虫草多糖的分离纯化及含量测定

1、虫草多糖的分离纯化及含量测定冬虫夏草首载于本草从新，味甘,性温，归肺、肾经，具补肺益肾，止血化 痰之功效。冬虫虫草中含量最高的活性物质是虫草多糖 ，因其可以抗氧化、抗肿 瘤和增强免疫力等功效而受广大人群青睐，由于天然的活性成分来源有限，现多 采用人工发酵法生产制备。作者用苯酚-硫酸法测定虫草多糖含量。1?材料?供试材料虫草菌株（青海省）;蒸馏水（双蒸水）、发酵液精多糖I和菌丝体精多糖n ;葡萄糖标准溶液（100卩g/mL）等。?仪器及设备培养箱（常州市恒久仪器制造有限公司光照培养箱）;高压蒸汽灭菌设备 （鸡西辰丰医疗器械制造有限公司型立式压力蒸汽灭菌器）;大容量离心机（北京 时代北利离心机有限

2、公司 GTR10-2）;紫外分光光度计（上海悦丰仪器仪表有限公 司）等。?培养基配方?活化培养基（g/mL）?蔗糖溶液，葡萄糖溶液，蛋白胨，酵母粉，琼脂,KH2PO4 %,gSO4 7H2O 5%,pH 自然,培养温度 27C。?发酵培 养基 （g/mL）?葡萄糖，蛋白胨，酵母粉5%, KH2PO4 %,MgSO47H2O 5%, pH 自然，温度 27C。2?方法?配制培养基和灭菌按体积向培养基中加入蒸馏水，加热煮沸,调节pH值至中性，趁热倒入 容器中。高压蒸汽灭菌，温度C ,时间20 min。灭菌完成，趁热倒在平板上。?活化菌种在无菌条件下，将冷冻完好的菌种接到培养基上，无光条件下27C培

3、养, 培养菌丝洁白并生长旺盛且无杂菌后备用。?配制发酵培养基及培养把培养基上的菌种快速接入到发酵培养基中，在27C条件下,无光培养192 h。?发酵液多糖的分离纯化?发酵液及透析袋的处理？发酵液在4 000 r/min条件下离心20 min,过 滤得到上清液和沉淀（菌丝体）。将透析袋分成小段后，处理后在4C条件下存放 于冰箱保存待用。?发酵液多糖的提取？醇沉：将无水乙醇以3倍体积加于发酵液中，离心后得上清液,4 C条件静置12 h后,在4 000 r/min 离心15 min,过滤得沉淀，用 乙醇洗涤。脱蛋白：用热水将发酵液粗多糖溶解，冷却后反复3次去蛋白。脱色： 多糖溶液加舌性碳去色素，透析

4、:将脱色后的虫草多糖溶液装入透析袋中，在蒸 馏水中透析24 h,将3倍体积乙醇加于透析后溶液中，在4C条件下沉淀过夜，离 心得沉淀物并干燥，制得发酵液精多糖。?沉淀物的处理？用研钵研碎发酵所制得的菌丝体，加蒸馏水至体积的10倍,水浴加热96100C条件下浸提3 h,反复浸提3次并将滤液合并，加入95% 乙醇至4倍体积并低温沉淀过夜，离心制得沉淀，然后用乙醇和丙酮各洗涤2次， 干燥,得粗多糖。?发酵液多糖的测定?制作葡萄糖标准曲线？将葡萄糖标准溶液（100卩g/mL）、mL加入 试管中，加蒸馏水至mL。用移液管分别移取mL加入比色管中。滴入重蒸苯酚溶 液mL,震动摇晃均匀，立即加入浓硫酸mL摇匀

5、，静置10 min,水浴加热30 min, 温度40C。在波长490 nm处,测定每个管的吸光度，得A值（以mL蒸馏水作为空白）。 横坐标为蔗糖浓度，纵坐标为吸光度A做标准曲线，制得回归方程:y= 3x+ 9。?测定样品含量？将干燥至恒重的发酵液精多糖50 mg,用减量法称取后 放置在100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，作标号I。取样品液I mL, 按刚制得的标准曲线方法，测定多糖溶液A值，平行测定3次。计算得出含量。3?结果?虫草多糖含量测定冬虫夏草的产地不同，提取率也不同，其有效成分多糖的含量用苯酚一硫酸法测定结果也不同，测定结果见表1。?与蒽酮一硫酸法比较取北虫草子实体，用蒽

6、酮一硫酸法进行测定，得到4个样品的多糖含量 数值分别为% % % %,但是这种测定方法对于测定虫草发酵液的胞外多糖重现 性不好,对测定结果的少部分蛋白影响较大。4?讨论?浓硫酸对测定结果的影响必须快速滴加浓硫酸，这样才能使高温瞬时产生，有利于多糖完全水解， 如果滴加硫酸过慢，则不能产生高温条件，则多糖水解不完全，会给测定结果造成误差。?苯酚对测定结果的影响苯酚应配制成一定浓度的溶液，并且在整个检测过程中滴加苯酚动作要 迅速,避免苯酚氧化变性，对测定结果产生影响。现在虫草多糖的检测方法中，主要测定是粗多糖含量。用苯酚一硫酸法 测定时,不需要虫草多糖的纯品和高级精密仪器，优点是灵敏度高、准确性高、精 确度高、重现性好、简单快速等优点，可以作为对虫草多糖含量测定的最佳选择 方法之一。参考文献袁建国,程显好,侯永勤,等.功能因子冬虫夏草多糖的研究开发J.中 国食品添加剂，1999(2):18-22.韩永萍,林强，何绪文.虫草菌丝体多糖的提取研究J.中国食用菌,20XX (6) :53-55.来永斌,王琦,孙月.蛹虫草多糖含量的测定及分析J.中成药,20XX,23(7):517-518.闫文娟,李泰辉，唐芳永.广东虫草多糖的提取及含量测定J.华南农 业大学学报,20XX(30