第5章发酵菌种的制备

1、发酵工程发酵工程 2/jing/c76/zcr-1.htm 南阳师范学院南阳师范学院 生命科学与技术学院生命科学与技术学院 发酵工程发酵工程 第一章第一章 发酵工程总论发酵工程总论 第二章第二章 发酵设备发酵设备 第三章第三章 发酵工业原料及其处理发酵工业原料及其处理 第四章第四章 发酵工业灭菌发酵工业灭菌 第五章第五章 发酵菌种的制备发酵菌种的制备 第六章第六章 发酵工业放大发酵工业放大 第第七七章章 微生物发酵机制微生物发酵机制 第八章第八章 发酵动力学发酵动力学 第第九九章章 发酵过程工艺控制发酵过程工艺控制 第第十十章章 发酵染菌及防治发酵染菌及防治

2、 第第十一十一章章 发酵工业废物、废水处理和资源化技术发酵工业废物、废水处理和资源化技术 第十二章第十二章 展望展望 发酵工程发酵工程 1 1 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育 2 2 工业微生物种子的扩大培养工业微生物种子的扩大培养 3 3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备 第五章第五章 发酵菌种的制备发酵菌种的制备 2/jing/c76/zcr-1.htm 发酵工程发酵工程 1.1 工业微生物的特点工业微生物的特点 1.2 发酵工业对菌种的要求发酵工业对菌种的要求 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种 1.4 工业

3、微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏 1 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育 第五章第五章 发酵菌种的制备发酵菌种的制备 1.1 1.1 工业微生物的特点工业微生物的特点 1 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育 一个现代化的发酵工业必须具有一个现代化的发酵工业必须具有优良的菌种优良的菌种、 合适的工艺和先进的设备合适的工艺和先进的设备、严格的检测与控制严格的检测与控制，其，其 中中菌种菌种是主体是主体,其他则是为了充分发挥菌种的优良其他则是为了充分发挥菌种的优良 性能而考虑和设计

4、的。性能而考虑和设计的。 能用于发酵生产的微生物即为能用于发酵生产的微生物即为工业微生物，它工业微生物，它 们具有个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能们具有个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能 力强、易变异改造力强、易变异改造等特点。等特点。 1.2 1.2 发酵工业对菌种的要求发酵工业对菌种的要求 1) 能在能在廉价原料制成的培养基上廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，且迅速生长，并生成所需要的代谢产物，且 产量高；产量高； 2）培养条件）培养条件易于控制易于控制； 3）生长速度快，）生长速度快，发酵周期短发酵周期短； 4）满足代谢控制的要求；）满足代谢控制的要求；

5、5）抗噬菌体和杂菌的能力强；）抗噬菌体和杂菌的能力强； 6）遗传性状稳定，菌种不易变异退化；）遗传性状稳定，菌种不易变异退化； 7）在发酵过程中产生的气泡要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、）在发酵过程中产生的气泡要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、 降低成本有重要意义；降低成本有重要意义； 8）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳 源利用；源利用； 9）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生 物活性物质和毒素，以保证安全

6、。物活性物质和毒素，以保证安全。 地球上的微生物资源非常丰富，地球上的微生物资源非常丰富， 目前已发现的仅占其总数的目前已发现的仅占其总数的1%5%， 而在工业生产中被利用的仅有而在工业生产中被利用的仅有数百种数百种， 分属于分属于细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、 担子菌、藻类担子菌、藻类。 1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种 发酵工程发酵工程 放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等） 真菌（青霉素、头孢等） 一些产芽孢的细菌 植物或动物来源 一、抗生素生产有关的微生物一、抗生素生产有关的微生物 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，

7、抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：目前发现的生物来源如下： 已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍 1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种 二、氨基酸生产有关的微生物二、氨基酸生产有关的微生物 代谢控制发酵代谢控制发酵：用用人工诱变的方法人工诱变的方法，有意识地改变微生，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。 2020世纪世纪50-6050-6

8、0年代以氨基酸发酵为代表的年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发代谢控制发 酵酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：，是发酵工业发展历史上的一个转折点： 1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种 已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍 hd:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶 黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸和异亮氨酸 的合成调节机制的合成调节机制 ht:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶 ak:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶 1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种 二、氨基酸生产有关的微生物二、氨基酸生产

9、有关的微生物 氨基酸生产菌的要求氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，简单代谢途径比较清楚，简单 谷氨酸发酵的菌种谷氨酸发酵的菌种： 其他氨基酸生产菌：其他氨基酸生产菌： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌杆菌属的棒型细菌 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌草芽孢杆菌 1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种 二、氨基酸生产有关的微生物二、氨基酸生产有关的微生物 三、食品酶制剂生产有关的微生物三、食品酶制剂生产有关的微生物

10、开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 关于食品用酶，美国需要得到关于食品用酶，美国需要得到fdafda的批准。目前已同意的批准。目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆 菌和地衣牙孢杆菌菌和地衣牙孢杆菌 1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种 l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍 三、常用的基因表达系统 ( (一一) )原核生物原核生物：大肠杆菌大肠杆菌(1977(1

11、977年年boyer)boyer)、枯草牙胞杆菌、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌沙门氏菌 q 生长迅速、蛋白产量高生长迅速、蛋白产量高; ; q 表达蛋白的纯化、分离及分析快速；表达蛋白的纯化、分离及分析快速； q 外源基因的导入相对容易；外源基因的导入相对容易； q 已建立了整套表达理论及技术。已建立了整套表达理论及技术。 l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍 1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种 ( (二二) ) 真核细胞表达系统真核细胞表达系统 酵母酵母( (既是微生物又是真核细胞既是微生物又是真核细胞) ) l 生长迅速，营养要求不高，易培养；生长迅速

12、，营养要求不高，易培养； l 安全性好；安全性好； l 比哺乳动物细胞操作简单；比哺乳动物细胞操作简单； l 具有一定的修饰蛋白的能力。具有一定的修饰蛋白的能力。 1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种 l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍 中国仓鼠卵巢细胞（中国仓鼠卵巢细胞（chocho细胞）表达系统细胞）表达系统 q 具有准确的转录后修饰功能；具有准确的转录后修饰功能； q 具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； q 具有重组基因的高效扩增和表达能力；具有重组基因的高效扩增和表达能力； q 具有贴壁生

13、长特性，也可进行悬浮生长；具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； q cho很少分泌自身的内源蛋白。很少分泌自身的内源蛋白。 1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种 l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍 微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。物才具有大量表达的潜力。 问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？生产抗生素的微生物能不能用于

14、生产氨基酸？ 礼来礼来(eli lilly(eli lilly),),花了花了1010年的时间从年的时间从4040万株微万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。 例： 1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种 l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍 一、菌种分离的一般过程一、菌种分离的一般过程 样品采集样品采集预处理预处理 增殖增殖培养培养 纯培养纯培养 菌种的鉴定菌种的鉴定 问题：问题：如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现

15、 目的目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物 1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离 生产性能测定生产性能测定 复合酶系复合酶系 复合菌系复合菌系 二、采样时要注意的问题二、采样时要注意的问题 l 气候、水分、空气气候、水分、空气 l 来源要广来源要广 l 结合产品的特点结合产品的特点 l 标签：地点、时间、气候等标签：地点、时间、气候等 1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离 富集的三种方案： l 定向培养定向培养: :采用特定的有利于目的微生物富集的采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。条件，进行培养。 三

16、、目的微生物富集的一些基本方法三、目的微生物富集的一些基本方法 富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。得可能。 l 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，类学中考虑， l 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法时只能通过随机分离的办法 1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离 定向培养的方法定向培养的方法 物理方法：加热、膜过滤等，物理方法：加热、膜过滤等， 但主要是通过培养的方法但主要是通过培养的方法

17、 1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离 三、目的微生物富集的一些基本方法三、目的微生物富集的一些基本方法 2/jing/c76/zcr-1.htm 定向培养的富集方法定向培养的富集方法 1 1、底物、底物 2 2、phph条件条件 3 3、培养时间、培养时间4 4、培养温度、培养温度 等一切能提高目的微生物相对生长速度等一切能提高目的微生物相对生长速度 的手段，培养（固体、液体；分批、连的手段，培养（固体、液体；分批、连 续）后使目的微生物在种群中占优势。续）后使目的微生物在种群中占优势。 三、目的微生物富集的一些基本方法三、目的微生物富

18、集的一些基本方法 四、菌落的选出四、菌落的选出 q 从产物角度出发从产物角度出发 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素 q 从形态的角度从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖 产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别。上就可以初步识别。 1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离 实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选实例：碱性纤维素酶

19、产生菌的筛选 采样（造纸厂）采样（造纸厂） 80 30 min处理处理 文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌 0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%cmc（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），ph10.5 培养培养34 d，选择有，选择有凹陷圈凹陷圈的菌落的菌落 从从285个土样中获得个土样中获得62株株 26株为组成型株为组成型 36株为诱导型株为诱导型 1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离 实例：醛肟水解酶的筛选实例：醛肟水解酶的筛选 -journal of biotechnology 94(2002),

20、65-72 培养基中含培养基中含0.05% of z-paox 每隔每隔23 d移去一半培养物，补充新鲜培养基移去一半培养物，补充新鲜培养基 不断分析样品，不断分析样品，2-3个月后个月后z-paox降低后，稀释分离菌落降低后，稀释分离菌落 1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离 五、目的微生物富集方法的研究进展五、目的微生物富集方法的研究进展 q 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16srna同同 源性分析，基因序列分析及源性分析，基

21、因序列分析及dna/dna杂交技术等杂交技术等 q 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%，微生物的微生物的 多样性及资源的开发多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。仍然是今后若干年的研究重点。 陈文新（科学院院士）陈文新（科学院院士） ， 2002 q in contrast to this traditional approach, modern molecular biology techniques allow for dna library expression screening, which also enables access t

22、o enzymes of nonculturable organisms. by this strategy, for instance, the company diversa (san diego, ca, usa) identised 120 unique esterases/lipases from only 16% of the total dna obtained from an alkaline soil sample. fems microbiology reviews 26 (2002) 7381 1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离 目的 l 提高生产能

23、力提高生产能力 l 提高产品质量提高产品质量 l 开发新产品开发新产品 l 解决生产实际问题解决生产实际问题 l 防止菌种退化防止菌种退化 1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育 方法 基因突变： 自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种 基因重组： 杂交、原生质体融合、基因工程杂交、原生质体融合、基因工程 基因的直接进化：点突变、易位点突变、易位pcr、同序法、同序法 dna shuffling等等 1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育 自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9。 自然突变有两种情况自然突变有两种情

24、况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰 退和生产质量的下降，这种突变成为负突变退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。变成为正突变。 一、自然选育一、自然选育 1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育 自然选育在工业生产上的意义自然选育在工业生产上的意义 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。重要措施。 回复突变回复突变：高产菌株在传代的过程

25、中，由于自然突变导致：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变突变 问题：问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育 自然选育操作步骤：自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞单细胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备 平板分离平板分离 挑选单菌落挑选单菌落 发酵试验发酵试验 1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育 注意形态

26、的观察注意形态的观察 选择性培养法选择性培养法 随机分离法随机分离法 平板划线法平板划线法 平板稀释法平板稀释法 二、诱变育种二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选， 称为称为诱变育种。诱变育种。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂 （p103） 诱变剂诱变剂 物理：紫外，快中子，射线，激光物理：紫外，快中子，射线，激光 化学：硫酸二乙酯（化学：硫酸二乙酯（des），亚硝基胍（），亚硝基胍（ntg） 生物：噬菌体，转座子生物：噬菌体，转座子 1.5 1.5 发酵高

27、产菌种的选育发酵高产菌种的选育 （二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性化学诱变剂使用过程的安全性 诱变剂量的选择诱变剂量的选择 诱变剂的选择诱变剂的选择 出发菌株的选择出发菌株的选择 （一）、诱变育种的原理（一）、诱变育种的原理 诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染 色体畸变和基因突变两大类。色体畸变和基因突变两大类。 压硝酸：压硝酸：0.07mna0.07mna2 2hpohpo4 4 亚硝基胍亚硝基胍：1mnaoh1mnaoh 二、诱变育种二、诱变育种 （三）、诱变育种的一

28、般步骤（三）、诱变育种的一般步骤 （p103） 二、诱变育种二、诱变育种 诱变育种一般包括诱变育种一般包括诱变和筛选诱变和筛选两个部分。两个部分。 诱变诱变部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱 变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。 筛选筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能 力。力。 诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到 达到达到高产菌株高产菌株。 （三）、诱变育种的一般步骤（三）、诱变育种的一般步骤 二、诱变育种二、诱变育种 出

29、发菌株的选择出发菌株的选择 制备菌悬液制备菌悬液 诱变处理诱变处理 突变菌株的筛选突变菌株的筛选 营养缺陷型突变菌株的筛选营养缺陷型突变菌株的筛选 抗反馈阻碍和抗反馈抑制突变菌株抗反馈阻碍和抗反馈抑制突变菌株 的筛选的筛选 组成型突变株的筛选组成型突变株的筛选 抗性突变株的筛选抗性突变株的筛选 自然界直接分离到的野生型菌株自然界直接分离到的野生型菌株 经历过生产条件考验的菌株经历过生产条件考验的菌株 已经历多次育种处理的菌株已经历多次育种处理的菌株 随随 机机 筛筛 选选 形形 态态 理理 化化 性性 质质 hd:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶 黄色短杆菌中赖氨酸黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制

30、的合成调节机制 ht:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶 ak:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶 结构类似物抗性结构类似物抗性：lys的类似物的类似物aec, thr的类似物的类似物ahv 营养缺陷型营养缺陷型：如如thr缺陷型缺陷型 黄色短杆菌黄色短杆菌f9-50的诱变谱系的诱变谱系 bervibacterium flavum as 1.495 (leu-) lys.hcl 2.1 g/l f6-16 (leu -, thr -) 20.8 g/l f9-50 (leu -, thr -, aec r) 33.5 g/l 三、基因的直接进化三、基因的直接进化(directed evolution) q

31、 突变 基因突变库的建立基因突变库的建立 q 筛选 基因突变库的筛选基因突变库的筛选 q 基因复制与遗传 步骤：步骤： 在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过 高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。 1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育 主要应用：主要应用： 酶活性能的提高酶活性能的提高: 生理环境生理环境工业催化环境工业催化环境 l ph l 温度温度 l 有机溶剂有机溶剂 l 底物专一性底物专一性 脂酶拆分脂酶拆分2-2-甲基癸酸硝基苯酯甲基癸酸硝基苯酯 例：例： pla plapla光学拆

32、分选择性光学拆分选择性(%)(%) 2 31 57 75 81 90 5 5次错位次错位pcr 2pcr 2次定点突变次定点突变 reetzreetz (1997) liebeton(2000) (1997) liebeton(2000) 定点突变定点突变 错位错位pcr dna改组改组(dna shuffling): 指指dna分子的体外重排，是基分子的体外重排，是基 因在分子水平上进行有性重组因在分子水平上进行有性重组(sexual recombination)。 dna改组技术改组技术(1994)的发明人的发明人stemmer博士，他以博士，他以5项美国专利为项美国专利为 技术支撑点，于

33、技术支撑点，于1997年创立了专门从事年创立了专门从事dna改组研究的公司改组研究的公司 maxygen。公司刚刚建立，世界上几家最大的公司纷纷与之洽谈。公司刚刚建立，世界上几家最大的公司纷纷与之洽谈 并建立了合作关系。这些公司包括最大的农业公司并建立了合作关系。这些公司包括最大的农业公司 dupont公司、公司、 生产抗生素的世界巨头生产抗生素的世界巨头 dsm公司和工业酶研究生产之最的公司和工业酶研究生产之最的novo nordisk公司。此外，迄今为止，公司。此外，迄今为止，maxygen公司还得到了来自美国公司还得到了来自美国 国防高级研究计划局国防高级研究计划局(darpa)和国家科

34、学技术协会和国家科学技术协会(nist)的的5项项 资助，共计资助，共计2100万美元。从另一角度反映了万美元。从另一角度反映了dna改组的重要性及改组的重要性及 美国政府及商家对美国政府及商家对dna改组技术的重视程度。改组技术的重视程度。 图图1有性有性pcr法改组法改组dna的基本程序的基本程序 dna shuffling 图图2交错延伸法改组交错延伸法改组dna的基本程序的基本程序 dna shuffling x xxx x xx x xx x xxx x xx x x xxx xx x x xx x xxx x x xxx xx x x xx x xxx x xx x xx x xx

35、 xxx x x x x x xx x fragment reassemble select best with dnasei fragments recombinants repeat for multiple cycles dna shuffling 发酵工程发酵工程 项目进化速度进化对象 进化 周期 影响对象突变效率 常规定向 进化 缓慢进化整个基因组多年完整基因组低 dna shuffling 快速进化 特定基因/ 操纵子/病毒 几天部分基因组高 dna shufflingdna shuffling与常规定向进化的比较与常规定向进化的比较 发酵工程发酵工程 类 型示 例特 性活性增加倍

36、数 潜在应用领域 抗 体人源抗体亲和性400生物制药 酶天冬氨酸转氨酶催化特异性10，000生物制药 -内酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素 枯草杆菌蛋白酶e 耐热性 65耐热时间 17 200 工业酶 细胞 因子 人类干扰素抗病毒285，000基因治疗 肿瘤抑制因子p5337半衰期12基因治疗 代谢 途径 砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒40生物制药 汞代谢途径汞解毒12生物制药 部分dna shuffling技术的研究成果 dna改组改组(dna shuffling)技术的应用领域技术的应用领域 分类分类用途用途 进化进化dna转基因；疫苗载体；转基因；疫苗载体；dna疫苗；表达载疫苗；表达载 体

37、；基因转移载体体；基因转移载体 进化蛋白进化蛋白基因治疗用酶；细胞因子；生长因子；基因治疗用酶；细胞因子；生长因子； 抗体；工业酶抗体；工业酶 进化生物体进化生物体 植物；科研用生物体；化学及药物加工；植物；科研用生物体；化学及药物加工； 疫苗有机体；石油加工；除污生物疫苗有机体；石油加工；除污生物 1）菌种的退化及原因）菌种的退化及原因 菌种退化：菌种退化：指在较长时期传代保指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个藏后，菌株的一个或多个 生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。 常见的菌种衷退在形态上表现为常见的菌种衷退在形态上表现为分生孢子的减少或菌

38、分生孢子的减少或菌 落颜色的改变落颜色的改变，与由于环境条件变化而引起菌落形态和生，与由于环境条件变化而引起菌落形态和生 理上的变异是不同的理上的变异是不同的 。 1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏 菌种菌种退化的原因：退化的原因：基因突变、变异菌株性状分离、其他因基因突变、变异菌株性状分离、其他因 素（温度、湿度、培养基成分及各种培养条件）素（温度、湿度、培养基成分及各种培养条件） 1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏 狭义的菌种复壮狭义的菌种复壮指在菌种已发生衰退的情况下，指在菌种已发生衰退的情况下， 通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的通过纯种分离和测定生

39、产性能等方法，从衰退的 群体中找出少数尚未衰退的个体，从而达到恢复群体中找出少数尚未衰退的个体，从而达到恢复 该菌原有典型性状的目的。该菌原有典型性状的目的。 广义的菌种复壮广义的菌种复壮指在菌种的生产性能尚未衰退指在菌种的生产性能尚未衰退 前，就经常有意识地进行纯种分离和生产性能测前，就经常有意识地进行纯种分离和生产性能测 定工作，从而逐步提高菌种的生产特性。定工作，从而逐步提高菌种的生产特性。 2）菌种的复壮）菌种的复壮 一、退化菌种的复壮一、退化菌种的复壮 1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏 常用的方法是对已退化菌株用一定培养条件进常用的方法是对已退化菌株用一定培养条件进

40、行单细胞行单细胞分离纯化分离纯化，从而限制退化菌株在数量上占，从而限制退化菌株在数量上占 优势，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得以复壮。优势，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得以复壮。 纯种分离的方法常用的有三种：稀释分离法、纯种分离的方法常用的有三种：稀释分离法、 平板划线法和组织分离法（用于高等真菌）。平板划线法和组织分离法（用于高等真菌）。 2）菌种的复壮）菌种的复壮 1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏 二、通过寄生进行复壮二、通过寄生进行复壮 寄生型微生物的退化可接种到相应寄生体内寄生型微生物的退化可接种到相应寄生体内 以提高菌株的活力。以提高菌株的活力。 三、联合复壮三、联合

41、复壮 对退化菌株还可用剂量的紫外线辐射和低剂对退化菌株还可用剂量的紫外线辐射和低剂 量的亚硝基胍（量的亚硝基胍（ntc）联合处理进行复壮。）联合处理进行复壮。 2）菌种的复壮）菌种的复壮 3）防止菌种退化的措施）防止菌种退化的措施 合理的育种合理的育种 选用合适的培养基选用合适的培养基 创造良好的培养条件创造良好的培养条件 控制传代次数控制传代次数 利用不同类型的细胞进行移种传代利用不同类型的细胞进行移种传代 选择有效的保选择有效的保藏方法藏方法 1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏 4）菌种）菌种保藏保藏 菌种菌种保藏的意义保藏的意义：是进行微生物学研究和微生物育种工作是进行微生

42、物学研究和微生物育种工作 的重要组成部分。其任务首先是菌种不死亡，同时还要尽可的重要组成部分。其任务首先是菌种不死亡，同时还要尽可 能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。 1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏 菌种保藏菌种保藏的原理：的原理：根据菌种的生理生化特点，采用低温、根据菌种的生理生化特点，采用低温、 干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸中中和剂等方法，干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸中中和剂等方法， 使使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。使使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。

43、 4）菌种）菌种保藏保藏 1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏 蒸馏水悬浮法蒸馏水悬浮法 斜面低温保斜面低温保藏藏 石蜡油封保藏石蜡油封保藏 菌种菌种保藏的方法保藏的方法 砂土管保藏砂土管保藏 冷冻保藏冷冻保藏 真空冻干保藏真空冻干保藏 寄主保藏寄主保藏（病毒、立克次氏体、螺旋体等不能人工培养）（病毒、立克次氏体、螺旋体等不能人工培养） 基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏 普通冷冻冷冻保藏技术普通冷冻冷冻保藏技术 超低温冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术 液氮冷冻保藏技术液氮冷冻保藏技术 小小 结结 涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有 特

44、定的微生物特定的微生物( (动、植物动、植物) )才具有大量表达的潜力；才具有大量表达的潜力； 传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是 自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证； 目前土壤中已分离的微生物不到总数的目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%1%，微生，微生 物的多样性仍然是以后若干年的研究重点物的多样性仍然是以后若干年的研究重点； 基因重组、直接进化技术的应用，大大加快了生基因重组、直接进化技术的应用，大大加快了生 物产品开发的进程物产品开发的进程。 1 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育

45、 3.1 菌体组成和细胞外代谢产物菌体组成和细胞外代谢产物 3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则 3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备 第二章第二章 菌种的制备菌种的制备 2/jing/c76/zcr-1.htm 3.1 菌体组成和细胞外代谢产物菌体组成和细胞外代谢产物 3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备 1）菌体组成：）菌体组成： ? 2）胞外代谢产物）胞外代谢产物 胞外产物多达胞外产物多达37大类，根据微生物代谢产物和生长繁殖的关大类，根据微生物代谢产物和生长繁殖的关 系不同，分为两大类：系不同，分为两大类： 一

46、类是微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物，称为一类是微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物，称为初级代谢产初级代谢产 物物，此类产物的生产菌种主要是，此类产物的生产菌种主要是细菌、酵母、霉菌细菌、酵母、霉菌等。等。 另一类代谢产物与微生物生长繁殖无明确关系，称为另一类代谢产物与微生物生长繁殖无明确关系，称为次级代谢产次级代谢产 物物，如抗生素、生物碱、色素等。发酵工业用来生产次级代谢产，如抗生素、生物碱、色素等。发酵工业用来生产次级代谢产 物的微生物仅有少数几个类群，主要是物的微生物仅有少数几个类群，主要是丝状放线菌、丝状真菌丝状放线菌、丝状真菌等。等。 3.1 菌体组成和细胞外代谢产物菌体组成和细

47、胞外代谢产物 3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备 3）微生物的营养类型（）微生物的营养类型（nutritional types) 碳源利用碳源利用 自养型自养型 （autotrophs） 异养型异养型 （heterotrophs） 能量来源能量来源 光能营养型光能营养型 （phototrophs） 化能营养型化能营养型 （chemotrophs） 光能无机自养型光能无机自养型 （photo-lithoautotrophy） 化能有机异养型化能有机异养型 （photoorganoheterotrophy） 化能无机自养型化能无机自养型 （chemolithoautotro-phy） 化能有

48、机异养型化能有机异养型 （chemoorganoheterotrophy） 3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则 3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备 1）培养基的营养成分及来源）培养基的营养成分及来源 培养基培养基（medium)是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各 种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。 包括：包括： 碳源碳源(source of carbon) 氮源氮源(source of nitrogen) 无机盐无机盐(inorganic

49、salt) 生长因子生长因子(growth factor) 水水(water) 3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则 3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备 2）培养基的类型和用途）培养基的类型和用途 来源：来源：天然天然培养基（培养基（complex medium；undefined medium） 合成合成培养基（培养基（synthetic medium； defined medium） 半合成培养基半合成培养基（semidefined medium） 外观：外观：固体固体培养基（培养基（solid medium） 液体液体培养基（培养基（liquid m

50、edium） 半固体培养基半固体培养基（semisolid medium） 功能：功能：孢子孢子培养基（培养基（sporemedium）和种子培养基。和种子培养基。 3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则 3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备 3）培养基的配制原则）培养基的配制原则 选择适宜的营养物质、营养物质浓度及配比合适、选选择适宜的营养物质、营养物质浓度及配比合适、选 择合适的择合适的ph、氧化还原电势、营养成分的加入顺序、氧化还原电势、营养成分的加入顺序（先加先加 缓冲化合物，溶解后加入主要物质，然后加入维生素、氨基酸等生长缓冲化合物，溶解后加入主要物

51、质，然后加入维生素、氨基酸等生长 素类的物质素类的物质）。 2/jing/c76/zcr-1.htm 3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则 3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备 4）培养基成分配比的选择）培养基成分配比的选择 种子和孢子培养的目的是获得大量质量良好的菌体或孢子，种子和孢子培养的目的是获得大量质量良好的菌体或孢子， 因此产量提高是选择培养基的一个重要标准。因此产量提高是选择培养基的一个重要标准。 c/n比比 来源丰富、价格便宜、取材方便来源丰富、价格便宜、取材方便 方法：单因子试验、正交试验、均匀试验、影响面

52、法方法：单因子试验、正交试验、均匀试验、影响面法 本章思考题本章思考题 1 工业用微生物的要求有哪些？试举例说明微生物在工工业用微生物的要求有哪些？试举例说明微生物在工 业中的应用。业中的应用。 2 简述自然分离微生物的一般操作步骤。简述自然分离微生物的一般操作步骤。 3 简述种子扩大培养的一般步骤。简述种子扩大培养的一般步骤。 4 如何防止菌种衰退？菌种复壮的措施有哪些？如何防止菌种衰退？菌种复壮的措施有哪些？ 5 影响种子质量的因素有哪些？如何控制种子质量？影响种子质量的因素有哪些？如何控制种子质量？ 2008中国大学评价研究报告中国大学评价研究报告还发布了还发布了 “2008中国最受媒体

53、关注大学排行榜中国最受媒体关注大学排行榜”，排行，排行 榜以榜以2007年度高校网络新闻搜索的数量统计得年度高校网络新闻搜索的数量统计得 出，出，位居前十强位居前十强的高校是北京大学、清华大学、的高校是北京大学、清华大学、 中国人民大学、复旦大学、浙江大学、中山大学、中国人民大学、复旦大学、浙江大学、中山大学、 北京师范大学、上海交通大学、武汉大学、同济北京师范大学、上海交通大学、武汉大学、同济 大学。大学。 中国一流大学名单中国一流大学名单 l 校名校名 入选根据入选根据 l 清华大学清华大学 研究研究1型、工学第型、工学第1名名 l 北京大学北京大学 研究研究1型、理学第型、理学第1名名

54、l 浙江大学浙江大学 研究研究1型、工学第型、工学第2名名 l 南京大学南京大学 研究研究1型、理学第型、理学第2名名 l 北京师范大学北京师范大学 研究研究1型、教育学第型、教育学第1 名名 上海交通大学上海交通大学 研究研究1型、工学第型、工学第3名名 l 中国科术大学中国科术大学 研究研究1型、理学第型、理学第3名名 l 复旦大学复旦大学 研究研究1型、医学第型、医学第3名名 l 校名校名 入选根据入选根据 l 天津大学天津大学 研究研究1型、工学第型、工学第5名名 l 中山大学中山大学 研究研究1型型 l 南开大学南开大学 研究研究1型型 l 中国人民大学中国人民大学 法学第法学第1名、经济学名、经济学 第第2名名 l 西安交通大学西安交通大学 管理学第管理学第1名名 l 中国农业大学中国农业