利用小随体多重PCR跟带型分析鉴别酿酒酵母菌株

1、第一学习小组段志峰刁文涛唐亦辰朱江 邢英超 冯延宾 张熠 黄云 何骁男利用微卫星多重PCR和带型分析鉴别酿酒酵母菌株摘要我们提出了一种利用多重PCR寸微卫星位点多态性分析快速鉴别酿酒酵母菌种的方法。无需使用苯酚，简单提取 DNA利用多重PCF扩增SC8132X,YOR267Cffi SCPTSY位点，用琼 脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行带型分析，这种方法可使我们区分 30 种商用葡萄酒酿酒菌 种。该方法被成功应用于一项在 15和 20摄氏度这两个发酵温度下检验两个菌株间的显性关 系的生态学研究中。这种方法在酿酒和酵母生产工业中常规的低成本检测酵母菌株的过程中应该有应用价值。关键词：微卫星，PCR

2、酵母菌株，葡萄酒，发酵1. 前言使用选育出的用于酒精发酵的酵母菌株酿造葡萄酒是现在普遍使用的一种方法。酵母寸 葡萄酒的质量尤其是口味有很大的影响(现代的酿酒学家发现用不同的酵母菌株发酵可以使葡萄酒产生不同的特点。这导致了具 有多种特色并可以应用于不同领域的选育菌株工业生产化。现在市场上提供了几百种葡萄酒 菌种，它们几乎都属于酿酒酵母菌属。与此同时，人们寸发明快速而且精确检测酵母菌株的方法也产生了兴趣。在葡萄酒酿造 中，它的应用包括确定接种菌株寸在未发酵葡萄汁中野生菌株的显性优势，实时记录发酵中 的菌株动态过程，控制菌株生产的质量并鉴别无效菌株。酿酒时，选育出的菌株被接种于富 含野生酿酒酵母和非

3、酿酒酵母的葡萄汁中。快速鉴别酵母菌株的方法应该考虑到菌群生长动 态的观察，选育菌株的显性优势和环境因素寸酵母菌株的影响。在葡萄酒发酵，温度是影响 酵母动力学的一个主要因素(Fleet and Heard,1993);生态研究也显示出了酿酒酵母菌株的 不同行为。 (Epifanio et al., 1999; Torijaet al., 2003).事实上，酿酒商要求菌株的一个突出特点是能够在特定的温度下进行良好的发酵反应。很多时候，在一个典型的发酵白葡萄，发酵温度应保持 18 摄氏度，但达到 12-15 摄氏度也 不少见，从而提高调味品酯的含量并减少高酒精形成。在此温度下，经常会发生发酵停滞，

4、 因此，在这种状况下，选育菌种的低温代谢能力和对野生菌种的显性优势备受重视。在过去的几年中，研究侧重于用分子生物学方法进行菌株分化( Beh et al., 2006 ) ， 如染色体分析法( Carle and Olson,1985; Blondin and Vezinhet, 1988 )和限制性片段长 度多态性(RFLP )分析mDNA (Querolet al., 1992)，以及基于PCR勺方法，其中包括内部转录序列(ITS )的核糖体 DNA测序(Montrocher et al., 1998), S元件插入位点勺多态性( Cameron et al., 1979;Ness et

5、al., 1993) ，扩增片段长度多态性( AFLP ) 的(De Barros Lopes et al., 1999)，随机扩增多态性 DNA ( RAPD )(Baleiras-Coutoet al., 1996)， 内含子剪接序列扩增( De Barros Lopeset al., 1996 )及 PCR内含的线粒体基因(Lo pez et al., 2003)。这些方法在关于分辨率和处理时间方面对经典生理学实验起到了增强作用，但是其中一 些方法还有些限制条件，因为它们几乎不能应用于日常的分析中，或者当它们容易实施时， 它们并不能在菌种水平上完全区分这些菌株。此外，在一些方法中，如 S

6、 元件分型和 RAPD， 其重现性取决于 DNA模板的纯度和浓度。(Ferna ndez-Espinar et al., 2001; Beh et al., 2006)。这些缺点意味着花费大量时间和资金进行DNA青理步骤，在某些情况下还需要几步反应，以评估非重复性带型发生的可能性。 基于具有长度多态性的简单序列重复基因位点分散在整个基因组中，微卫星分析已成功地被 用来区分酵母菌株( Field and Wills, 1998;Gonzalez Techera et al., 2001; Pe rez etal., 2001;Hennequin et al., 2001; Malgoire et

7、 al., 2005)。最近，利用对具高度多态性的微卫星位点的多重PCR方法可 以分离一系列商用酵 母菌株(Schuller et al., 2004;Bradbury et al., 2005; Legras et al., 2005)。微卫星位点 PCR高辨别能力以及其稳定性和实用性使其成为区分酵母菌种最受欢迎的方法之一。这个方法用于常规检测的瓶颈 发生在扩增子分析的步骤：利用聚丙烯酰胺凝胶及测序分析仪确定扩增子的大小较为费时费 力。为了避免这个限制， 有人提出利用简单的高张力琼脂糖凝胶电泳 (Routmanand Cheverud, 1994;Ferraro et al., 1998)。

8、最近，Howell 等人(2004)建议利用对 SC8132X位点的 PCR 扩增和聚丙烯酰胺凝胶加EB染色电泳来进行酿酒酵母的分型。为了建立一种快速精确并且甚至适用于那些低预算高通量实验室的鉴别菌种的方法，我们对 3 个高多态性微卫星位点的多重扩增( Gonzalez Techera et al., 2001 )，然后用琼脂 糖凝胶电泳进行带型分析。作为第一步，我们对一组 29 种商用酵母菌株进行测试，另加一酿酒酵母菌株作为参考， 以检查该方法的鉴别能力。然后，我们在测试发酵温度对共接种的两个选育菌株的生长速率 和竞争能力的影响的实验中检查了这种方法的实际适用性。2. 材料与方法2.1 酵母

9、菌株和培养基酿酒酵母菌株采购于酿酒酵母生产商。 酿酒酵母菌株见表 1。酵母菌模式菌株 (CBS1171) 从 CRA-Istituto Sperimentale per l Enologia of Asti, Italy (ISE)的收集品中获得。商用干菌株悬浮于无菌 5%的蔗糖液体培养基中， 40 摄氏度下放置 30 分钟，稀释，然后 涂布于YMA平板(10g/L葡萄糖,5g/L蛋白胨,3g/L酵母浸出物,3g /L 麦芽膏和20g/ L琼 脂), 然后在 24摄氏度下培养 48 小时。2.2 DNA 抽提在第一步检验这种方法的鉴别能力时，我们用 Harju等人(2004)的方法抽提DNA简

10、 单的说，将单个菌落重悬浮于 200ml 的 lysis buffer(2% (w/v) TritonX-100, 1%(w/v) SDS, 100 mmol L_1 NaCI, 10 mmol LjITris - HCl pH 8.0, 1 mmol L_1 EDTA pH 8.0) 中。这些试 管放置于 -80 度冰箱中 3 分钟(直到完全冻住) ，然后在 95 摄氏度下于 Thermomixe(r Eppendorf AG, Hamburg, Germa ny)中放置一分钟(不要振荡)使它们快速溶化。重复上述过程，然后 以最大速度旋转试管 30秒。向试管中加入 200ml 氯仿冰浴，然后

11、振荡试管 2 分钟， 20， 000g ， 5 摄氏度的条件下离心 5 分钟。取上清液与另一试管中加入 400ml 冰的纯乙醇， 20 摄氏度下 静置沉淀10分钟，然后在20, 000g ,5摄氏度下离心10分钟。去上清，DNA沉淀用0.5mL 70% (v/v)乙醇纯化，45摄氏度下真空干燥。得到的 DNA溶于15mlTE (10 mmolL_1 Tris, 1 mmol L_1 EDTA, pH 8.0) 。第二步检验该方法适用性的过程中，用微量加样吸头直接从单菌落中提 取菌体直接悬浮于事先加好PCR昆合物的0.2ml孔中。2.3 .PCR 与电泳三个微卫星位点，SC8132X,YOR26

12、7和SCPTSY被使用是由于他们具有高度的多态性。扩 增是依赖于几对特异性的顺式与反式的引物进行的(见表二)SC8132X位点的引物与YOR267C位点的顺式引物是由 Field 和 Wills 所设计的，YOR267C位点的反式引物是由 Gonzalez Techera et al 制作的，而SCPTSY位点的顺式引物是由 Perez et al 制作的。SCPTS丫位点 的反式引物是由我们使用免费软件 Primer 3所设计的，目的是使其产生几个电泳带具有明显 位置区别的扩增子而不与其他两个位点重叠。PCF扩增是进行在一个具有20微升体积液体的Biorad MyCycler热力周期仪中。2

13、0微升 液体是有以下部分组成的：1微升DNA的萃取溶液(包含20-40ng DNA), 3.1mmol/L浓度的 MgC2，0.4mmol/L浓度的各种dNTP,2微升去镁的PCR缓冲液，2个单位Taq DNA聚合酶， SCYOR267位点引物各10pmol, SC8132X位点引物各15pmol以及SCPTSY7位点的引物各 40pmol。PCR反应组分各成分的浓度被设计得尽量减小非特异性扩增。在发酵实验中，反应 体系的体积为10微升，试剂组分与所占比例与上述反应体系相同，这样做可以节省Taq聚合酶与其他昂贵的试剂。为了优化对三个位点的多元化扩增，方案如下：94C保持4分钟，以a.94 C保

14、持30秒;b.56 C保持45秒;c.72 C保持30秒为一个周期，重复28个周期，最后以 72C保持10分钟处理。将产物在尺寸为15*10cmf浓度为2.5% (w/v)的琼脂糖凝胶上，浸于 TBE缓冲液中，在 100V 条件下电泳 80 分钟，凝胶将被溴化乙錠所染色。当使用聚丙烯酰胺凝胶电泳时，应使 用预制的8.6*6.8cm 210%(w/v)的TBE凝胶，在100V条件下电泳60分钟。Marker应使用标记 分子量为100-20bp的Sigma低阶marker。电泳分布情况被集群分析软件处理， 该软件使用一种类似于二进制的指标， 它使用 UPGMA 的方式创建系统树图。 同表象相关性将

15、被用于探知由 Rossetti 和 Giraffa 描述的确定的与非 确定的聚类。同表项相关性的百分比在各个分支中给出。2.4. 该方法的可重复性与微卫星标记的稳定性通过对每个菌株取五份菌落 DNA萃取液进行扩增来检测可重复性，对扩增产物的分析是 将其分为五个不同孔道进行琼脂糖电泳而进行的。为了检验微卫星标记在酒精发酵中的稳定性，检验是在随意挑选的三个菌株中进行的： 菌株 2，菌株 3 和菌株 5。再水化后，每个菌株被单独接种在盛有灭菌葡萄汁的500ml 烧瓶中。在16C的条件下发酵20天表二 用于扩增的三株啤酒酵母微卫星位点引物分析在十组随意选出的菌落中进行，这些菌落取自发酵开始时和结束时的

16、每个菌株。2.5. 发酵两株酵母菌株，DSMCepageChardonnay和Vitilevure DV10被选中进行发酵试验，因为 他们具有相似的用途与特征（用于白葡萄发酵，醇耐受性和表型杀伤性相似） ，就像制造者说 的一样。 Vitilevure DV10 是耐冷的。灭菌的葡萄汁被用于培养基。它包含浓度均为150mg/L的硫酸铵和磷酸铵作为发酵氮源。 浓度为 200g/L 的蔗糖被加入作为糖源。发酵开始时将 1.6L 灭菌的葡萄汁加入到容积为 2L 的带有磁力搅拌器的锥形烧瓶中。这 个仪器以一个有孔的橡皮塞封口，有一根以棉线固定的巴斯德吸管插在孔中。以单菌株涂平板，再挑出单菌落以多元的PC

17、R分析方法检测它们的同一性。然后将相同的菌落悬浮培养于预配的培养基中， 该培养基由灭菌的葡萄汁组成， 可以提供氮源但无糖源。在20C下进行每分钟震动100次的好氧生长后，形成混合的接种物，每个菌株都具有均 一的浓度， 为 5*105个细胞 /L 。由浓度为 1*106个细胞 /L 的单菌株形成的接种物用来检测每种 菌株完成发酵的能力。发酵温度被控制在 15-20 C之间，并且设有条件相同的对照组。样本被取于每个菌株发酵过程中的的相同时间，这几个时间点分别为：发酵开始时（接 种后的十分钟），葡萄汁中残余 60%糖分时，葡萄汁中残余 30%糖分时以及发酵结束时 （2g/L） 发酵过程中糖分浓度是由

18、高性能液体色谱检测的，使用一根OAK（聚乙烯圆柱棒与一个折光指 数检测器。将样品稀释并涂布于 YMA平板培养基上。在25 C下培养48小时后，将含有菌落数为 150-200的菌落随机挑选进行PCR分析。在每个时间点，每个菌落分析 48-60个菌落。总共 900 个菌落被检测。3. 结果3.1 酵母菌菌株分类图.1 为琼脂糖凝胶电泳结果。对于每一菌株，除了最明显的一条电泳带外，还观察到好几 条模糊的带，可能是因为非特异性扩增。将单一引物扩增的带形图和多引物扩增带形图比较 发现 19和 30（菌株）的电泳图中有大量的这些带。图2中，这些微弱的带同样出现在由单一引物进行扩增的带形图中，说明不是由 3

19、 个位点的引物的交互作用引起的，尽管这些带是 可复制的，但是它们并不被认为有基因多态性价值。各片断在数量和大小上的差异已被发现。对于1、 3、4、6、8、10、11、15、20、24 和25 这些菌株，仅有 3 条比较明显的带出现，然而大部分菌株显示，电泳图中每个位点出现 3 到 9 条带而不是 1 到 3 条带。带形图的电脑分析显示，在所有的菌株里面， 3与 7、18与 29、8与 20、14与 16有80% 以上相似，仅在带宽上有很小的差异，同时 2与 9、4与 11菌有 100%的相似度。所有有 80% 以上相似度的组群导致可靠的100%C表象相关。为了核实这些结果，将PCRI到的产物的10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果和琼脂糖凝胶电泳结果进行比较（图 .4）。电泳结果（图 .4b ）显示： 1