第十一章维生素测定

1、第十一章维生素测定第十一章维生素测定 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 4.6.1 4.6.1 维生素的测定概述维生素的测定概述 维生素是调节人体各种新陈代谢过程必不可少的重要维生素是调节人体各种新陈代谢过程必不可少的重要 营养素。人体如从膳食中摄入维生素的量不足或者机体营养素。人体如从膳食中摄入维生素的量不足或者机体 由于某种原因吸收或合成发生障碍时，就会引起各种维由于某种原因吸收或合成发生障碍时，就会引起各种维 生素缺乏症。近几年已经查明仅有少数几种维生素可以生素缺乏症。近几年已经查明仅有少数几种维生素可以 在体内合成，大多数维生素都必须由食物供给。因此，在体内合成，大多数维生素都必须

2、由食物供给。因此， 维生素作为强化剂已在食品工业的某些产品中开始使用，维生素作为强化剂已在食品工业的某些产品中开始使用， 测定食品中的维生素含量，不仅可评价食品的营养价值，测定食品中的维生素含量，不仅可评价食品的营养价值， 同时还起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多同时还起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多 的维生素而引起中毒，所以，测定食品中维生素在营养的维生素而引起中毒，所以，测定食品中维生素在营养 分析方面具有重要的意义。分析方面具有重要的意义。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 脂溶性微生物素（如脂溶性微生物素（如A A、D D、E E、K K等）；等）； 水溶性维生素

3、（如水溶性维生素（如B1B1、B2B2、B6B6、C C、B12B12等）。等）。 维生素维生素A A：是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜：是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜 炎、夜盲症等疾病。炎、夜盲症等疾病。 维生素维生素B B1 1：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经 炎，帮助消化，促进发育。炎，帮助消化，促进发育。 维生素维生素B B2 2：对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。：对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。 维生素维生素C C：防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗力。：防坏血病，促进外伤愈合，

4、使机体增强抵抗力。 维生素维生素D D：调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的：调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的 代谢，并能防止软骨病。代谢，并能防止软骨病。 目前已发现的维生素约有二、三十种，按维生素溶解目前已发现的维生素约有二、三十种，按维生素溶解 性能可将它们分成两大类：性能可将它们分成两大类： 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 4.6.2 4.6.2 分析方法分析方法 维生素的分析方法可分为以下几种：维生素的分析方法可分为以下几种： （1 1）涉及人体和动物的生物分析方法。）涉及人体和动物的生物分析方法。 （2 2）利用原生动物、细菌和酵母的微生物分析方法）利用原

5、生动物、细菌和酵母的微生物分析方法 （3 3）分光光度法、荧光法、色谱、酶法和免疫等物）分光光度法、荧光法、色谱、酶法和免疫等物 理化学分析方法。理化学分析方法。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 4.6.2.1 4.6.2.1 脂溶性维生素的测定脂溶性维生素的测定 一、维生素一、维生素A 目前维生素目前维生素A A都是合成的，来源：都是合成的，来源： （1 1）从动物肝脏中得到；）从动物肝脏中得到； （2 2）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指 类胡萝卜素，主要是类胡萝卜素，主要是-胡萝卜素）胡萝卜素） 维生素维生素A A的测定常用的方法有三氯

6、化锑比色的测定常用的方法有三氯化锑比色 法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 对于三氯化锑比色法适用于样品中含对于三氯化锑比色法适用于样品中含VAVA高的高的 样品，方法简便、快速、结果准确，但是对维样品，方法简便、快速、结果准确，但是对维 生素生素A A含量低的样品，如每克样品中含含量低的样品，如每克样品中含5 510g10g 维生素维生素A A时，这时样品由于受其脂溶性物质的干时，这时样品由于受其脂溶性物质的干 扰，不应用比色法测定。扰，不应用比色法测定。 对于紫外分光光度法不必加显色剂显色，对于紫外

7、分光光度法不必加显色剂显色， 可直接测定维生素可直接测定维生素A A的含量，对样品中含的含量，对样品中含VAVA低的低的 也可以测出可信结果，操作简便、快速。也可以测出可信结果，操作简便、快速。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 1、维生素、维生素A的性质的性质 因有许多不饱和链，故见光易分解；因有许多不饱和链，故见光易分解； 在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。 如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时 间短，因为时间长，见光时间长，见光分解，间短，因为时间长，见光时间长，见光分解， 故测出的比出厂的含量

8、要少；故测出的比出厂的含量要少； 对碱稳定；对碱稳定； 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 2. 2. 测定方法测定方法 2.1 2.1 三氯化锑光度法三氯化锑光度法 2.1.1 2.1.1 测定原理测定原理 在氯仿溶液中，维生素在氯仿溶液中，维生素A A与三氯化锑作用可生与三氯化锑作用可生 成蓝色可溶性络合物，在成蓝色可溶性络合物，在620nm620nm波长处有最大吸收波长处有最大吸收 峰，其蓝色的深浅与维生素峰，其蓝色的深浅与维生素A A的含量在一定范围内的含量在一定范围内 成正比，故可通过吸光度测定维生素成正比，故可通过吸光度测定维生素A A的含量。的含量。 第十一章维生素测定第十一章

9、维生素测定 2.1.2 2.1.2 测定步骤测定步骤 样品用有机溶剂萃取脂类样品用有机溶剂萃取脂类 样品可以根据脂肪的测定处理脂肪，即索样品可以根据脂肪的测定处理脂肪，即索 氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用回流方氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用回流方 法提取脂类。如果样品中含蛋白质和淀粉多的法提取脂类。如果样品中含蛋白质和淀粉多的 情况下可采用乙醚提取法。情况下可采用乙醚提取法。 脂类的皂化脂类的皂化 脂类含有维生素和脂肪这两部分，通过皂脂类含有维生素和脂肪这两部分，通过皂 化（化（50%KOH50%KOH、无水、无水C C2 2H H5 5OHOH、热回流）把它们分、热回流）把它们分 开

10、，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 皂化条件：皂化条件： （1）C2H5OH脂类脂类 = 81； （2）皂化温度与时间：）皂化温度与时间：70、30分钟分钟 在皂化时可以加入抗氧剂焦性没食子酸，防止氧化。在皂化时可以加入抗氧剂焦性没食子酸，防止氧化。 目前皂化有三种情况：目前皂化有三种情况： 低碱低碱 = 脂肪脂肪KOH为为12.5的关系的关系 另外在皂化时加抗氧化剂与不加抗氧化剂回收率不一样，加抗氧另外在皂化时加抗氧化剂与不加抗氧化剂回收率不一样，加抗氧 化剂的回收率高于不加抗氧化剂的回收率。化剂的回收率高于不加抗

11、氧化剂的回收率。 低温（室温）低温（室温） 中温（中温（707022） 高温（高温（10015min10015min） 低碱低碱低碱低碱低碱低碱 回收率不完全回收率不完全 回收率回收率46%46%回收率回收率70%70% 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 提取：不皂化物和皂化物经水、乙醚萃取可得提取：不皂化物和皂化物经水、乙醚萃取可得 到不皂化物。到不皂化物。 柱层析分离干扰物质柱层析分离干扰物质 采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把 -胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素A A与与 -胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分

12、离胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分离 开。如果样品中只有维生素开。如果样品中只有维生素A A而不含而不含-胡萝卜胡萝卜 素时，这时可直接定容。素时，这时可直接定容。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 维生素维生素A与与-胡萝卜素分离：胡萝卜素分离： 吸附剂：吸附剂： 8份中性份中性Al2O3和和2份碱性份碱性Al2O3混合，装柱混合，装柱 分离方法：分离方法：a. 用用2%丙酮石油醚洗丙酮石油醚洗-胡萝卜素；胡萝卜素； b. 用乙醚洗用乙醚洗VA。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 2.1.3 2.1.3 计算计算 SbCl3比色法比色法 维生素维生素ACHCl3 SbCl3CHC

13、l3形成兰色物形成兰色物 质质在在620nm有最大吸光峰有最大吸光峰 这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质， 所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。 计算：每百克样品含计算：每百克样品含VA的量的量= C（V1/V2）（100/W） C ：从标准曲线上查得：从标准曲线上查得VA的量的量 V1 ： CHCl3定容的量定容的量 V2 ： 测定所取样液体积测定所取样液体积 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 说明及讨论说明及讨论 （1）乙醚中是否含有过氧化物的检验方法）乙醚中是否含有过氧化物的检

14、验方法 （2）乙醇中是否含有醛的检验方法）乙醇中是否含有醛的检验方法 （3）三氯甲烷中是否含有分解产物）三氯甲烷中是否含有分解产物 2CHCl3 + O2 2HCl + 2CCl2O（4）所）所 用氯仿不应含有水用氯仿不应含有水 SbCl3 + H2O SbOCl + 2 HCl （4）维生素）维生素A 见光易分解，整个实验应在暗处见光易分解，整个实验应在暗处 进行进行 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 说明及讨论说明及讨论 （5 5）由于）由于三氯化锑与三氯化锑与维生素维生素A A 所产生的蓝色物质所产生的蓝色物质 不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析不稳定，很快褪色或变成其它物质

15、，所以在分析 时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。 （6 6）三氯化锑腐蚀性较强，不能沾在皮肤上，三氯化锑腐蚀性较强，不能沾在皮肤上， 用过的仪器应用盐酸浸泡而后清洗。用过的仪器应用盐酸浸泡而后清洗。 （7 7）本法适用于）本法适用于维生素维生素A A 含量较高的样品。含量较高的样品。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 紫外吸收光谱：分子价电子能级跃迁。紫外吸收光谱：分子价电子能级跃迁。 波长范围：波长范围：100-800 100-800 nm.nm. (1) (1) 远紫外光区远紫外光区: : 100-200100-200nm nm (2) (2) 近

16、紫外光区近紫外光区: 200-400: 200-400nmnm (3)(3)可见光区可见光区:400-800:400-800nmnm 250 300 350 400nm 1 2 3 4 e e 可用于结构鉴定和定量分析。可用于结构鉴定和定量分析。 电子跃迁的同时，伴随着振动电子跃迁的同时，伴随着振动 转动能级的跃迁转动能级的跃迁; ;带状光谱。带状光谱。 2 测定方法测定方法 2.2 紫外分光光度法紫外分光光度法 紫外吸收光谱的产生紫外吸收光谱的产生 描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度 的关系的关系 假设一束平行单色光通过一个吸光物体假

17、设一束平行单色光通过一个吸光物体 CABeer lALamber 定律： 定律： n l S I I 吸光质点数为 厚度为 物体截面为 透过光强为 入射光强为 0 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 紫外分光光度法测定维生素紫外分光光度法测定维生素A A lCETA I I T lg 0 吸光度 透光率 原理：原理：VA为脂溶性的，测定为脂溶性的，测定VA时必须先将样时必须先将样 品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化 部分，在经柱层析除去杂质等干扰物质，在部分，在经柱层析除去杂质等干扰物质，在 紫外紫外328nm下测定，求出含量。下测定，求出含量。 第

18、十一章维生素测定第十一章维生素测定 二、维生素二、维生素D D 1.维生素维生素D的性质的性质 维生素维生素D是类固醇的衍生物，具有维生素是类固醇的衍生物，具有维生素D 活性的物质约活性的物质约10余种，在功能上可以防治佝偻病。余种，在功能上可以防治佝偻病。 其中最主要的是维生素其中最主要的是维生素D2(麦角钙化醇麦角钙化醇)和维生素和维生素 D3(胆钙醇胆钙醇)。 维生素维生素D在鱼肝油和鸡蛋黄等食品中含量较在鱼肝油和鸡蛋黄等食品中含量较 多，一般成人不会缺多，一般成人不会缺VD，而婴儿容易缺乏。，而婴儿容易缺乏。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 2. 测定方法测定方法 2.1 三氯化

19、锑光度法三氯化锑光度法 原理：在三氯甲烷溶液中，维生素原理：在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑与三氯化锑 结合生成一种橙黄色化合物，并于结合生成一种橙黄色化合物，并于500nm波长处波长处 有一个最大吸收，其呈色程度与维生素有一个最大吸收，其呈色程度与维生素D含量成含量成 正比。正比。 维生素维生素DCHCl3 SbCl3CHCl3 形成橙黄色物质形成橙黄色物质 500 nm下测定下测定 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 说明说明 食品中维生素食品中维生素D D含量一般较低，而其他维含量一般较低，而其他维 生素及物质含量大于维生素生素及物质含量大于维生素D D，对测定产生干，对测定产生干

20、 扰，测定前必须经柱层析除去这些物质。扰，测定前必须经柱层析除去这些物质。 此法测定值为此法测定值为D D2 2和和D D3 3的总量。的总量。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 2.2 2.2 紫外分光光度法紫外分光光度法 V VD D乙醇乙醇 265 nm 265 nm下测定下测定 2.3 2.3 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC） 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性有官能团的化合物和异构体

21、有较高选择性 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 4.6.2.24.6.2.2 水溶性维生素的测定水溶性维生素的测定 一、维生素一、维生素B B1 1的测定的测定 VBVB1 1又叫硫胺素又叫硫胺素 1 1、食品中、食品中VBVB1 1的存在形式的存在形式 常以游离态存在；常以游离态存在；复合脂形式存在（磷蛋白）；复合脂形式存在（磷蛋白）； 辅羧酶形式存在辅羧酶形式存在 VB VB1 1在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色 的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富，动物组织不如植物的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富，动物组织不如植物 含量丰富。含量丰富。 第十一章维生素

22、测定第十一章维生素测定 2 2、VBVB1 1的性质的性质 VB VB1 1在中性、碱性下不稳定，易分解；在中性、碱性下不稳定，易分解； VB VB1 1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也在酸性条件下稳定，即使加热酸性也 稳定；稳定； VB VB1 1为白色结晶，微溶于为白色结晶，微溶于C C2 2H H5 5OHOH，不溶于乙，不溶于乙 醚或醚或CHClCHCl3 3，易溶于水。，易溶于水。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 3、VB1的测定的测定 世界各国都用荧光法测定世界各国都用荧光法测定 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程 1. 1

23、. 分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂；分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态基态( (S S0 0)激发态激发态( (S S1 1、S S2 2、激发态振动能级激发态振动能级) )：吸收特定频吸收特定频 率的辐射；量子化；跃迁一次到位；率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式( (见能级图见能级图) )；速度最快、；速度最快、 激发态寿命最短的途径占优势；激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S S1 1 、

24、、S S2 2 ； 第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T T1 1 、 、 T T2 2 ； ； 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 S2 S1 S0 T1 吸吸 收收 发发 射射 荧荧 光光 发发 射射 磷磷 光光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l l 2l l 1 l l 3 外转换 l l 2 T2 内转换 振动弛豫 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 二、激发光谱与荧光二、激发光谱与荧光( (磷光磷光) )光谱光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 1.1.荧光荧光( (磷光磷光) )的激发光谱曲

25、线的激发光谱曲线 固定测量波长固定测量波长( (选最大发射波长选最大发射波长),),化合物发射的化合物发射的 荧光荧光( (磷光磷光) )强度与照射光波长的关系曲线强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲（图中曲 线线I I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最 多，荧光强度最大；多，荧光强度最大； 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 2.2.荧光光谱荧光光谱( (或磷光光谱或磷光光谱) ) 固定激发光波长固定激发光波长( (选选 最大激发波长最大激发波长), ), 化合物化合物 发射的荧光发射的荧光( (或磷光强度或磷光强度 ) )与发射光波

26、长关系曲线与发射光波长关系曲线 ( (图中曲线图中曲线IIII或或IIIIII) )。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 200260320380440500560620 荧光激发光谱荧光激发光谱 荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系 1. 1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件 （1 1）具有合适的结构；）具有合适的结构； （2 2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（荧光

27、量子产率（ ）：）： 吸收的光量子数 发射的光量子数 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 2.2.定量依据与方法定量依据与方法 (1)(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 I If f正比于正比于吸收的光量吸收的光量I Ia a和荧光量子效和荧光量子效 率率 ： I If f = = I Ia a 由朗由朗- -比耳定律：比耳定律： I Ia a = = I I0 0(1-10(1-10- -e e l c l c ) ) I If f = = I I0 0(1-10(1-10- -e e l c l c ) = ) = I I0 0(1-(1-e e-2.3 -2.3e e l c l

28、 c ) ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后： I If f = 2.3 = 2.3 I I0 0 e e l c l c = = KcKc 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 （2 2）定量方法）定量方法 标准曲线法：标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘 制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光 强度，在标准曲线上求出浓度强度，在标准曲线上求出浓度 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 VB1的测定的测定 原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧原理：硫胺素在

29、碱性铁氰化钾溶液中，被氧 化成一种兰色荧光物质，即为硫色素，在化成一种兰色荧光物质，即为硫色素，在 紫外光下，硫色素发出荧光。紫外光下，硫色素发出荧光。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 二、维生素维生素B B2 2的测定的测定 （1）VB2的特性的特性（Properties of VB2） 对热稳定，对酸和中性对热稳定，对酸和中性pH也稳定也稳定,在在120 加热加热 6h仅少量破坏。仅少量破坏。 在碱性条件下迅速分解。在碱性条件下迅速分解。 在光照下转变为光黄素和光色素在光照下转变为光黄素和光色素,并产生自由基并产生自由基, 破坏其它营养成分产生异味破坏其它营养成分产生异味,如牛奶的日

30、光臭味如牛奶的日光臭味 即由此产生。即由此产生。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 三、维生素三、维生素C的测定的测定 维生素维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作 用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱 氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、 蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、 柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本 身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗

31、氧化剂。身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 维生素维生素C（还原型）纯品为白色无臭结晶，（还原型）纯品为白色无臭结晶， 熔点熔点190192，溶于水或乙醇中，不溶于，溶于水或乙醇中，不溶于 油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下 易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始开始 氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如 果进一步水解则生成果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失二酮古乐糖酸，失 去生理作用。去生理作用。 第十一章维生素测定第十一章维生素测定 根据它具有的还原性质可以测定维生素根据它具有的还原性质可以测定维生素C的的 含量。常用的测定方法有含量。常用的测定方法有 （1）2，6-二氯靛酚法二氯靛酚法 （还原型（还原型VC） （2）2，4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （总（总VC） （3）碘酸法）碘酸