艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法课件

1、艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法1 HIV-1HIV-1耐药及耐药检测耐药及耐药检测 中国医科大学附属第一医院中国医科大学附属第一医院 艾滋病研究所艾滋病研究所 张张 旻旻 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法2 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法3 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法4 HIVHIV生活周期生活周期 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法5 HIVHIV基因组模式图基因组模式图 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法6 我国及国际两种不同抗我国及国际两种不同抗HIVHIV治疗方案效治疗方案效 果比较果比较 治疗方案治疗方案 国内治疗病毒抑制效果国内治疗病毒抑制效果 国际治疗病毒国际治疗病毒 抑制效果抑制效果

2、 平均治疗平均治疗 时间时间( (月月) ) 载量载量LDL9590-9580-9070-8070 服药依从性服药依从性 (%) 82.1 71.4 66.7 54.6 21.7 2. 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法25 那些因素促使耐药性病毒株出现那些因素促使耐药性病毒株出现? ? 服药依从性服药依从性 (%) 2. 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法26 那些因素促使耐药性病毒株出现那些因素促使耐药性病毒株出现? ? 药物配伍不当药物配伍不当 药代显著不同药物配伍药代显著不同药物配伍3. 0244836 12 时间时间 (小时小时) 药物浓度药物浓度 潜在病毒复制区 IC90 IC50 最后一

3、次用药最后一次用药 单药治疗 S. Taylor et al. 11th CROI Abs 131 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法27 那些因素促使耐药性病毒株出现那些因素促使耐药性病毒株出现? ? 细胞周期依赖性药物细胞周期依赖性药物 AZT, D4T ( AZT, D4T ( 活化期细胞活化期细胞) ) DDI (DDI (静止相细胞静止相细胞) ) 蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂 ( (活化期细胞活化期细胞) ) 非细胞周期依赖性药物非细胞周期依赖性药物 3TC, FTC, Abacavir3TC, FTC, Abacavir TenofovirTenofovir NNRTIsNNRTIs 3

4、. 药物配伍不当药物配伍不当 缺乏对某一时相细胞内病毒抑制或抑制不足缺乏对某一时相细胞内病毒抑制或抑制不足 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法28 那些因素促使耐药性病毒株出现那些因素促使耐药性病毒株出现? ? 胃肠道吸收不好：呕吐，腹泻；胃肠道吸收不好：呕吐，腹泻； 随意间歇服药；随意间歇服药； 与中药或其他药物同时服用。与中药或其他药物同时服用。 4. 其他因素其他因素 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法29 什么是好治疗方案什么是好治疗方案? ? 能快速抑制病毒；能快速抑制病毒； 不易产生耐药性；不易产生耐药性； 可长期维持；可长期维持； 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法30 耐药性分类耐药性分类

5、 1、原发性耐药(Primary resistance): 病人在接受抗 病毒治疗前产生了药物作用靶点的变异，或者感染 了耐药毒株，均降低抗病毒药物的敏感性。在已经 开展HAART的国家普遍存在，感染了耐药毒株的病 人很容易引起药物治疗失败。 2、继发性耐药(Secondary resistance): 病人已经接 受了抗病毒治疗并产生治疗失败，在药物的选择压 力下产生的耐药。 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法31 耐药机制：耐药机制： 核苷和核苷类似物 1、破坏核苷类似物结合病毒破坏核苷类似物结合病毒DNA的能力的能力 M184V 突变: RT酶第184位密码子 的氨基酸由蛋氨酸(M)变成为缬

6、氨酸(V) 。拉米夫定(Lamivudine) Q151M mutation: 在HIV-1中出现低于 5%；HIV-2中出现频率较高。 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法32 耐药机制：耐药机制： 2、切除病毒DNA链末端的核苷类 似物 Thymidine analogues mutations: 突变引起 ATP或者焦磷酸介导的切除DNA链3末端核 苷类似物。 核苷和核苷类似物 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法33 耐药机制：耐药机制： 非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI) 突变降低了抑制剂对酶的结合力。不同 于核苷逆转录酶抑制剂，其单一突变就 能导致高度耐药。如K103N、Y181C。 艾滋病抗

7、病毒治疗的耐药检测方法34 耐药机制：耐药机制： K103N突变的机制突变的机制 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法35 耐药机制：耐药机制： 蛋白酶抑制剂 HIV蛋白酶由两个同样的蛋 白质链组成。这两个蛋白质链 在一起就如同核桃的两半，而 蛋白酶的活性位点就在两个半 壳的中间。 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法36 突变点的表示方法：突变点的表示方法： 基因的突变通常以字母数字字母的书写方式 来表示，第一个字母代表野生型病毒株特定密码子处 的氨基酸，第二个字母代表在特定密码子处替换了的 氨基酸，中间数字表示突变点的位置。例如：逆转录 酶（RT）K103N的突变表示逆转录酶第103位密码子 的氨基酸

8、由天冬酰胺（K）变成为赖氨酸（N）。 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法37 如何检测耐药株：如何检测耐药株： 目前耐药性检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。表型检 测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方 法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的费用较低，技术 也相对容易，可在样品收集后12周得到结果，但分析基因型耐药检 测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物及其它药物的交 叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测可以直接检测病毒 的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，因此目前 国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。 艾滋病抗病毒治疗的耐

9、药检测方法38 如何检测耐药株：如何检测耐药株： Translation into linear string of amino acids Folding into functional protein 表型检测表型检测 基因型检测基因型检测 基因型和表型检测基因型和表型检测 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法39 检测中注意事项检测中注意事项: : 在病人仍在治疗失败的方案上收集样品，可保 证耐药株占总病毒量的20%以上； 病毒载量 1000时, 可出现假阴性。 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法40 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法41 HIV基因型耐药性检测 （序列测定法） 艾滋病抗病毒治疗的耐

10、药检测方法42 检 测 流 程 病人血浆标本 HIV RNA 病毒 cDNA HIV RT和PR基因片段 序列测定 结果解释 RNA提取 逆转录 PCR扩增 特定的解释系统 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法43 标本 新鲜EDTA抗凝血浆，或-80保存，避 免反复冻融 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法44 病毒RNA提取（ Qiagen公司试剂盒） 裂解标本，灭活RNA酶 加到离心柱中，RNA与硅胶膜结合 洗两次，去除杂质 用无RNA酶的缓冲液洗脱RNA 收集RNA备用 优点：操作简便、快速、得率高 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法45 逆转录 RNA cDNA 反应体系： 10XBuffer 1l

11、 dNTP 0.5l 外侧反向引物 1l RNase inhibitor 0.25l M-MuLV RT 0.25l DEPC水 2l RNA模板 5l 42水浴1小时，95 5分钟灭活RT 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法46 巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因 第一轮扩增反应体系： 10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l 外侧正向引物 1l 外侧反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l cDNA模板 10l 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循环 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法47 巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因 第

12、二轮扩增反应体系： 10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l 内侧正向引物 1l 内侧反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l 第一轮扩增产物 10l 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循环 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法48 扩增产物鉴定：琼脂糖凝胶电泳 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法49 扩增产物纯化 QIAquick Gel extraction试剂盒 核酸序列测定 双脱氧链末端终止法 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法50 : Protease: CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAA

13、GATAGGGGGGCAATTAA AGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCC AGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACA GTATGATCAGGTATCCATAGAAATCTGTGGACATAAGGCTGTAGGTACAGTATTAATAG GACCTACACCAGTCAACATAATTGGGAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTT RT: AAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATT

14、AAAGCCAGGAATGGATG GCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAA TTTGTACAGAAATGGGAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCAT ACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGT AGATTTCAGAGAACTCAATAAAAGAACTCAAGACTTTTGGGAAGTTCAATTAGGAATA CCACATCCCGCAGGATTAAAACAGAAAAAATCTGTAACAGTCCTGGAT

15、GTGGGTGATG CATATTTCTCAGTCCCTTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTACACTGCATTTACCATACCTA GTGTAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTACTTCCACAGGGATG GAAAGGATCACCAGCAATATTCCAATGTAGTATGACAAAGATCTTAGAGCCTTTTAGGA AACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTTAGTAGGATCTGACT TAGAAATAGGGCAGCATAGAGCAAAAATAGAGGAACTGAGACAACATC

16、TGTTGAGGT GGGGATTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAGAGGACCTTCCATA 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法51 利用网络工具确定耐药性突变并进行耐药性解释 Web站点： HIV Drug Resistance Algorithm2 HIV Drug Resistance Algorithm3 HIV Drug resistance database HIV Drug Resistance Algorithm1 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法52 高度耐药：大于60分 中度耐药：3059分 低度耐药：1529分 潜在低度耐药：1014分 敏感：09分 耐药

17、性突变计分 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法53 HIV-1耐药性检测的临床指征： （1）抗病毒治疗病毒学失败需要改变抗病毒治疗 方案时应进行耐药性检测以协助选择有效的抗病 毒药物。 （2）抗病毒治疗病毒载量下降不理想时可进行 HIV-1的耐药性检测。 （3）抗病毒治疗失败需要进行耐药性检测时，应 该在病人仍在服药时或停药后立即（4周内）进行 检测。 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法54 HIV-1耐药性检测的临床指征： （4）急性HIV1感染的病人进行抗病毒治疗，最好进 行耐药性检测，对于选择合适的抗病毒药物、取得最 佳抗病毒效果很有益处。 （5）对于未经抗病毒治疗的慢性HIV感染者不一定要 做耐药性检测，但当有迹象显示感染的是耐药性HIV毒 株时（例如感染来自于正在服用抗病毒药物的病人）， 就应当进行耐药性检测。 （6）不推荐对病毒载量1000cp/ml的病人做病毒载量 检测，因为病毒水平太低很难扩增出目的基因片段 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法55 耐药性检测结果的解释 HIV-1的耐药性不是全或无的现象，基因型和表型耐药性 检测结果的分析和解释都有困难 所有抗病毒治疗都是联合用药，他们之间是相互协同的， 即对一种药物的敏感性降低并不干扰同一治疗方案中其他 药物的抗病毒活性。 药物即使有耐药性也可能有益处，因为有耐药性突变的 病毒比敏感