腱植入机体肌腱缺损部位后，在其降解吸收过程中逐步形成新的自 体腱。为探索其形成机理，朴英杰等25用HHK人工

29、腱植入兔跟腱缺损处，通过电镜较系统地观察了 HHK人工腱形成自体腱的有关细胞及其超微结构的改 变：植入后14周，巨噬细胞和成纤维细胞向植入物内迁移，HHK人工腱出现降解，同时大量成体腱干细胞在肌腱两端开始脱分化，分裂增殖成腱形成细胞（简 称成腱细胞），并迁入降解区；植入后 57周，大部分HHK人工腱被降解吸 收，成腱细胞进一步分化，胞体变大变长，含有丰富的高尔基复合体和粗面内质 网，向细胞外分泌胶原蛋白，并在细胞外聚合，形成大量排列不规则的新生胶原 纤维。植入后第35个月，在成腱细胞进一步形成胶原纤维的同时，分泌胶原 酶，并降解排列不规则的胶原纤维，逐步转变为排列规则的胶原纤维；植入后第 67

30、个月，成腱细胞进一步分化，胞体伸出多个薄板样的翼状突起插入纤维束之 间。之后胞体进一步变长，突起进一步变薄，功能逐渐停滞，演变成腱细胞。在 这一过程中，粗细不等的胶原纤维逐渐变粗，排列规则，不断成熟，形成具有正 常腱功能的自体腱。朴英杰等26在其后的实验中，重复观察到了类似的现象：HHK人工腱植入后第3周，毛发之间出现新生的成腱细胞，有时可见到细胞分裂相。第 6周，成腱细胞开始分泌 10人发角蛋白人工腱研究进展基质并形成纤维。第912周，大部分HHK人工腱降解吸收，被新生的腱组织取 代。前后两次实验的结果证实了一个事实：HHK人工腱植入机体肌腱缺损处后，在其降解吸收的同时，肌腱残端的成体腱干细

31、胞活化、分裂、增殖，并迁移至腱 缺损处，粘附于HHK人工腱材料表面，合成并分泌胶原，在胞外组装成胶原纤 维，进而形成机体自体腱。在此基础上，娄莉27对自体腱形成的机理作了进一步的研究观察。将HHK人工腱植入兔跟腱缺损处，分别于 1、3、& 9、 12、16、20周取材进行组织学和超微结构观察。在整个过程中观察到：植入后 3 周，便发现成腱细胞附着在 HHK人工腱材料表面并包绕每根人发，增殖成膜， 成为自体腱形成的原基。继而成腱细胞活化，形成腱细胞，并不断分裂、增殖， 生成大量功能活跃的腱细胞。这些腱细胞合成前胶原蛋白并分泌到细胞外，在胞 外聚合形成胶原蛋白，继而聚合成胶原原纤维，若干胶原原纤维

32、经糖蛋白聚合成 胶原纤维。后期胶原纤维在胶原酶和拉应力的作用下，使胶原纤维排列规则、致 密，方向与人工腱长轴一致。采用 RT-PCR技术，HHK人工腱植入第3周即可观 察到I型胶原蛋白的mRNA表达，第6周达到高峰，第20周表达量仍高于正常 肌腱。这一结果与蒋东萍31测定HHK人工腱植入兔跟腱缺损处后，新生腱组织中羟脯氨酸含量的结果非常 吻合。植入后3周，羟脯氨酸含量开始增高，第 6周达到高峰，第9周开始回 落，但仍高于正常肌腱。羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸，新生腱组织中羟脯 氨酸的含量能较准确地反映胶原蛋白的合成量。上述这些结果，在分子水平进一 步证实：HHK人工腱植入机体肌腱缺损处后，形

33、成自体腱的过程是腱细胞合成和 分泌I型胶原，最后聚合、组装成胶原纤维的过程。另外，正常腱组织中，胶原纤维占将近 90%，细胞成份约占10%，但在新形成 的腱组织中，腱细胞数量远远超过了这个比率。最新的研究发现32在自体腱形成晚期，腱细胞自身胶原化，无论是胞浆还是胞核，均被胶原纤维所 替代。这可能是一种新的细胞凋亡类型，类似皮肤表皮细胞角质层细胞的角化过 程。这也是新形成的自体腱改建、塑形的一个过程和完善为正常肌腱的结果。 上述实验研究阐明了 HHK人工腱形成自体腱的过程，但 HHK人工腱是如何诱导 该过程的尚不清楚。HHK人工腱完全水解后的产物是含量不等的各种氨基酸，但 在植入机体后，要经历一

34、个逐步降解、吸收的复杂过程。其中间产物有的是蛋白 质，有的是含各种氨基酸残基数目不等的肽类物质。可以推测，在这些中间产物 中，可能含有一些有助于细胞粘附的功能信息和诱导机体细胞分泌一些细胞因子 的物质。细胞因子对促进细胞分裂、增殖，合成、分泌胶原以及调控胶原的沉积 和降解、血管再生等都起到举足轻重的作用。娄莉等27通过RT-PCR技术证实：（1）腱细胞和巨噬细胞能合成、分泌细胞转化生长因子 （TGF）- B1碱 性成纤维细胞生长因子（bFGF）和金属基质蛋白酶（MMP）-1与金属基质蛋白酶组 织抑制物（TIMP）-1 ;（ 2）在自体腱形成过程中，TGF- B1和bFGF的mRNA表达量增高，

35、且远高于正常肌腱；（3） TGF- B1和bFGF可诱导腱细胞增殖、分化， 促进I型和川型胶原的合成和分泌，并可调节胶原的沉积，调控血管增殖；（4） MMP-1与TIMP-1相互拮抗，调节胶原的降解，对新生自体腱进行改建和 塑形，最终形成与自体腱结构和功能相同的新自体腱。蒋东萍33将HHK人工腱植入兔跟腱缺损处，也观察到：2周后鞘壁网状的幼稚结缔组织细胞质中 bFGF mRNA呈强阳性反 应，36周后成纤维细胞中TGF- B 2 mRNA呈强阳性反应，9周后和正常肌腱细胞 中bFGF mRNA、TGF- B 2 mRNA均呈弱阳性反应或阴性反应，表明此时细胞已转 向静止期。显然，这一结果与新生

36、腱组织中 I型胶原蛋白的表达和羟脯氨酸的含 量互为因果关系。胡庆柳等29用原位杂交法检测TGF-B,发现TGF- B 1 mRNA仅存在于HHK人工腱周围的腱细胞、 渗入的成纤维细胞和炎症细胞中，TGF- B 2 mRNAT泛存在于新生腱组织中，在半 成熟的腱组织中也有表达，而 TGF-B 3 mRNA在新生腱组织和较成熟的腱组织中 表达量很低。由此看来，TGF- B1 B2在肌腱修复中可能起主要作用，而 TGF-B3 可能只是起协同作用。HHK人工腱诱导机体形成自体腱的机理，可以概括为：HHK及其降解产物活化巨噬细胞、成纤维细胞和成体腱干细胞等分泌细胞因子，促进成体腱干细胞分化 为腱细胞，腱

37、细胞分裂、增殖、合成并分 人发角蛋白人工腱研究进展11泌胶原，在胞外组装成胶原纤维，进而形成机体自体腱。其中多余”的腱细胞，也可能是在细胞因子的调控下，自身胶原化，使新形成的自体腱逐渐改建、塑形 成正常肌腱。三、HHK人工腱的临床应用研究经动物实验，证实HHK人工腱：组织相容性好，无明显抗原性，不发生排斥反 应；可被机体降解吸收，并在降解吸收过程中形成新的自体腱；拉应力无明显衰 减；无影响功能活动的粘连。在此基础上，开始了临床应用研究。1.临床验证第一军医大学南方医院曹启迪等34，应用HHK人工腱治疗临床患者51例，男39例，女12例，年龄1046岁。其 中代跟腱10例，膝反张固定7例，膝关节

38、侧副韧带修复重建术11例，膝交叉韧 带替代术8例，伸指肌腱缺损替代术8例，屈指肌腱替代术7例。51例中，上肢 伸屈指腱替代术15例，术后3周可恢复功能活动；下肢跟腱断裂、膝反张、膝 侧副韧带和膝交叉韧带断裂，行修补、腱固定、及重建术共36例。下肢术后3周，病人行非持重活动。1个半月，恢复持重劳动。随访时间3个月至4年，功 能恢复达优者49例，良者2例，优良率100%。成都军区昆明总医院李其训等35，1995 年 6月至2001年8月，临床应用HHK人工腱治疗患者223例（238条腱）。其中男 性201例，215条腱；女性22例，23条腱。损伤原因，车祸伤126例，机器伤 65例，火器伤24例，

39、其他伤8例；损伤部位，屈指肌腱80例，84条腱；重建抬 肩屈肘54例，62条腱；膝交叉韧带35例，35条腱；膝侧副韧带28例，31条 腱；跟腱26例，26条腱。根据损伤的部位与性质，选用相应规格型号的 HHK人 工腱移植和功能重建术。术后肢体只需制动 13周，待切口完全愈合即可行关节 功能活动。病人无发热等不良反应，切口无红肿情况。除有5例屈指肌腱替代术后68天切口出现肿泡，切开引出淡黄色渗出液（培养无细菌生长），经清创再缝 合，伤口愈合外，其余所有病人切口均 1期愈合。病人术后3周，肢体关节开始 主动活动，逐渐恢复功能，腱张力均较强，无明显沾连。其中210例详细随访，随访时间6个月至5年零8

40、个月。根据Jenkins评定 功能标准，有效率97.6%,优良率90.6%。证实HHK人工腱具有组织相容性好， 对机体刺激小，无明显抗原性，肌张力强，无明显粘连，术后患肢功能恢复快等 特点。该产品安全、可靠、有效，能满足临床需要。青岛大学医学院附属医院邹云雯等36，1996年4月至2001年8月，临床应用HHK人工腱治疗患者112例，其中男性81例，女 性31例，年龄1662岁，平均38岁。损伤原因：切割伤36例，牵拉伤40例， 砸压伤36例。损伤部位：上臂丛神经损伤 20例，手肌腱断裂5例，肱二头肌肌 腱断裂3例，腓总神经损伤致足下垂10例，跟腱断裂25例，正中神经损伤2 例，桡神经损伤5例

41、，膝关节侧副韧带损伤28例，交叉韧带损伤14例。根据损 伤部位与性质，选用相应规格型号的 HHK人工腱行移植术或功能重建术。原则 上对肌腱缺损的病人行HHK人工腱移植修复术；对周围神经损伤和关节韧带损 伤的病人，行HHK人工腱功能重建术；对跟腱断裂的病人，行HHK人工腱“8”字缝合加固术。在112例中，术后只有6例患者切开渗液（培养无细菌生长）， 换药后切口愈合。经随访，采用 Jen ki ns标准进行疗效评价：70例患者的功能恢 复为4级，39例患者的功能恢复为3级，只有3例患者的功能恢复为1级，有效 率97.3%。临床试用结论：HHK人工腱具有良好的组织相容性，对人体的刺激性 小，无明显抗

42、原性，术后患肢功能恢复好等特点。该产品安全、可靠、有效，能 满足临床需要。2.临床推广HHK人工腱这一科研成果转化为产品后，先后在广东、云南、山东、湖南、河 南、河北、广西、天津等省市几十家医院，临床应用一千余例。术后病人无发热 等不良反应，伤口基本都能I期愈合。随访时间长达8年，功能恢复优良率在 90%以上，有效率97%以上。典型病例例116.男，21岁，枪弹击伤右颈部，致右臂丛神经完全断裂伤，右三角肌、肱二头肌完全瘫痪，抬肩、屈肘功能完全丧失； 右手腕、肌力、感觉完全正常。全麻下行 109HH人工腱重建术。术中将斜方肌 游离，以编织法将斜方肌连同肩峰 3cmK2cm 12人发角蛋白人工腱研

43、究进展2cm骨块拉紧下移，一枚螺丝钉固定骨块于肱骨上端，人工腱编织在三角肌止 点肌附着处。抬肩75度外展架制动6周。同时将同侧胸大肌自肱骨上端止点上 剥离，以编织法人工腱固定，通过上臂皮下遂道固定在肱二头肌腱在桡骨止点 处，屈肘60度位外展架固定。术后6周取除外固定架，即刻屈肘30度，手可触 及嘴唇、头顶、抬肩170度。经功能练习可提3040斤重，屈肘、抬肩达正 常，功能十分满意。半年取螺丝钉时，发现人工腱已完全腱化为正常肌腱，头发 完全变为腱纤维。例 216.男，45岁。车祸致左上臂丛神经伤1年，左肩三角肌完全瘫痪，左肱二头肌瘫 痪，肌力均为零级，抬肩屈肘功能完全丧失。左手功能完好。肌电图检

44、查，左腋 神经肌皮神经完全丧失传导功能。在全麻下行左侧背阔肌转移，109HH人工腱编织在背阔肌肌腹，固定在三角肌止点，重建抬肩功能，又行胸大肌代替肱二头 肌，人工腱重建屈肘功能。术后外展固定左上肢于抬肩75度，屈肘60度位。6周拆除固定，手可抬起并触及头顶。半年随访，抬肩、屈肘功能达正常，参加各 种农业劳动。例316.男，19岁。机器绞伤左手，致左手中、环、小指缺损，手掌部疤痕，屈肌腱缺损，食指屈肌腱缺损，伸180度，屈零度，被动活动各指间关节尚好。在臂丛麻醉下行109HH人工腱移植，屈食指肌腱重建术，术中以编织法固定于食指末节残存屈深肌末端及腕上屈肌腱上。功能 位固定3周，逐渐练习屈伸功能。

45、术后 3月随访屈指力量达5级，指尖距掌心 1cm,可对掌拿细小物，可提重物，恢复了手的大部分功能。例416.男，24岁。车祸致左膝关节外侧副韧带断裂，左前交叉韧带断裂，左髌骨粉碎骨折3天入院。左髌骨骨折钢丝内固定，109HH人工腱行前交叉韧带重建术及外侧副韧带修复。术后4周不负重练习膝关节功能，3个月恢复原工作。上下坡、下蹲等活动自如，关节稳定，无肿痛，功 能十分满意。例537.男，24岁，工人。骑摩托车摔伤右下肢，致右股骨中1/3开放性骨折；右膝髌韧带完全断裂。在他院常规对端缝合髌韧 带，内固定股骨痊愈出院。右膝稍肿胀，浮髌试验阴性，侧方挤压试验阴性，抽 屉试验阴性，髌韧带处明显凹陷，膝 9

46、0位不能伸，股四头肌肌力0级，连续硬膜外麻醉下行右膝髌韧带重建术。术中见髌 韧带自胫骨结节上3cm处撕断，断端不整齐，并见多根缝线断头。伸直膝关节 后，两断端相距2cm，无法断端对合缝合。于胫骨结节处用骨钻打孔洞，并扩大 孔洞，同法在髌骨下级横穿骨孔。以 HHK人工腱两端各自从两个洞内穿出，编 织固定，伸膝180。以韧带膜或肌肉覆盖人工腱。张力适中，冲洗伤口，关创， 包扎。术后伤口不红肿，第10d部分拆线，12d完全拆线，伤口 I期愈合。3周开 始练习伸屈膝关节活动，6周逐渐下地行走负重。2个月复查，患膝可屈曲60。， 伸直达180。3个月查肌力达5级，上下楼梯自如，已恢复原工作。例638.男

47、，30岁，工人。因车祸致右膝内侧副韧带断裂，右胫骨平台粉碎性骨折，在院外包草药半个月入院。查体：右膝肿 胀，外侧张力试验示右外侧明显松动不稳，活动受限。X线照片示：右胫骨平台粉碎骨折（碎成4块）。在硬膜外麻醉下，右胫骨以螺栓及钢针固定，切除碎裂 之半月板。外侧行HHK人工腱重建术。人工腱自股骨外上踝骨乳中突入又穿 出，编织缝扎，另一端自腓骨小头骨孔中穿入翻回结扎牢固，缝合伤口。3周后床上练习屈伸膝关节，两个月下地行走。随访1年，恢复开车，膝关节稳定性好。例738.男，23岁，工人。因车祸至左膝内外侧副韧带及前交叉韧带断裂，软组织挫裂伤并左股骨髁部粉碎骨折。伤后石膏托 固定20天转入我院。检查左

48、膝中度肿胀，浮髌试验阳性。股骨髁部压痛，有骨 探音。张力试验，左膝内侧松弛。X线照片示：左股骨髁间粉碎骨折。硬膜外麻 醉下，行左股骨踝部以螺丝及钢针固定，以 HHK人工腱重建前交叉韧带及内侧 副韧带。人工腱的两端均分别从股骨踝部及胫骨骨孔中穿出缝扎牢固。伤口引流 通畅，石膏托固定2个月。拆除石膏，在床上练习膝关节伸屈功能。随访半年， 骨折愈合好，膝关节伸屈180 60,张力试验左膝内侧不松动，左膝抽屉试验阴 性。膝关节十分稳定，上下坡有力，恢复原工作，可骑摩托车。例839.男，40岁。因车祸至左膝内外侧副韧带断裂，左前交叉韧带断裂，左髌骨横断性闭合性人发角蛋白人工腱研究进展13骨折，左髋关节脱

49、位，并股骨头劈裂性骨折，左腓总神经瘫3天入院。分期手术，除对左髋脱位及股骨头劈裂行一次手术外，对髌骨折行钢丝环形固定。以半 腱肌代前交叉韧带，对膝内外侧副韧带行 HHK人工腱重建术。术后X线照片正 侧位像显示，脱位已整复，达到解剖复位。术后 3周进行不持重锻炼膝关节。1 个月后，膝关节功能满意，腓总神经功能恢复；膝关节内外侧张力试验，均为阴 性。抽屉试验向前、向后拉时，膝关节无松动。加大膝关节内侧、外侧张力时， 膝关节无松动。膝关节自主屈曲、伸直自如。自主背伸、踝伸趾自如。自主趾踝 跖屈自如。3个月后复查，病人步态正常，膝关节稳定，无关节肿胀，上下楼梯 自如，并可驾驶摩托车和汽车。例939.男

50、，22岁。因车祸在当地医院行清创、闭合伤口术后1个月后，感膝关节不稳而来我院就医。经查发现右膝外侧张力试 验，膝外侧松弛，示外侧副韧带断裂。膝关节不稳，右膝小腿向后，示后交叉韧 带断裂。用HHK人工腱对右膝外侧副韧带、后交叉韧带进行重建术。术后3个月复查，膝关节稳定，抽屉试验和侧向张力试验均为阴性，步态正常。例 1039.男，25岁。因小儿麻痹后遗症致左膝后屈肌群瘫痪，左膝反张15行HHK人工腱固定术。术后功能满意，4年后复查，未见拉应力衰减。例1139 .男性。因有外展拇长肌腱外伤后缺如2年而就医，用HHK人工腱行替代术。术后功能恢复满意，随访 2年，未见拉应 力衰减。例1240.男，20岁

51、。左拇指屈肌腱损伤，屈拇功能障碍。左拇指屈肌腱损伤缺如，在臂 丛麻醉下行HHK人工腱替代术。用编织法固定后，拇指可屈曲正常位。术后3周，主动练习屈伸活动。术后4周，已恢复拇指的大部分功能。术后 3个月，拇 指屈、伸功能正常。例1340.男，21岁。车祸致左小腿跟腱部软组织缺损，跟腱缺如。行HHK人工腱重建跟腱术及局部皮瓣转移术。术后 2个 月，踝关节背伸、跖屈功能良好。术后 4个月，跟腱恢复正常功能。术后半年随 访，功能满意，可打球、跳高、跑步，跟腱功能恢复与伤前无异。例1440.男，25岁。因小儿麻痹后遗症致左侧膝关节后群肌瘫痪，左膝反张15，行HHK人工腱固定术。术后功能满意，半年 后随访

52、，功能同术后，未见拉应力衰减，行走自如，上下楼梯等功能好。例1541.女，30岁，云南新平县干部。因车 撞伤左膝关节后，行走无力，尤其下坡时经常跌跤，半年入院。查：左股四头肌 明显萎缩，抽屉实验前拉松动。在硬膜外麻下行左膝关节探查术，发现左膝前交 叉韧带断裂。行HHK人工腱替代术，术中先于股骨外髁部前交叉韧带附丽处向 胫前打骨洞，由内上经骨洞向胫前穿出，拉紧并用螺丝钉固定末端。长腿石膏托 固定膝关节功能位14天。术后伤口愈合良好，病人不发烧，无不适反应。第15天开始伸屈膝活动。第20天左膝伸180;下地行走步态良好，无松动情况，下 坡稳定。随访2年，完全恢复功能，股四头肌萎缩消失。例1642.

53、男，44岁，工人。右上臂举重物时，突然剧烈疼痛，不敢活动5小时入院。病人既往身体健康。入院查体：神志清 醒，一般情况好，心、肺未见异常。右臂部明显肿胀，压痛，右肘关节活动受 限，屈肘肌力0级。各种实验室检查未见异常。诊断为右肱二头肌长头肌腱断 裂。臂丛麻醉下行HHK人工腱移植术，以HHK人工腱桥接于右肱二头肌肌腹与 右喙突之间，重建肱二头肌屈肘功能。术后以石膏屈肘90。外固定。六周后拆除外固定，屈肘功能恢复，屈肘肌力达 4级以上。例1742.男，35岁，个体户。骑摩托车摔伤 后，右臂外展、屈肘不能一月入院。入院查体：神志清，一般情况好，心、肺未 见异常，左肩三头肌萎缩，外展肌力 0级，肱二头肌

54、肌腹萎缩，屈肘肌力 0级。 各种实验室检查未见异常。入院诊断：左上臂丛根性撕脱伤。全麻下行HHK人工腱重建术。以斜方肌作为动力肌，将 HHK人工腱桥接于斜方肌与肱骨三头肌 止点之间，重建肩外展功能；以胸大肌作为动力肌，将HHK人工腱桥接于胸大肌肱骨止点与尺骨肱二头肌止点之间，重建屈肘功能。术后以石膏肩外展、屈肘 各90。外固定。6周后拆除外固定，肩外展、屈肘肌力均恢复到 4级以上。14人发角蛋白人工腱研究进展综上所述，HHK人工腱不但克服了以往各种人工腱，包括自体腱和异体腱的不足 之处，而且还兼具其所有优点，非常接近人们所期望的那种理想人工腱的要求：（1）组织相容性好，未发现抗原性，无发生局部

55、和全身排斥反应；（2）植入后可被机体吸收，同时诱导形成新的自体腱；（3）腱的衔接部位能组织愈合，拉应力无明显衰减，一般在6个月后可恢复到正常腱的功能；（4）可屈性和绕弯 性好，便于手术操作，并能保持良好的功能度；（5）未出现影响功能活动的粘 连，有良好的滑动性，无需行U期松解术；（6）产品包装采用芬兰 Wipak包装 公司生产的Steriking透明式无菌包装袋，经压力蒸汽灭菌，无菌有效期长达60个月。安全可靠，运输、贮存都很方便。四、HHK人工腱实质为HHK在体组织工程腱 组织工程是运用细胞生物学和细胞 工程学的原理，构建修复和重建损伤的组织或器官替代物的一门学科。其核心是 把载体材料与相关

56、组织或器官的功能细胞相融合，形成具有特定组织或器官功能 的生物代用品。种子细胞和可吸收生物性支架材料（细胞外基质）是构建修复和 重建损伤组织或器官替代物的两个必备条件。要求种子细胞要有良好的组织相容 性，使之不被受体免疫系统排斥。同时还要解决好种子细胞在体外培养传代扩增 过程中的老化和功能退化及变异的问题，使之不致丧失其特有功能；要求可吸收 生物性支架材料要有良好的生物相容性、生物亲和力，使种子细胞能与之牢固粘 附，且能充分发挥细胞的功能。同时还要能控制其降解速率与细胞生长的同步 性，降解产物的理化性能必须符合种子细胞生长环境的要求，最终形成新的功能 组织或器官取而代之。由于种子细胞取自同种异

57、体或异种（遗传修饰或未修饰），不可避免地在体内被 宿主排斥，而且其遗传性状或功能的改变是个潜在的危险。HHK人工腱在修复和重建损伤肌腱组织的过程中，较好地解决了这些问题：种子 细胞，成体干细胞（如腱形成细胞，滑膜前体细胞，间充质细胞）来自自体腱膜 下和损伤肌腱残端组织内25，26;可吸收生物性支架材料，HHK人工腱具有良好的生物相容 性、生物亲和力13-15，其降解最终产物基本上全是氨基酸12，而且脯氨酸约占9 %，甘氨酸约占4%，正好就地取材，作为合成新生自体腱 胶原蛋白（脯氨酸约占20 %，甘氨酸约占30 %）的原料。其降解速率和抗拉强 度，可以通过对人发生物化学处理程序、程度的调整和改变各组分材料的组合比 例两个途径来进行有效控制。有学者43认为：自体细胞