云南独蒜兰组培快繁技术研究

1、word 云南独蒜兰组培快繁技术研究 摘 要：目的：通过研究云南独蒜兰种子萌发、小苗 增殖和生根的适宜培养基，建立一套独蒜兰组织培养的快速 繁殖体系。方法：以独蒜兰种子为外植体，研究激素 6-benzylaminopurine 和 1-naphthlcetic acid ) 不同质量浓度 配比对云南独蒜兰小苗增殖和壮苗生根的影响。结果：云南 独蒜兰小苗增殖最适培养基为 1/2MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L ，壮苗与生根最适培养基 为 1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.3mg/L 。结论：建立了一套 云南独蒜兰组培快繁体系，可用于大规模生产云南独蒜兰组 培苗。 关

2、键词：云南独蒜兰；种子；组培快繁 中图分类 S63 文献标识码 A 文章编号 1007-7731 2018)01-0010-03 Abstract ： Objective To explore suitable culture mediums for the seed germination ， seedling multiplication ， rooting and growth of plantlet in Pleione yunnanensis ，in order to establish a tissue culture and rapid propagation system.Me

3、thods Seeds of Pleione yunnanens is were used as the explants， and the effects of different mediums on proliferation ， rooting and seedling. Results The most suitable culture medium for proliferation was 1/2MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L ，The most suitable culture medium for rooting and seedling was 1/2M

4、S+NAA2.0mg/L+6-BA0.3mg/L。Conclusion This research established a tissue culture and rapid propagation system，which could be used for the large scale production of Pleione yunnanensis. Key words ：Pleione yunnanensis；Seed；Tissue culture and rapid propagation 云南？蒜兰Pleione yunnanensis ( Rolfe) Rolfe,兰科 独

5、蒜兰属的一种半附生兰，国内主要产于四川、贵州和云南 1 ，假鳞茎为中药山慈菇的主要来源之一。 云南独蒜兰为 中 国药典收载品种，具有清热解毒、止咳化痰，止血生肌。 主治肺结核，百日咳，气管炎，痈肿，消化道出血，外伤出 血等 2 。近年来，由于其含有的秋水仙碱具有抗肿瘤的活性， 独蒜兰市场需求量不断增加。但其种子小，自然状态下很难 成功萌发及生长，加之野生资源破坏严重，所以通过组织培 养是获得大量完整再生植株的重要技术手段，亦是缓解资源 环境压力的主要途径。近年来有少量关于独蒜兰组织培养方 面的报道，如陈之林等人对白花独蒜兰进行了组培快繁研 究，以种子和原球茎为外植体成功获得了组培苗3 ；张燕等

6、 人认为，在独蒜兰组培快繁研究中，以种子为外植体生产组 培苗是最好的方法 4 。本文就云南独蒜兰组培快繁体系进行 了研究，为建立和完善云南独蒜兰的人工繁育技术提供科学 依据。 1 材料与方法 1.1 实验材料 外植体： 以云南独蒜兰成熟且未开裂的蒴 果为外植体，采自云南省文山市。 1.2 实验方法 1.2.1 外植体消毒 用适量洗洁剂先洗涤蒴果 6min ，然后 用无菌水冲净洗洁精，在超净工作台上将洗涤后的蒴果用 75%的酒精表面消毒处理 2min，再用0.1%的升汞（HgCI2 ） 消毒 15min ，用无菌水冲洗 6 次，用无菌滤纸吸干蒴果表面 的水分。 1.2.2 无菌播种 超净工作台上

7、用消毒后的手术刀将消 毒处理过的蒴果两端切除，纵向剖开蒴果，将种子播于培养 基上，轻轻晃动培养瓶使种子均匀散布。完成接种后将其置 于培养室培养，诱导种子萌发阶段避光培养，温度为 25C, 待种子萌发出原始球茎后采用光照培养，温度为25C,光照 时间12h/d，光照强度1200IX。此阶段培养基为：1/2MS+NAA （1.0mg/L ） + 炭粉（1g/L） + 蔗糖（30g/L） + 琼脂（6g/L）, pH=5.8。 1.2.3 原球茎增殖 在播种 40d 后极少数原球茎开始分化 出叶，同时原球茎继续增殖， 形成苗和原球茎混杂的块状物。 此时的原球茎经过继代培养，有利于原球茎的增殖，生长速

8、 度加快。本阶段采用光照培养，温度25C，光照时间12h/d , 光照强度 1200lx 。此阶段以 1/2MS+6-BA （1.5mg/L ）+NAA （0.5mg/L ） + 炭粉（1g/L） + 蔗糖（30g/L） + 琼脂（6g/L）, pH=5.8 为原球茎继代培养、增殖的培养基。 1.2.4 叶芽诱导、丛芽增殖 原球茎经增殖培养 20d 后大 部分原球茎都能长出第 1 片叶芽，但丛生芽数量相对较少， 叶片弱小，此时，需对继代增殖原球茎进行叶芽诱导、丛芽 增殖，选用已经设计好的不同激素种类和浓度的培养基进行 培养，选择大小适合的原球茎用于接种。采用光照培养，温 度为25 C，光照时间

9、12h/d，光照强度1200IX。经培养40d 后，统计丛生芽的数目。 此阶段以 1/2MS+6-BA （变量） +NAA （变量）+ 炭粉（1g/L） + 蔗糖（30g/L ） + 琼脂（6g/L）, pH=5.8 为原球茎继代培养、增殖的培养基。 1.2.5 生根壮苗培养 选取经叶芽诱导、丛芽增殖的小苗 用于生根壮苗培养研究，设计不同激素种类和浓度进行培 养，所选材料要求大小和长度，生长状况一致的小苗。完成 接种后将材料移至培养室中，采用光照培养，温度为25 C, 光照时间12h/d，光照强度1200IX。 2 结果与分析 2.1 诱导种子无菌萌发阶段 种子在播于培养基后约 24d 开始萌

10、发，出现白色类原球茎，然后转至光照培养，白色原 球茎逐渐形成黄绿色的原球茎，出现绿色点芽点。原球茎逐 渐长大，颜色转绿，在播种 40d 后极少数开始分化出叶，同 时原球茎继续增殖，形成苗和原球茎混杂的块状物。 2.2 叶芽诱导、 丛芽增殖阶段 此阶段设计不同激素种类 和浓度进行培养。原球茎经过叶芽诱导、丛芽增殖培养 30d 后，丛芽数目开始增多，多数芽也长成接种前 1 4cm 不等 的小苗，而且基部开始膨大，直径大多达12mm。此时进 行观察和测量，统计诱导叶芽数目如表 1。 对原球茎进行芽诱导是组培中的重要环节，提高叶芽诱 导率和丛芽增殖，为获得大量的组培苗奠定基础。为能反应 出各处理对独蒜

11、兰原球茎的叶芽诱导、丛芽增殖影响作用的 差异，从中选取到最佳激素组合，所以对表 1 结果进一步作 方差分析，见表 2。 表 2 中可以看出， NAA 的 P=0.0190.05 ，表明：在 ?范围 浓度下的 NAA 和 6-BA 组合对处理对独蒜兰原球茎的叶芽诱 导、丛芽增殖影响作用实验中，对叶芽诱导、丛芽增殖影响 的主效应是 NAA ，而 6-BA 的影响不显著。在 6 号处理组 丛芽增殖效果最好。 NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L 中的平均出芽数最多， 叶芽诱导、 2.3 生根壮苗培养阶段 此阶段设计不同激素种类和浓 度进行培养。 50d 观察不同处理组，叶片较接种前增长，茎

12、的基部膨大明显，膨大的基部下面长出14条根。此时进 行观察和测量， 统计生根数目、 根长， 球茎大小及叶片长度， word 见表 3。 在组培 中，生根率是重要的指标，为能反应出各处理对 云南独蒜兰组培苗生根情况影响作用的差异，从中选取到最 佳激素组合，所以对表 3 结果进一步作方差分析，见表 表中 4 可以看出， NAA 的 P=0.0020.05， 6-BA 的 P=0.007v0.05，表明：在该范围浓度下的NAA和6-BA组合 对处理对云南独蒜兰组培苗生根率影响作用实验中，不同浓 度 NAA 和 6-BA 组合对组培苗的生根率影响均达到了显著水 平。在 9 号处理组 NAA2.0mg/

13、L+6-BA0.3mg/L 的平均生根率 最高，平均根长度也最长 ，生根效果相对较好。 3 结论 本实验选取云南独蒜兰经授粉、成熟且未开裂的蒴果内 的种子为外植体，诱导种子萌发产生原球茎。在此基础上， 对原球茎进行增殖、扩繁，获得后续实验中所需的愈伤组织 和不定芽。丛生芽诱导阶段，以 1/2 MS 为基础培养基，处 理组(1/2 MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L )的平均出芽数最 多，对叶芽诱导、 丛芽增殖效果最好。 生根壮苗阶段， 以 1/2 MS 为基础培养基，处理组( 1/2 MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.3mg/L )的平均生根率最高，平均 根长度也最长，生