冰片促丹参素到达兔眼内能力的实验研究

1、冰片促丹参素到达兔眼内能 力的实验研究 冰片的作用 冰片具有通诸窍,散郁火,去翳明目,消肿止痛 之功能。 冰片较少单独应用,常作为“引药”,以增加 其它药物的治疗效果,即中医所谓的“芳香 走窜,引药上行”“独行则势弱,佐使则有 功”。 血眼屏障血眼屏障 血视网膜屏障血视网膜屏障 血房水屏障血房水屏障 血视神经屏障血视神经屏障 其结构和功能与其结构和功能与BBB相似，这些屏障有一个相似，这些屏障有一个 共同的特点，就是血管内的小分子物质可共同的特点，就是血管内的小分子物质可 以通过，而血液中的成分和大分子物质则以通过，而血液中的成分和大分子物质则 不能通过血管壁而到达房水或视网膜内。不能通过血管

2、壁而到达房水或视网膜内。 这些屏障的的存在，也同时限制了许多治这些屏障的的存在，也同时限制了许多治 疗性药物的通透性，在组织内达不到治疗疗性药物的通透性，在组织内达不到治疗 浓度，限制了某些药物的治疗作用，如果浓度，限制了某些药物的治疗作用，如果 加大药物的剂量势必会使药物的副作用加加大药物的剂量势必会使药物的副作用加 大大. 丹参素具有改善微循环和抗自由基的作丹参素具有改善微循环和抗自由基的作 用用 材料与方法 动物与试剂 110 健康家兔, 体重 2.2 - 2.5 kg， 由哈尔滨 医科大学中心实验室提供, 温度 (22 3) 、 湿度 (655)% 丹参素标准品购于中国药品检验检定所

3、冰片购于北京同仁堂药店 高效液相色谱仪:HP1100LC-2010A, Agilent Co., USA 将实验动物分为两组：丹参素组和丹参+冰 片组 每组再分为每组再分为 11 组组( 血浆组血浆组, 5, 15, 25, 35,45,60,120,270,600 and 900 分钟组分钟组) 实验组（冰片+丹参） 血浆亚组：给予冰片（1.0g/kg溶于95%乙醇 稀释成40mg/100ml）口服灌胃15分钟后， 给予中药丹参冻干粉（1.0g/kg）+0.85%生 理盐水20 ml右耳缘静脉推注。实验组的血 浆亚组每只动物在丹参给药后0、5、10、 20、30、45、60、90、120 m

4、in于家兔左耳 缘静脉采血1.5 ml。 眼内亚组在给药后5、15、25、35、45、60、 120、270、600、900 min处死动物，用 0.85%生理盐水快速充分冲洗结膜囊，然后 用1 ml注射器在角膜缘内1 ml刺入前房抽取 房水0.3ml（每次更换注射器）。冷藏，12h 内送检。检测房水和玻璃体内丹参的水溶 性标志成分丹参素（Dhpl）的含量。 对照组 给予与实验组对应剂量95%乙醇口服灌胃15 分钟后给予中药丹参冻干粉（1.0g/kg） +0.85%生理盐水20 ml右耳缘静脉推注。其 他实验方法与实验组相同。 供试品溶液的制备供试品溶液的制备 上述方法得到的全血，以3000转

5、/min 离心10 min，取 血浆取血浆样品0.2 ml，加1 %醋酸0.08 ml，1 mol/L 盐 酸0.08 ml，混匀，加乙酸乙酯2 ml，漩涡混合提取2 min，离心(10000 r/min )5 min。分取有机层1.5 ml，45 水浴上通空气流挥干。临用前残渣用1 ml 流动相溶 解，超声震荡20 min，漩涡混合2 min，离心(12000 r/min) 10 min，取上清液备用。 房水同血浆。 色谱条件色谱条件 色谱柱THERMO (日电)，Hypersil BDS C18， (5m 4.6mm250mm); 预柱: 自填国产YWG C18；流动相为乙腈：0.01 /

6、L磷酸二氢钾（8：92）用磷酸缓冲液调 PH=2.8；紫外检测波长279nm；流速 1.0ml/min；柱温为室温。 标准曲线的制备标准曲线的制备 配制标准工作液配制标准工作液 精密称取丹参素对照品适量，加1 %醋酸配 成浓度为1mg/ml的贮备液，4 保存。临用 前，取丹参素贮备液适量，用1 %醋酸溶液 按倍数稀释法稀释至所需浓度，即得丹参 素的标准工作液。 标准曲线的制备标准曲线的制备 兔血浆标准曲线的制备兔血浆标准曲线的制备 兔房水标准曲线的制备兔房水标准曲线的制备 兔玻璃体标准曲线的制备兔玻璃体标准曲线的制备 线性关系线性关系 （1）血浆线性关系）血浆线性关系 按“标准曲线的制备” 方

7、法测得丹参素的峰面积 ( Yd ) 与丹参素血 浆浓度(Xd) 在31.251000 g/ml范围内线性 关系良好，Yd = -0.3292 + 1.5994Xd， = 0.9999 。结果见图1。 图1 丹参素的血浆标准曲线 Figure 1 Standard curve of danshensu(Dhpl) in plasma 房水线性关系房水线性关系 按“标准曲线的制备”方法测得丹参素的 峰面积 ( Yd ) 与丹参素房水浓度(Xd) 在 1.562550 g/ml范围内线性关系良好，Yd = 0.2102 + 7.7798Xd，= 0.9999。结果见图2。 图2 丹参素的房水标准曲线

8、 Figure 2 Standard curve of danshensu(Dhpl) in aqueous 玻璃体线性关系 测得丹参素的峰面积 ( Yd ) 与丹参素房水浓 度(Xd) 在0.0781-2.5 g/ml范围内线性关系良 好，Yd = 0.029 + 17.682Xd，= 0.9999。 样品测定方法样品测定方法 （1）血浆）血浆： 精密吸取供试品溶液20l 注入 液相色谱仪，记录丹参素的峰面积，以丹 参素峰面积为定量指标，根据标准曲线求 算相应的血药浓度。 （2）房水、玻璃体）房水、玻璃体： 精密吸取供试品溶液 100l 注入液相色谱仪，记录丹参素的峰面 积，以丹参素峰面积为

9、定量指标，根据标 准曲线求算相应的房水和玻璃体药浓度。 结果 min024681012 mAU 0 2 4 6 8 VWD1 A, Wavelength=279 nm (DS0308DS02.D) 6.523 兔空白血浆加入标准品色谱图 min024681012 mAU 0 2 4 6 8 10 12 VWD1 A, Wavelength=279 nm (DS092823.D) 5.797 给药120 min后兔血浆色谱图 min024681012 mAU 0 5 10 15 20 VWD1 A, Wavelength=279 nm (DS062808.D) 2.513 6.011 7.624

10、 给药25 min后兔房水色谱图 血浆内血浆内Dhpl的测定的测定 时间 n 对照组 实验组 t检验 0min 5 714.7833.27 722.9042.91 P0.05 5min 5 404.3525.23 411.9320.50 P0.05 10min 5 321.6321.16 325.1123.18 P0.05 20 min 5 255.0420.20 262.5124.44 P0.05 30 min 5 229.5418.35 231.5616.81 P0.05 45 min 5 186.2915.41 180.0114.80 P0.05 60 min 5 149.8911.22

11、 144.1913.02 P0.05 90 min 5 88.4011.91 91.8811.11 P0.05 120 min 5 60.2410.06 60.999.33 P0.05 不同时间点对照组、实验组房水Dhpl浓度 (g/ml) 时间 n 对照组 实验组 t检验 5min 10 17.362.859 23.393.330 P0.05 15min 10 26.273.601 33.742.487 P0.05 25min 10 38.732.847 47.273.068 P0.05 35min 10 32.433.058 40.894.143 P0.05 45min 10 25.952

12、.535 31.452.153 P0.05 60min 10 23.972.64 28.842.794 P0.05 120min 10 19.621.932 23.682.389 P0.05 270min 10 3.530.940 4.380.805 P0.05 600min 0 0 900min 0 0 不同时间点对照组、实验组玻璃体Dhpl浓 度(g/ml) 时间 n 对照组 实验组 t检验 5min 10 0.20140.0475 0.59770.0874 p0.001 15min 10 0.45640.0846 0.73450.0718 p0.001 25min 10 0.75030.

13、1160 1.1320.1786 p0.001 35min 10 0.50670.1018 0.73450.0993 p0.001 45min 10 0.57220.0876 0.80800.1104 p0.001 60min 10 0.48180.1019 0.71470.1178 p0.05 120min 10 0.60220.1147 0.85440.1277 p0.001 270min 10 0.34950.0802 0.43090.0928 p0.05 600min 10 0.17200.0534 0.22000.0571 p0.05 900min 10 0.09790.0202 0

14、.11880.0305 p0.05 结结 论论 我国传统医药历史悠久，几千年来，人们 就一直应用中草药治疗各种疾病，随着医 学进展，中西医结合的方法在眼科临床治 疗中收到了良好的效果。丹参始载于神 农本草经, 被列为上品, 历代本草均有收载。 具祛瘀止痛, 活血通经, 清心除烦之功效。是 现代临床常用的活血化瘀药物,在眼科用于 视网膜动、静脉阻塞、眼底出血、视神经 病变等方面具有较好作用。 研究表明, 丹参的水溶性成分主要为酚性芳香酸类化 合物, 多含有苯丙烷结构, 以及该类酸缩合形成的多酚 芳酸，主要有丹参酸甲 (丹参素)、丹参酸乙、丹参酸 丙、原二茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C 和迷迭

15、 香酸等。中华人民共和国药典明确写明丹参素是丹参 水溶性成分中的主要药效成分，既丹参的标志性成分。 又因实验注射所用丹参冻干粉为复方丹参水溶性制剂， 故本研究中把丹参素(Dhpl)作为示踪目标从而观察丹 参是科学的。 考察了以下流动相对给药后血浆样品测定的影响，流 动相A :甲醇水冰醋酸(17 82 1) ;流动相B:乙腈 0.01 molL - 1磷酸二氢钾溶液(8 92) (磷酸调至pH 2.8) ; 流动相C :乙腈水冰醋酸(9 90 1) 。结果表明,只 有流动相B 使丹参素达到了基线分离,且极性较小的酚 酸类成分基本不干扰样品中丹参素的测定。由于丹参 素为酸性化合物,因此考察了不同酸

16、度流动相(pH 2.8 ,3.8 及4.8) 对分离的影响。结果表明,当pH 2.8 时, 由于离解被抑制,丹参素分离较好,色谱峰的对称性明 显改善。 本实验采用液-液萃取法，考察了萃取溶剂 (乙酸乙酯)用量及酸度对萃取的影响。结果 表明,于血浆、房水0.2mL 中加入1 molL - 1 盐酸0.08 mL ,将pH 调至1.5,用乙酸乙酯2 mL 萃取, 于玻璃体0.5mL 中加入1 molL - 1盐酸 0.2 mL , 用乙酸乙酯5 mL 萃取，丹参素可被 较好地萃取。 丹参素高、中、低3 种浓度的平均萃取回收 率均在75%以上，且又经过组分的分离及浓 集等处理过程，去除了干扰测定的杂

17、质， 并使被测组分浓集。此方法可靠，结果稳 定，符合生物样品测定要求。 血-房水屏障由睫状体无色素上皮的紧密连 接、虹膜组织的连接和虹膜血管组成，就 像一张有微孔半径105m的半透性膜。血- 房水屏障的存在使房水与血液的成分及其 质量浓度不同，药物能否到达房水取决于 其能否通过血房水屏障。血-视网膜屏障 是视网膜血管内皮、视网膜色素上皮间、 睫状体无色素上皮间的紧密连接复合体。 丹参素在玻璃体内的吸收情况未见报道。 本实验结果表明，中药复方丹参静脉注射 后能够通过血-眼屏障到达房水及玻璃体， 但通透性相对较差，在血中的高峰浓度是 房水中高峰浓度的20倍，玻璃体的800倍。 冰片的相对分子量为154.24，为小分子脂溶 性单萜类物质，在胃部吸收迅速，进入体 循环后极易通过血脑屏障而进入脑内， 14,15实验证实，小鼠口服冰片5min后即可 进入脑组织，冰片血清和脑组织中的达峰 浓度分别是20min和45min，所以本实验选 择在冰片灌胃15min使冰片在血液中一定浓 度后静脉注射复方丹参，以便发挥冰片的 最佳促渗透作用。 从实验可以看出，丹参素与冰片合用，检测血清中作 为示宗物质的丹参素，实验组与对照组的血药浓度无 统计学意义（p