PCR污染防治手册

1、PCR污染防治手册一、为什么要如此重视防治PCR污染聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种选择性体外扩增 DNA或RNA片段的 方法。扩增过程中，扩增的DNA产量是呈指数上升的。PCR产物的浓度一般为1013拷贝/ml， 而1mg人基因组DNA才含*106拷贝的单拷贝基因片段，因此使得PCR扩增反应的敏感性非常高。正是由于 PCR反应具有强大的扩增效率也导致其及易污染，极微量的PCR产物污染便可导致假阳性结果。 在应用HPV分型试剂盒的过程中，主要存在两个污染源：1标本间的交叉污染； 扩增产物的污染。其中以第二个污染源为最为常见，通过下面一个例子便可

2、认 识到PCR产物污染的严重性。在 100ml的反应管中可产生 1012拷贝个分子，若将这些分子 在一个标准奥林匹克游泳池 (50m*25 m *2m )内稀释后， ml 稀释液含有 400 拷贝的扩增分 子，远远超过了 PCR扩增反应检测数个拷贝的极限。因此，一定要注意产物残留污染的问 题，对临床实验室尤应如此。二、PCR污染的来源对于HPV分型检测试剂盒来说，污染的来源主要是PCR扩增产物的污染，常见的污染途径有两种， 一是气溶胶污染 ，在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶， 在操作时比较剧烈 地摇动反应管， 开盖时、 吸样时及受污染的进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗

3、粒可含 48000 拷贝， 因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。二是PCR产物的粘带污染，此类污染多是因为没有严格遵守分区规定，造成PCR产物扩散到样品抽提或 PCR 实验室。实验大衣、手套、移液枪、枪头、枪头盒和试管架都是常见的粘带污 染源。污染发生时，这些地方是重点怀疑的地方。三、PCR污染的追踪如果不慎发生或者怀疑有污染发生，可以设计一个简单的小实验以确认污染源。用HPV的PCR扩增系统扩增如下模板：A:水-作为阴性对照，如果此管扩增出阳性，则可以判定为试剂已经污染或者是气溶胶 污染。B:阳性样品-作为阳性对照，验证实验是否成功。C-X:-所要检查的地方，用无菌水浸泡过的灭菌棉签

4、擦拭可疑污染源，去离子水浸泡后作为模板。常见的需要检查的地方为各个 实验台面、移液枪、枪头、枪头盒、试管架、冰 箱内、冰箱把手、水浴锅、抽提的相关试剂以及相关人员的办公桌。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR 产物的气溶胶造成的， 此时就应该更换实验场所， 若条件不允许， 可以在室内加装紫外灯管照射 过夜且彻底通风并停止几天的实验。四、PCR污染的预防进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。1、划分操作区：实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行，最基本的一个

5、原则就是 PCR扩增及杂交检测区的东西是属于污染源，绝对不可以带到前两个区去。A:样品制备区，包括扩增摸板的制备；B： PCR加样区，包括反应液的配制和PCR扩增；C： PCR扩增及杂交检测区,杂交操作过程在这个地方完成。分区的注意事项：各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备t PCR扩增t产物分析t产物处理。样品的保存应该在上述三个区以外单独的区域。各个区域的物品及衣服必须严格遵守单向的原则。各个区域必须要自己单独的实验衣，实验时必须戴上手套。每个区域要有自己单独的实验设备。以下是常见的分区方式：PCR加样区样品制备区PCR扩增及杂交检测区样品制备及PCR加样区

6、PCR扩 增及杂 交检测 区缓冲间缓冲间-1-缓冲间图一PCR加样区样品制备区PCR扩增及杂 交检测 区图一图三PCR扩增及杂交检测区样品制备区走廊PCR加样区图图四2、实验操作的注意事项：A: 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；B: 使用一次性吸头，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中， 避免气溶胶的污染；C: 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不 小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；D: 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR 反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；E:尽可能

7、用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染， 最好使用可替换或高压处理的加样器。 如没有这种特殊的加样器， 至少应经常的擦洗 枪外表及枪管内。3、严格对PCR产物的处理：PCR产物包括杂交产物，在读数结束后，杂交产物或PCR产物应该用一次性密闭容器 （垃 圾袋、 自封袋） 装好后丢弃或者倒至 1 mol/L HCl 溶液或 1:25 的 84 消毒液中， 浸泡半小时以 上后再行丢弃。如果有产物溅在了桌面或器具上，应立即用 1 mol/L HCl 溶液或 1:25的 84 消毒液擦拭。4、根据实验室情况建立完善的日常 PCR防治制度并严格执行 事在人为，制度执行

8、了才能达到它应有的效果，根据实验室实际情况建立制度后必须严格执行，绝对不能因为图方便放松警惕。五、PCR污染后的处理1. 如果是器具的污染， 可以对可疑器具用 1mol/L 盐酸或者 1:25的 84消毒液擦拭或浸泡。 如果台面污染，可能的话用紫外灯照射过夜。2. 如果是试剂污染请更换试剂，但试剂污染一般伴随着器具污染，务必查找出污染源并及 时处理。3. 对于被污染的区域，最好更换实验场所，可能的话应 加装紫外灯照射过夜，实在不行也 必须加强通风几天，并停止实验后检测是否还有污染 。六、实验室实例：1、分区情况：实验室分成两个区，类似图二所示。因为条件所限，没有设置缓冲区，但两个区相隔较 远，

9、可以有效避免汽溶胶的传播。2、规章制度：A :定期监测： 使用棉签涂抹的方法，一个月一次定期监测，监测地点为：超净台桌面、超净台内枪（包括枪吸孔内和枪体） 、超净台枪头盒、超净台内常用 PE管架及PCR管架， 冰箱冰柜把手（两台） 、冰箱内部（每个冰箱 3个棉签包括冰箱内部表面和随机的冰箱内试 剂盒）、常用试剂试剂盒、试剂表面。抽提桌面、抽提区枪（包括枪吸孔和枪体）、抽提区常 用试管架、 抽提区枪头盒、 水浴锅水、 沸水浴锅水， 相关试验人员办公室桌面、 鼠标、 键盘。 需要做的工作：安排指定人员每月进行一次监测。每次监测填写记录表（见附表） 。B：物流：严格单向物流，只允许从 A区（样品制备

10、及 PCR加样区）至U B区（PCR扩增及杂交检测区）的物品流动。 B区任何物品（PCR管架、PE管架）进入A区前必须经过处理（1:100） 的 84 消毒液浸泡半小时） 。各区物品单独使用，不允许交叉使用。需要做的工作：A、物品A-B前处理（84浸泡后洗涤）C人流：抽提、PCR以及B区必须要有单独的实验服，进入A、B两区进行实验必须穿上各自的实验服，不允许将实验服穿至另一个区。 （注：如果进入一个区不是为了实验，可以不 穿实验服，但绝对不允许穿另一个区的实验服进入） 。实验服两周洗涤一次，但切记两个区 的衣服不要在同一批洗，分成两次洗，可以这周洗涤这个区的下周洗涤另一个区的。需要做的工作：指

11、定一周轮一周洗涤衣服，各人衣服各人负责。D:实验规程：1、实验时必须戴橡胶手套或薄膜手套；抽提桌面实验完成后用84擦洗；PCR实验室每天 （实验量少的话可减少） 晚上用紫外照射；如果在实验过程中发现有样品（包括 抽提前和抽提后）或 PCR产物必须立即用84擦洗；在B区如果手接触过桌面或者其它有可 能污染有PCR产物的地方（枪、Luminex仪器等）必须尽快洗手；定期处理：各区枪每周用1： 25 的 84 消毒液擦洗（不需要拆开，主要是枪体和吸样孔内） 。各区试管架每周用 1： 25 的 84 消毒液擦洗。各桌面每周用 1： 25 的 84 消毒液擦洗。冰箱把手及外表每周用 1： 25 的 84

12、 消毒液擦洗。水浴锅及沸水浴锅每周换一次水。相关工作人员办公桌每周用1 ： 25 的84 消毒液擦洗需要做的工作：A、实验（特别是杂交检测），发现有产物溅出立即擦洗。B、勤洗手。C、PCRD、安排指定人员每周擦洗指定位置。E、PCR实验室做完实验打开紫外。E:PCR产物处理：准备保鲜袋，每次的 PCR产物（包括杂交产物和 PCR产物）丢弃前必须用保 鲜袋扎好后再丢弃； 杂交检测试验区准备可以装保鲜袋并有盖子的垃圾桶， 使用过的枪头一 律扎好后丢弃；电泳旁边的冰箱为 PCR产物临时存放区，严禁 PCR产物开盖存放，定期（- 个月 ）清理。需要做的工作：A:严格操作，把 PCR产物作为高危险物品小

13、心处理。B:指定日期清理 PCR产物。F:发生污染后的处理： 如果怀疑有污染发生，执行监测程序，对于重点怀疑对象可以多作几 份。找到污染源后，桌面一用84擦洗后紫外照射一个晚上，枪一用 84擦洗（拆开）后紫外 照射过夜，枪头盒、试管架 84 擦洗后紫外照射过夜，枪头丢弃，试剂丢弃，衣物 用 84 浸泡后洗涤干净。冰箱把手 84 擦洗后紫外照射过夜。冰箱内部 84 擦洗如果污染 严重的话流水冲洗后 84擦洗， 试剂盒 84擦洗或流水冲洗。 处理完后执行监测程序检查污 染情况。PCR污染情况监测表试验日期 试验人员序号编号地点试验结果备注1超净台桌面2超净台枪枪吸孔内和枪体3超净台枪头盒4超净台内EP管架及PCR管架5冰箱把手6冰柜把手7冰箱内部18冰箱内部29冰箱常用试剂试剂盒10冰柜内部111冰柜内部112冰柜常用试剂试剂盒13PCR试剂表面14抽提桌面15抽提区枪包括枪吸孔和枪体16抽提区常用试管架17抽提区枪头盒18水浴锅水19沸水浴锅水20试验人员1办公室桌面21试验人员1鼠标、键盘22试验人员2办公室桌面23试验人员2鼠标、键盘24试验人员3办公室桌面25试验人员3鼠标、键盘26试验人员4办公室桌面27试验人员4鼠标、键盘28试验人员5办公室桌面29试验人员5鼠标、键盘30阳性对照31阴性对照试验方法：准