流式细胞仪原理及应用[特制材料]

1、流式细胞仪流式细胞仪 FLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETER 原理及应用原理及应用 1行业材料 基本原理基本原理 n光源 u488nm兰绿色，15mW空冷，氩离子激光 n流路 u流动室(flow cell) F鞘液SHEATH：(ISOTON II, III) PBS 无颗粒，无荧光本底 无菌，稳定的pH F样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml n放大部分 u光电倍增管PMT HV u放大电路 GAIN 增益 F线性：LIN F对数：LOG n统计：计算机 2行业材料 FLOW CELL Injector Tip Fluorescence signals

2、 Focused laser beam Sheath fluid 3行业材料 FLOW CYTOMETRY(FCM) PMTAMP computer LIN LOG LASER SAMPLE SIGNAL 4行业材料 滤片滤片 n带通滤片 BAND PASS (BP) u只允许某些波长的光通过 n二向色性滤片 DICHROIC FILTER u一定波长以上通过，该波长以下折射 630 nm BandPass Filter Transmitted Light White Light Source 620 -640 nm Light Dichroic Filter/Mirror at 45 deg

3、 Reflected light Transmitted LightLight Source 5行业材料 PMT PMT PMT PMT 4 Dichroic Filters Bandpass Filters Flow Cytometry Principle Laser 1 2 3 4 Flow cell 6行业材料 OPTICS 7行业材料 信号信号 n荧光信号 uFL1，FL2，FL3，FL4 u线性，对数 n散射光信号 u前向散射光(FS)：细胞大小 u侧向散射光(SS)：结构复杂程度 8行业材料 荧光染料的特性 激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION) 9行业材料 常

4、用荧光染料的特性 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 深红 PI 488 620 DNA染色 橙红 10行业材料 EPICS XL 流式细胞分析仪流式细胞分析仪 11行业材料 BECKMANCOULTERBECKMANCOULTER FLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETER -细胞分析领域中的细胞分析领域中的CTCT 实现快速、高灵敏度、多参数的细胞功能分析实现快速、高灵敏度、多参数的细胞

5、功能分析 12行业材料 细胞的特征与细胞功能 n不同细胞的形态学特征 n不同细胞的蛋白表达 n其它细胞功能特征 13行业材料 CD # = cluster designation number 14行业材料 90 Degree Scatter 0 200 400 600 8001000 Forward Scatter 0 200 400 600 8001000 8 15 20 30 40 50 100 200 1000 Lymphocytes Monocytes Neutrophils Side Scatter Projection Forward Scatter Projection Lig

6、ht Scatter Gating Scale 15行业材料 Log FITC 1000 100 10 1 110 .1 Count 30 70 0 150 16行业材料 Log FITC Fluorescence (CD8) .1 1 10 1001000 Log PE Fluorescence (CD4) .1 1 10 100 12 34 45%2% 26% 双参数直方图双参数直方图DOT PLOT 27% 17行业材料 CD分子(Cluster of differentiation) -人类白细胞分 化抗原 1982年巴黎首届国际学术会议确定CD命名法 已有200多个分化抗原群被鉴定和

7、命名 已得到WHO有关管理机关批准 18行业材料 CD抗原及其相关细胞群抗原及其相关细胞群 n 细胞群 CD抗原 n T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 n B细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 n 髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 n NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94 n 血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 n 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 n 粘附分子 CD11a-c CD

8、18 CD29 CD44 CD49a-f n 内皮细胞 CD105 CD106 CD109 n细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126 19行业材料 20行业材料 21行业材料 22行业材料 23行业材料 24行业材料 25行业材料 HLA-B27:强直性脊柱炎相 关标志 CD23: 与变态反应严重程度 呈正相关 26行业材料 5例正常人CD4,CD8计数 编 WBC LY/WBC LY CD4/LY CD4 CD8/LY CD8 CD4/CD8 号 *109/L *100% *109/L *100% *109/L *100% *109/L 1 8.1 33.1

9、2681 38.3 1027 25.4 680 1.51 2 6.7 35.0 2345 43.2 1014 26.0 609 1.66 3 8.0 36.5 2920 38.0 1110 27.0 788 1.41 4 5.4 36.0 1944 43.5 846 22.0 428 1.98 5 5.4 34.1 1841 46.5 856 25.5 469 1.82 27行业材料 8例HIV/AIDS患者CD4,CD8计数 编 WBC LY/WBC LY CD4/LY CD4 CD8/LY CD8 CD4/CD8 号 *109/L *100% *109/L *100% *109/L *10

10、0% *109/L 1 3.9 44.5 1736 34.9 606 48.0 833 0.73 2 1.8 32.0 576 4.3 25 61.8 356 0.07 3 3.6 48.3 1739 16.4 285 58.6 1019 0.28 4 3.1 36.2 1122 17.4 195 59.2 644 0.29 5 5.1 39.9 2035 2.9 60 74.7 1520 0.11 6 4.7 35.8 1683 23.8 401 35.6 599 0.67 7 4.0 18.0 720 10.3 74 43.3 312 0.24 8 4.6 60.1 2765 19.3 5

11、34 58.6 1620 0.23 28行业材料 8例HIV/AIDS患者临床情况 编 性 测出抗HIV 目前的 诊断 临 床 情 况 号 别 阳性的年龄 年龄 1 女 30 30 HIV感染 无临床症状 2 男 34 35 AIDS TB,PCP,面 神经麻痹,HZV, 隐球菌脑膜炎 3 女 30 34 HIV感染 无临床症状 4 女 23 26 HIV感染 乏力,体力差 5 男 32 33 AIDS TB,PCP 6 女 62 63 HIV感染 无临床症状 7 男 29 30 AIDS PCP 8 男 31 35 HIV感染 无临床症状 29行业材料 30行业材料 31行业材料 亚亚型型常

12、常 表表 达达 抗抗 原原 M0CD11b CD13或 或CD33 M1CD13 CD15 CD33 CD34 HLA-DR CD56 CD19 M2CD11b CD13 CD15 CD33 CD34 M3CD11b CD13 CD15 CD33 CD34 M4CD4 CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 CD34 M5CD4 CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 CD34 M6 血血型型糖糖蛋蛋白白A CD13 CD33 CD34 M7CD41 CD61 CD13 CD33 CD34 因 因子子相相关关抗抗原原 32行业材料 AML与ALL免疫表型 CD19 CD

13、7 CD33 CD13 HLA-DR TdT B-ALL + - - - + +/- T-ALL - + - - -/+ + AML - -/+ + + +/- - 33行业材料 T-ALL表型特征 CD7 CD5 CD2 CD3 CD4 CD8 CD1a I + 90% 75% - - - - II + + + 25% 90% 90% + III + + + + +/- +/- - 34行业材料 非T-ALL亚型 HLA-DR CD19 CD10 CD20 Cyu smIg Ig重排 I + - - - - - - II + + - - - - + III + + + - - - + IV

14、+ + + + - - + V + + + + + - + VI + + - + - - + 35行业材料 AML免疫表型 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 HLA-DR + + - + + +/- +/- CD34 + +/- - +/- +/- - +/- CD33 + + + + + +/- +/- CD13 +/- + + + + + +/- CD11b - + +/- + + - / CD15 - + +/- + + +/- / CD14 - +/- - + + - - GPA - - - - - + - GP - - - - - - + 36行业材料 37行业材料 38行业

15、材料 成人急性白血病成人急性白血病P-gpP-gp表达的临床意义表达的临床意义 P-gp+ P-gp+ P-gp-P-gp- 缓解率（CR） 20.5% 78.5% AMLAML 6个月复发率 66.7 % 8.7% 151 平均无病生存期 5M 13M 缓解率（CR） 66.7% 80.0% ALL ALL 6个月复发率 50.0 % 9.5% 47 平均无病生存期 4M 13M 李建勇 Clin J Oncol 1998,4:302 39行业材料 成人成人ALLALL多药耐药多药耐药P-gpP-gp与形成学分型的关系与形成学分型的关系 分型 例数 P-gp+ P-gp- P-pg阳性率 L

16、1 25 3 22 12% L2 40 10 30 25% L3 3 1 2 33.3% P0.05 华东：中华血液学杂志，1998，19：371 40行业材料 P-gpP-gp表达与表达与ALLALL免疫分型的关系免疫分型的关系 免疫分型 例数 P-gp阳性例数 阳性率(%) B 38 8 21.1 T 10 1 10.0 T/B 4 2 50.0 难分类 4 2 50.0 My- 40 4 10.0 My+ 16 9 56.3 My+ALL My+ALL 的的P-gpP-gp阳性率明显增高阳性率明显增高 41行业材料 AMLAML中免疫表型与中免疫表型与P- gpP- gp表达的关系表达的

17、关系 成人：成人： P-gp的表达与CD7、CD14、CD42b、CD61、 CD34 等高度相关。 老年人：老年人： P-gp的表达与CD14、CD42b、CD61有相 关性 P-gp的表达与CD34高度相关。 42行业材料 43行业材料 4.血液病的其他应用 AA，PNH鉴别诊断 自身抗体检测 PAIgG, PAIgM, PAIgA RBC抗体 粒细胞抗体 44行业材料 PNH红细胞表面CD59表达 45行业材料 46行业材料 癌基因与抗癌基因在肿瘤细胞中的表达及与预后的关 系 (癌前病变,恶性肿瘤预后评价) 细胞增殖能力研究细胞增殖能力研究 47行业材料 48行业材料 0 200 400

18、 600 8001000 DNA content C o u n t Normal Cell Cycle 49行业材料 0 200 400 600 8001000 PI Fluorescence Counts 0 75 150 225 300 DNA Analysis 50行业材料 0 200 400 600 8001000 PI Fluorescence Counts 0 75 150 225 300 DNA Analysis 51行业材料 52行业材料 DNA倍体倍体 DNA指数 指数(DI) 意义意义(染色体数染色体数) 正二倍体正二倍体 (2n, Diploid)1.0046条染色体条

19、染色体 亚二倍体亚二倍体 (Haploid)0.5023条染色体条染色体 四倍体四倍体 (Teraploid)2.0092条染色体条染色体 低倍体低倍体 (Hypoploid)1.01.046条染色体条染色体 53行业材料 淋巴瘤组织学分级与DNA倍体及 S期细胞关系 Histology DNA Analysis S 期比值期比值(%) Low -grade Diploid 15 Intermediate-grade Frequently Aneuploid 5 15 High-grade Frequently Diploid 15 54行业材料 异倍体癌前病例病变结果 组织类别 异倍体(例数

20、) 癌变例数 组织学 分级 1 2 3 鼻咽 13 7 0 1 6 口腔 7 4 0 0 4 胃 10 3 0 0 3 宫内膜 9 6 0 1 5 宫颈 6 2 0 0 2 总计 45 22 2 20 55行业材料 各类癌前病变组织学分级与DNA倍体关系(1) 组织类别 不典型增 例数 DNA 倍体(例数) 生分级 二倍体 异倍体 鼻咽粘膜 1 11 11 0 2 28 23 5 3 13 5 8 口腔粘膜 1 10 10 0 2 6 6 0 3 19 12 7 56行业材料 各类癌前病变组织学分级与DNA倍体关系(2) 组织类别 不典型增 例数 DNA 倍体(例数) 生分级 二倍体 异倍体

21、胃粘膜 1 18 18 0 2 14 13 1 3 14 6 8 宫内膜 1 10 10 0 2 14 13 1 3 16 8 8 宫颈粘膜 1 9 9 0 2 16 12 4 3 5 3 2 57行业材料 58行业材料 59行业材料 60行业材料 61行业材料 62行业材料 63行业材料 活化血小板的概念活化血小板的概念 循环血液中处于静息状态的血小板 受到生物或物理因子刺激后,使血小 板胞浆内颗粒膜糖蛋白释放与质膜 融合,血小板膜表面糖蛋白发生数量 重排和构象变化而成为活化血小板 64行业材料 活化血小板的功能活化血小板的功能 参与血栓形成与止血 参与炎症和免疫反应 参与肿瘤的转移 65行

22、业材料 血小板活化标志物在缺血性脑血管疾病中研究血小板活化标志物在缺血性脑血管疾病中研究 ： 1.脑缺血患者急性期血小板CD62p、CD63测定 2.缺血性脑血管患者CD62p、CD54、CD49d测定 3.缺血性脑血管患者CD62p、TSP、CD54测定 66行业材料 67行业材料 68行业材料 应用应用FCMFCM曾开展过的一此基础研究曾开展过的一此基础研究： 胃癌及癌旁组织胃癌及癌旁组织DNADNA、细胞凋亡、细胞凋亡、P- gp P- gp 、粘附分子检测的临粘附分子检测的临 床意义床意义 哮喘患者氨茶碱诱导细胞凋亡的实验研究哮喘患者氨茶碱诱导细胞凋亡的实验研究 NONO与造血干细胞增

23、殖活性关系的研究与造血干细胞增殖活性关系的研究 中药中药 “清心饮清心饮”拆方治疗病毒性心肌炎机制的实验研究拆方治疗病毒性心肌炎机制的实验研究 中药治疗强直性脊柱炎的机理研究中药治疗强直性脊柱炎的机理研究 氨氯地平治疗高血压的机理研究氨氯地平治疗高血压的机理研究 葛根素对心肌细胞保护机制的实验研究葛根素对心肌细胞保护机制的实验研究 心脏移植后免疫排异反应监测的研究心脏移植后免疫排异反应监测的研究 69行业材料 细胞凋亡研究 n亚二倍体 nCD95(Fas, APO1) nAPO2.7 nANNEXIN V-PI n断裂点掺入 70行业材料 细胞周期分析细胞周期分析-异倍体与凋亡峰异倍体与凋亡峰 71行业材料 72行业材料 凋亡检测 Annexin V-PI双标记 GATES SAMPLE NAME : 1 SAMPLE NUMBER: SAMPLE DATE: 10Sep99 SAMPLE TIME: 16:43:35 17Sep99 at 09:51:01 Page 1 SSC 60 50 40 30 20 100 FS 60 50 40 30 20 100 A C L G: 1 2 8 35 141 566 scale GATES SAMPLE NAME : 1 SAMPLE NUMBER: SAMPLE DATE: 10