免疫组化中的阳性对照与阴性对照如何设置

1、免疫组化中的阳性对照与阴性对照如何设置问题：免疫组化中的阳性对照与阴性对照如何设置？参考见解 1 ：阳性对照：已知含有要测的抗原的组织。阴性对照：可以做几种：空白对照：免去一抗代替对照：免疫前血清代替一抗已知阴性组织抑制试验：未标记抗体要发文章建议做代替对照。参考见解 2 ：楼上回答的真好，不过组织内对照的合理使用可以免去设置实验对照的很多麻烦！问题： 免疫组化技术 (IHC) 的优点是什么参考见解：1特异性强免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（ keratin ）显示上皮成分， LCA 显示淋巴细胞成分。只

2、有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。2敏感性高在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制， 只有直接法、 间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC 法或 SP 法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。3定位准确、形态与功能相结合该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。免疫组化常见问题的处理参考

3、意见：当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。对照 /标本无染色 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM 一抗，二抗必须是山羊 /兔抗小鼠的IgM （不是 IgG ）二抗。1 / 5 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司

4、的抗体均要求在48 条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。 检查色原 /底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的 pH 值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。弱阳性如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：

5、 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。 不适当的抗原修复方式， 由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用， 必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度 / 时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。 切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。 孵

6、育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。非特异性染色 是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是， 并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处理的方法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1 ）加入底物液中，并保持pH 值在 7.68.2 ，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。饱和处理内源性生物素：消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以

7、饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC 法或 SP 法染色前将切片浸于25ug/ml 亲和素溶液中处理15 分钟，PBS 清洗 15 分钟后即可染色。 是否选择使用了正确的封闭血清。 电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用 PBS 稀释为 3%-10% 溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5% 脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。 所选择的抗体是否符合试验要求。 因抗原不纯、 标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只

8、能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。 一抗的使用浓度是否过高。 清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l Tris HCl ，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20 ，效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。 DBA 的使用是否正确。DAB 的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB 试剂盒2 / 5时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH 值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB 溶解时，常有一些不溶性颗粒，这

9、些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外， DAB 保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB 保存于避光干燥处，现用现配，临用前加 H2O2 。孵育时间过长也会造成背景染色。 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。1、染色过强原因解决办法A 、抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或 4 过夜B 、孵育温度过高，孵育温度超过37 一般室温20-28 C、 DAB 显色时间过长或DAB 浓度过高显色时间不能超过5-10 分钟，以显微镜下观察为

10、准2、非特异性背景染色原因解决办法A 、操作过程中冲洗不充分每步冲洗35B 、组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H2O2 封闭，孵育时间延长C、组织中含内源性生物素正常非免疫动物血清再封闭D、血清蛋白封闭不充分延长血清蛋白封闭时间3、染色弱原因解决办法A 、抗体浓度过低，孵育时间过短提高抗体浓度，孵育时间不能少于60 分钟B 、试剂超过有效使用期及时更换试剂C、操作中， 滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）D、室温太低，低于 15 若室温低于 15 度，要改放在 37 孵育箱孵育 30-60 分钟（或 4 冰箱过夜）E 、蛋白封闭过度

11、封闭时间不要超过10 分钟4、染色阴性原因解决办法A 、操作步骤错误重新试验，设立阳性对照B 、组织中无抗原设立阳性对照片，以验证实验结果C、一抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗与二抗种属无误【请教】免疫组化阳性、阴性对照的问题各位大虾，我做了大鼠组织的TNF- 免疫组化，是取材后送到医院病理科出钱代做的，现HE 和免疫组化片子已经做好， 我才意识到没有阳性和阴性对照， 请问这两种对照该怎么弄，是我自己想办法还是该病理科负责给我设立？需要我自己再买相应的试剂吗？以前没有做过，所以一头雾水，请不吝赐教，多谢!3 / 5免疫组化的同一批片子中要有阳性对照和阴性对照才有意义, 这些应该是同时作出来的,

12、事后无法补救 .阳性对照片在购试剂时可以要求附两张试剂公司的阳性片子, 如果没有 , 也可以自已搞, 我做的时候是用肿瘤组织作阳性对照,实验动物组织不加一抗作阴性对照, 你可以根据自己的实验设立阳性对照, 不用再购买试剂.个人见解 ,希望对你有帮助.免疫组化染色中的对照片的设置非常重要，它是判断您的染色是否成功的关键依据，而且也是检测每一个抗体的质量标准，常设的对照如下：自身对照、阴性对照（空白对照、替代对照、抑制对照、吸收实验对照）、阳性对照。A 、自身对照：在同一切片上与检测的目的物对照比较。如Actin 、CD34在正常组织中的血管壁肌层应为阳性，Vimentin可以间质细胞，Desmin以血管壁及肌束为对照，S-100以小神经末为对照等，如果应为阳性的组织是阳性，则技术操作正确，如为阴性， 则表明技术或免疫试剂质量有问题。B 、空白对照：用缓冲液替代一抗。C、替代对照：用非免疫血清替代一抗。D