真核表达调控分子生物学(1)

1、精选课件1 8.3.3 组蛋白的乙酰化及去乙酰化 组蛋白乙酰化是一可逆的动态过程。组蛋白乙酰基转移酶(HAT) 将乙 酰辅酶A 乙酰基部分转移到核心组蛋白氨基末端上特定赖氨酸残基的 2氨基基团。这些赖氨酸的乙酰化导致电荷的中和以及DNA 与组蛋白 的分离,使核小体DNA 易于接近转录因子。在此种情况下,其他因子就 可乘虚而入结合于DNA 上。 1. 组蛋白的基本组成 2X (H2A, H2B, H3, H4) 精选课件2 2. 核心组蛋白的乙酰化与去乙酰化 乙酰化乙酰化：组蛋白乙酰基转移酶 去乙酰化去乙酰化：组蛋白去乙酰化酶 精选课件3 精选课件4 3. 组蛋白乙酰基转移酶（HAT） 目前已发

2、现的HAT有两类： 一类与转录有关 另一类与核小体组装以 及染色质的结构有关。 HAT并不是染色质结合蛋白， 但可以通过与其他蛋白相互作 用来影响染色质的结构。 精选课件5 精选课件6 组蛋白的乙酰化能中和赖氨酸的正电荷，C=O具 有一定的负电，能够增加与DNA的斥力，使得 DNA结构变得疏松，从而导致基因的转录活化。 精选课件7 4. 组蛋白去乙酰化酶 组蛋白去乙酰化酶负 责去除组蛋白上的乙 酰基团。 目前研究比较深入的 是人类中的HDAC1和 酵母中的Rpd3。它们 都形成很大的复合体 发挥作用。 Rpd3能特异性去除组蛋白上的乙酰基团，使核小体相互靠近， 并在转录共抑制子Sin3及R的协

3、同作用下，抑制基因转录。 精选课件8 5. 组蛋白的乙酰化及去乙酰化对基因表达的影响 组蛋白乙酰化的状态与基因表达有关。组蛋白组蛋白乙酰化的状态与基因表达有关。组蛋白N N端端“尾巴尾巴” 上赖氨酸残基的乙酰化中和了组蛋白尾巴的正电荷，降低上赖氨酸残基的乙酰化中和了组蛋白尾巴的正电荷，降低 了它与了它与DNADNA的亲和性，导致的亲和性，导致核小体构象发生有利于转录调核小体构象发生有利于转录调 节蛋白与染色质相结合的变化，从而提高了基因转录的活节蛋白与染色质相结合的变化，从而提高了基因转录的活 性。性。 相反，组蛋白相反，组蛋白去乙酰化与基因活性的阻遏有关。去乙酰化与基因活性的阻遏有关。 组蛋

4、白乙酰基转移酶和去乙酰化酶只能有选择地影响一部组蛋白乙酰基转移酶和去乙酰化酶只能有选择地影响一部 分基因的转录。分基因的转录。 精选课件9 Model for methylation-dependent gene silencing. Acetylation of the histones causes an open chromatin configuration that is associated with transcriptional activity. Methylated cytosines are recognized by methyl-CpG-binding protein

5、s (MBDs), which in turn recruit histone deacetylases (HDACs) to the site of methylation, converting the chromatin into a closed structure that can no longer be accessed by the transcriptional machinery. 精选课件10 DNA甲基化诱导了组蛋白的去乙酰化作用，使靶基因转录受抑制。甲基化诱导了组蛋白的去乙酰化作用，使靶基因转录受抑制。 精选课件11 8.3.4 组蛋白甲基化对于真核基因表达的调控 组

6、蛋白甲基化的功能组蛋白甲基化的功能 组蛋白甲基化染色体常见分布主要功能 H3K9me3中心粒、端粒组成型异染色质 H3K27me3沉默基因沉默基因 H3K4me3转录起始位点转录活性区标记 H3K36me3转录区转录活性区标记 各种组蛋白甲基化修饰在染色体上的 分布以及功能不尽相同 精选课件12 非组成型异染色质化非组成型异染色质化 多发生在不同生长发育时期一些需要被 沉默的基因区域。 雌性的随机失活的一条X染色体。 组成型异染色质化组成型异染色质化 通常发生在染色质中心粒、端粒区域。保持中 心粒、端粒的异染色质化。 精选课件13 表观修饰的遗传表观修饰的遗传 通过已经存在的标记招募相应甲基转

7、移酶到染色质附近。 母三色猫的斑驳毛色是X去活化的表现，“黑色皮毛”与“橙色 皮毛”的等位基因位于不同的X染色体上。由于x染色体去活化的 对象是随机选择，因此不同部位，会依保留活性之染色体的不同， 而有不同的毛色。 玳瑁猫玳瑁猫 精选课件14 常表达染色质常表达染色质 比异染色质区有更宽松的修饰环境。不同甲基转移酶蛋白 和不同磷酸化状态的RNA聚合酶II相互作用，导致两种组蛋白甲基化在基因 区的不同分布方式。 启动子解脱 转录区域 修饰的整合作用修饰的整合作用 多种组蛋白修饰作用不是彼此孤立存在的，它们往往参 与同一个基因的表达调控。 精选课件15 2. 组蛋白甲基转移酶组蛋白甲基转移酶 不同

8、的HMT催化不同的底物，酶催化中心的一些关键氨基酸所构成的 不同的空间位阻决定该酶能够添加多少个甲基。 精选课件16 3. 组蛋白去甲基化酶组蛋白去甲基化酶 可以脱去组蛋白甲基化的一类酶，主要有LSD1和JmjC家族去甲基化酶 两类。 在FAD的参与下, LSD1在体外和体内都可以特异去掉二甲基和一甲基 修饰但LSD1去甲基的活性受到底物的限制, 不能去掉赖氨酸的三甲基修 饰。 同一个去甲基化酶可以行使转录激活和转录抑制两种相反的功能，视与 其合作的因子而定。 JmjC家族去甲基化酶需要铁离子和a-酮戊二酸参与反应，可以去掉赖 氨酸的三甲基化修饰。 许多赖氨酸去甲基化酶中的jumonji结构域

9、是酶的催化活性结构域。 精选课件17 RNA干扰及其应用干扰及其应用 精选课件18 最早在矮牵牛花中发现此现象最早在矮牵牛花中发现此现象 1990，Jorgensen 在矮牵牛花中过表达花青素色素基因在矮牵牛花中过表达花青素色素基因 (anthrocyanin pigment gene)以加深花的颜色。以加深花的颜色。 Caused the loss of pigment. RNAi的发现的发现 Called co-suppression because suppressed expression of both endogenous gene and transgene. 精选课件19 Tw

10、o mechanisms can explain this transgene-mediated gene silencing Transcriptional gene silencing Post Transcriptional Gene Silencing (PTGS) mRNA is made, but then degraded RNAi的发现的发现 精选课件20 RNAiRNAi的发现的发现 19951995年，年，Kemphues KJ, Guo SKemphues KJ, Guo S 等试图阻断秀丽新小杆线虫等试图阻断秀丽新小杆线虫 （C. elegansC. elegans）中

11、的）中的par-1par-1基因的表达。基因的表达。 设计：设计： 反义反义RNA RNA 特异性地阻断特异性地阻断par-1par-1基因的表达；基因的表达； 正义正义RNA RNA 以期观察到基因表达的增强。以期观察到基因表达的增强。 结果结果: : 二者都同样地切断了二者都同样地切断了par-1par-1基因的表达途径。这是与传统上基因的表达途径。这是与传统上 对反义对反义RNARNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这 个意外以合理解释。个意外以合理解释。 Cell. 1995, 81 (4): 611-620Cell. 1995, 81

12、 (4): 611-620 精选课件21 RNAiRNAi的提出的提出 直到直到19981998年年2 2月，月，Fire AFire A和和Mello CMello C才首次揭开这个悬才首次揭开这个悬 疑之谜。疑之谜。 他们将体外转录得到的他们将体外转录得到的单链单链RNARNA纯化后纯化后注射线虫时注射线虫时 发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的纯化的 双链双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基却正好相反，能够高效特异性阻断相应基 因的表达。表格因的表达。表格 他们证实，他们证实，Guo SGuo S博士遇到的正义博士遇到的正义RNAR

13、NA抑制基因表达抑制基因表达 的现象，以及过去的反义的现象，以及过去的反义RNARNA技术对基因表达的阻技术对基因表达的阻 断，都是由于体外转录所得断，都是由于体外转录所得RNARNA中中污染了微量双链污染了微量双链 RNARNA而引起。而引起。 该小组将这一现象称为该小组将这一现象称为RNARNA干扰（干扰（RNA interferenceRNA interference， 简称简称RNAiRNAi）。）。 精选课件22 In 1998 Andy Fire and Craig Mello showed that injections of double stranded RNA was mo

14、re effective than single stranded RNA in generating mutant phenotypes. 精选课件23 RNAiRNAi的提出的提出 精选课件24 RNAiRNAi的含义的含义 RNARNA干扰干扰（RNARNA i interference，缩写为RNAiRNAi）是指由双 链RNARNA诱发的基因沉默基因沉默现象。 其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因 表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双 链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默 。 与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中， RNAi具有传递性，可在细胞

15、之间传播，此现象被称作 系统性RNA干扰(systemic RNAi)。在秀丽隐杆线虫秀丽隐杆线虫上实 验时还可使子一代产生基因突变基因突变，甚至于可用喂食细 菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。 精选课件25 RNAi广泛存在于自然界广泛存在于自然界 随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、 涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶 段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而 同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越 来越为人们所重视。 精选课件26 精选课件27 体外实验结果的提示体外实验结

16、果的提示 体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21- 23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为 21-23核苷酸长的片段。 从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯 化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与 引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。 那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该 呢？ 由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸长的 dsRNA片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以 这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们 提出一种RNAi作用的简单模型。 精选课件28 sho

17、rt-interfering RNA QuickTime and a GIF decompressor are needed to see this picture. 通过一类较稳定的中间介质实现的。通过一类较稳定的中间介质实现的。 植物：双链植物：双链RNA复合体先降解成为复合体先降解成为 35nt左右的小左右的小RNA分子，然后他们分子，然后他们 通过序列互补与通过序列互补与mRNA结合，从而结合，从而 导致导致mRNA降解。降解。 果蝇：长度为果蝇：长度为2123nt的小的小RNA分分 子是引起子是引起RNA干扰现象的直接原因。干扰现象的直接原因。 这种小这种小RNA分子被称为小干扰分子

18、被称为小干扰RNA （small interfering RNA， siRNA）。 精选课件29 siRNAs Long dsRNA 在在RNA干扰中一个非常重干扰中一个非常重 要的酶是要的酶是RNaseIII核酶家核酶家 族的族的Dicer。它可与双链。它可与双链 RNA结合，并将其剪切成结合，并将其剪切成 2123nt及及3端突出的小端突出的小 分子分子RNA片断，即片断，即siRNA。 精选课件30 随后随后siRNA与若干个蛋白组成的，与若干个蛋白组成的， RNA引起的称之为引起的称之为RNA诱导沉默诱导沉默 复合体（复合体（RNA-induced silencing complex，

19、RISC）结）结 合，解旋成单链，并由该复合体合，解旋成单链，并由该复合体 主导主导RNAi效应。效应。RISC被活化后，被活化后， 活化型活化型RISC受已成单链的受已成单链的siRNA 引导（引导（guide strand），序列特），序列特 异性地结合在标靶异性地结合在标靶mRNA上并切上并切 断标靶断标靶mRNA，引发靶，引发靶mRNA的的 特异性分解。特异性分解。 精选课件31 与与RNAi有关的蛋白因子有关的蛋白因子 迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白 因子。 果蝇RISC中存在Argonaute2(AGO2)因子，AGO2蛋白的表达受 到抑制时，RNA

20、i效应缺失，即AGO2是果蝇RNAi机制的必须 因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性 （slicer activity），RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA 切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶（RNA helicase）也 被鉴定为参与RNAi机制的因子。 秀丽隐杆线虫（C. elegans）的RNAi中必须的因子有EGO1，这 是一种RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase)，植物中也存在 该蛋白同系物。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但 RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非必须的。 在不同物种之间RNAi机制的

21、基本框架虽然相同，但存在着微 妙差异。 精选课件32 精选课件33 RNAi作用的简单模型作用的简单模型 当当dsRNA导入细胞后，被一种导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶特异的核酸内切酶 识别，切割成识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核苷酸长的小片段，这些片段可与该 核酸酶的核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目结合结构域结合，并且作为模板识别目 的的mRNA。 识别之后，识别之后，mRNA与与dsRNA的有义链发生链互换，原先的有义链发生链互换，原先 dsRNA中的有义链被中的有义链被mRNA代替，从酶代替，从酶-dsRNA复合物中复合物中 释放

22、出来，而释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。则处于原先的有义链的位置。 核酸酶在同样位置对核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了进行切割，这样又产生了21- 23核苷酸长的核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继小片段，与核酸酶形成复合物，继 续对目的续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生进行切割，从而使目的基因沉默，产生 RNAi现象。现象。 通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE- 2,RDE-3和和Mut-7等等RNAi相关的基因。相关的基因。 精选课件34 RNAi研究的一般技术路线研究的一般

23、技术路线 精选课件35 精选课件36 何为何为siRNAs 越来越多的研究人员开始采用小分子干扰越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA （small interfering RNAs，siRNAs）来抑制特）来抑制特 定的哺乳动物基因表达。定的哺乳动物基因表达。 siRNA即为能够以同源互补序列的即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目为靶目 标并将其降解而介导标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链干扰途径的短片断双链 RNA分子。分子。 如何设计有效的如何设计有效的siRNA一直是当前一直是当前RNAi研究的热研究的热 点话题，不同的实验室有不同的结果。点话题，不同的实验室有不同的结

24、果。 精选课件37 一般设计原则一般设计原则 （1）从）从mRNA 的的AUG起始密码开始，寻找起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下二连序列，并记下 其其3端的端的19个碱基序列，作为潜在的个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显靶位点。有研究结果显 示示GC含量在含量在30%50%左右的左右的siRNA要比那些要比那些GC含量偏高的更为含量偏高的更为 有效。有效。 Tuschl等建议不要针对等建议不要针对5和和3端的非编码区（端的非编码区（untranslated regions，UTRs）。这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些）。这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这

25、些 UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复核酸内切酶复 合物结合合物结合mRNA从而影响从而影响siRNA的效果。的效果。 （2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等） 进行比较，排除那些和其他编码序列进行比较，排除那些和其他编码序列/ /EST同源的序列。例如使用同源的序列。例如使用 BLAST （3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序 列的列的siRNA，以找到最有效的，以

26、找到最有效的siRNA序列。序列。 精选课件38 负对照负对照 一个完整的一个完整的siRNA实验应该有负对照。实验应该有负对照。 作为负对照的作为负对照的siRNA应该和选中的应该和选中的siRNA 序列有相同的组成，但是和序列有相同的组成，但是和mRNA没有明没有明 显的同源性。显的同源性。 通常的做法是将选中的通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，序列打乱， 同样要检查结果以保证它和其他基因没有同样要检查结果以保证它和其他基因没有 同源性。同源性。 精选课件39 制备制备siRNA5siRNA5种不同方法的比较种不同方法的比较 精选课件40 制备制备siRNA5siRNA5种不同方法的

27、比较（续）种不同方法的比较（续） 精选课件41 可从可从mRNAmRNA和蛋白质两方面进行。和蛋白质两方面进行。 mRNAmRNA：RT-PCRRT-PCR；定量；定量PCRPCR；Northern Northern 杂交杂交 等。等。 蛋白质：蛋白质：WesternWestern杂交；杂交；ELISAELISA；免疫荧光等。；免疫荧光等。 细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数 的变化是的变化是RNAiRNAi效果最终和最大的体现。效果最终和最大的体现。 精选课件42 精选课件43 （1）在功能基因组中的应用）在功能基因组中的应用 在功能基因组研究中，需

28、要对特定基因进行功能丧失或降在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降 低突变，以确定其功能。低突变，以确定其功能。 由于由于RNAi具有具有高度的序列专一性高度的序列专一性，可以特异地使特定基，可以特异地使特定基 因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此RNAi可以作为可以作为 一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。 将功能未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，将功能未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，以反以反 向重复的方式由同一启动子控制表达向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体。这

29、样在转基因个体 内转录出的内转录出的RNA可形成可形成dsRNA，产生，产生RNA干涉，使目的干涉，使目的 基因沉默，从而进一步研究目的基因的功能，这种技术即基因沉默，从而进一步研究目的基因的功能，这种技术即 为为RNAi技术。技术。 根据所选用序列的不同，可将其分为根据所选用序列的不同，可将其分为编码区编码区RNAi和和启动启动 子区子区RNAi技术技术。 精选课件44 编码区编码区RNAi技术技术 自自19981998年在线虫中发现年在线虫中发现RNAiRNAi现象以来，以基因编码区为靶序列现象以来，以基因编码区为靶序列 的编码区的编码区RNAiRNAi技术已用于线虫功能基因组的研究。技术

30、已用于线虫功能基因组的研究。 最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺 或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达，产生或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达，产生 突变表型，但这种表型变化却不能遗传。突变表型，但这种表型变化却不能遗传。 这种早期的这种早期的RNAiRNAi技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的 功能，但由于细胞分裂造成功能，但由于细胞分裂造成dsRNAdsRNA的稀释，使得这种方法在研的稀释，使得这种方法在研 究成体的基因功能时有一定的局限性。究成体的基

31、因功能时有一定的局限性。 为弥补早期为弥补早期RNAiRNAi技术的上述不足，技术的上述不足，TavernarakisTavernarakis等对等对RNAiRNAi技术技术 进行了改进，进行了改进，将目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热激将目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热激 启动子控制在转基因生物中表达。启动子控制在转基因生物中表达。 热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形成热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形成 具发夹环结构的具发夹环结构的dsRNAdsRNA，从而产生，从而产生RNAiRNAi，使目的基因沉默。，使目的基因沉默。 精选课件45 编码区

32、编码区RNAi技术技术 这种改进的这种改进的RNAiRNAi技术与传统的技术与传统的RNAiRNAi技术相比，具有明显技术相比，具有明显 的优点：的优点： 首先转基因可以遗传给后代，有利于突变的分析；首先转基因可以遗传给后代，有利于突变的分析； 其次其次dsRNAdsRNA可以被诱导产生，可以被诱导产生，RNAiRNAi能够在发育特定阶段能够在发育特定阶段 出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成 为可能；为可能； 另外，当用细胞特异性启动子控制另外，当用细胞特异性启动子控制dsRNAdsRNA的表达时，可以的表达时，可以 研究特定基

33、因在不同器官中的功能。研究特定基因在不同器官中的功能。 Kennerdell J. R.Kennerdell J. R.和和CarthewR. W.CarthewR. W.用用GAL4/UASGAL4/UAS系统控制系统控制 dsRNAdsRNA在果蝇中的表达，实现了诱导性或细胞特异性控制在果蝇中的表达，实现了诱导性或细胞特异性控制 RNAiRNAi的发生。的发生。 精选课件46 编码区编码区RNAi技术技术 随着应用随着应用RNAi技术研究线虫功能基因组工作的开展，研技术研究线虫功能基因组工作的开展，研 究人员对该技术在植物中应用的可能性进行了探索。究人员对该技术在植物中应用的可能性进行了探

34、索。 加州理工大学的加州理工大学的Chuang C. F.和和Megerowitz E. M.使用此使用此 技术研究了拟南芥的技术研究了拟南芥的AG, CLV3, AP1, PAN四个开花相关四个开花相关 基因。基因。 结果表明使用结果表明使用RNAi技术可以产生功能丧失或降低突变体，技术可以产生功能丧失或降低突变体， 其表型与以前通过其它方法鉴定的突变体类似。其表型与以前通过其它方法鉴定的突变体类似。RNA原位原位 杂交表明，杂交表明，RNAi突变体的目的突变体的目的mRNA显著降低。显著降低。 该结果说明该结果说明RNAi技术亦可以成为植物功能基因组研究中技术亦可以成为植物功能基因组研究中

35、 的有力工具。的有力工具。 精选课件47 启动子区启动子区RNAi技术技术 M. F. Mett等证明等证明含有启动子区的含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成在植物体内同样被切割成 21-23核苷酸长的片段，这种核苷酸长的片段，这种dsRNA可使内源相应的可使内源相应的DNA序列甲基序列甲基 化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。 由于多基因家族的各成员之间高度同源，因而使用编码区由于多基因家族的各成员之间高度同源，因而使用编码区RNAi技技 术很难将各个成员区分开来研究，而多基因家族内的启动子序列通术很难将各个成员区分开来研究，而多基

36、因家族内的启动子序列通 常比编码区变化大，常比编码区变化大，采用启动子区采用启动子区RNAi技术有望将多基因家族的技术有望将多基因家族的 各个成员区分开来研究。各个成员区分开来研究。 这样综合编码区这样综合编码区RNAi技术和启动子区技术和启动子区RNAi技术的信息即可更全面技术的信息即可更全面 地了解多基因家族地各成员的功能。地了解多基因家族地各成员的功能。 RNAiRNAi现象现象存在的广泛性远远超过人们的预期，对此问题的深入研存在的广泛性远远超过人们的预期，对此问题的深入研 究结果将为进化的观点提供有力佐证。究结果将为进化的观点提供有力佐证。 精选课件48 启动子区启动子区RNAi技术技

37、术 与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比，与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比，RNAiRNAi技术具有明技术具有明 显的优点，它比反义显的优点，它比反义RNARNA技术和同源共抑制更有效，技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能更容易产生功能 丧失或降低突变丧失或降低突变。 而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，可以在发育的可以在发育的 不同时期或不同器官中有选择地进行不同时期或不同器官中有选择地进行，与，与T-DNAT-DNA技术造成的功能永久技术造成的功能永久 性缺失相比，这是更受科学家偏爱的。性缺失相比，这是更受科学家

38、偏爱的。 相对于基因敲除技术相对于基因敲除技术(knockout)(knockout)，RNAiRNAi具有快速、有效、容易操作和具有快速、有效、容易操作和 序列特异性强等优点，被称为基因抑制序列特异性强等优点，被称为基因抑制(knockdown)(knockdown)技术技术，是研究特定，是研究特定 基因功能的有效方法。某种程度上可以替代操作复杂和费用昂贵的基基因功能的有效方法。某种程度上可以替代操作复杂和费用昂贵的基 因敲除技术。与基因芯片等高通量基因筛选技术相结合，在哺乳动物因敲除技术。与基因芯片等高通量基因筛选技术相结合，在哺乳动物 细胞基因组学功能研究中将起重要作用。细胞基因组学功能

39、研究中将起重要作用。 作为一种新的、强有力的研究工具，作为一种新的、强有力的研究工具，RNAiRNAi在功能基因组学领域呈现在功能基因组学领域呈现 出巨大的应用前景，成为当今研究领域最引人注意的话题之一。出巨大的应用前景，成为当今研究领域最引人注意的话题之一。 精选课件49 （2）在基因治疗中的应用在基因治疗中的应用 治疗治疗HIV 感染感染 由于由于RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制，是机体中古老而天然的抗病毒机制，HIV病毒感病毒感 染是我们亟待解决的问题，将染是我们亟待解决的问题，将RNAi技术应用于艾滋病治技术应用于艾滋病治 疗是顺理成章之事。疗是顺理成章之事。 针对针对HIV病毒

40、研究有病毒研究有JacqueJacque等设计的抑制等设计的抑制HIV 1长末端重复长末端重复 序列、附件基因序列、附件基因vif和和nef表达的表达的siRNA，Lee等针对等针对rev转转 录子设计的录子设计的siRNA及及Novina等针对等针对HIV病毒病毒gag基因设计基因设计 的的siRNA，其基本策略都是选择其基本策略都是选择HIV病毒或宿主细胞基因病毒或宿主细胞基因 为靶点为靶点。 精选课件50 治疗治疗HIV 感染感染 然而，然而，RNAi治疗治疗HIV，应用于临床，有几个重要问题必须解决：，应用于临床，有几个重要问题必须解决： 、作用靶点的选择作用靶点的选择，siRNA对序

41、列要求非常严格，对序列要求非常严格，1个碱基的错配，个碱基的错配， 将大大降低将大大降低siRNA基因表达抑制作用。如果基因表达抑制作用。如果HIV逆转录酶有较高逆转录酶有较高 的错配率的错配率(1/1000个核苷酸每个复制循环个核苷酸每个复制循环)，就可能迅速导致所谓，就可能迅速导致所谓 siRNA逃逸突变的出现。感染个体中逃逸突变的出现。感染个体中HIV序列的多样性，为序列的多样性，为 siRNA的设计和合成增加了难度。的设计和合成增加了难度。 、如何有效导入如何有效导入siRNA。DNA质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载 体和脂质体等在培养细胞株中有良好的导入效

42、果，但在原代细胞体和脂质体等在培养细胞株中有良好的导入效果，但在原代细胞 中效果较差。中效果较差。 、增强增强siRNA在细胞中的稳定性。在细胞中的稳定性。为了防止细胞内为了防止细胞内RNA酶对酶对 siRNA的降解，可以用的降解，可以用DNA质粒和病毒载体将质粒和病毒载体将siRNA以发夹以发夹 (hairpins)的形式导入细胞内。的形式导入细胞内。 精选课件51 治疗肝炎病毒感染治疗肝炎病毒感染 Jude LiebermanJude Lieberman等已经成功地利用等已经成功地利用 RNAi技术治愈了实验鼠技术治愈了实验鼠 的肝炎。的肝炎。 他们干扰的目标是他们干扰的目标是“凋亡相关蛋白质（凋亡相关蛋白质（FAsFAs）基因）基因”。FAsFAs 存在于细胞表面，它能够启