2021血液RNA提取

1、血液RNA提取完全可以,我曾经全血标本6个小时后分离白细胞提RNA,结果很好.因为你提的是白细胞内的RNA,因而在细胞没破损前,一般情况下不会出现RNA的降解,当你开始加TIIZOL时,你的所有器材的处理尤其重要,因而放心的做吧,本人长期从事白血病融合基因的检测，曾经使用4度保存3天的血液进行RNA提取，效果同样非常满足，目前使用的一次性耗材基本上不用DEPC水处理，只要注重规范操作，按TIIZOL说明书操作，提取的RNA 质量同样非常的高。附上本试验室的简易操作程序：1外周血及骨髓（抗凝）利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞（1）外周血送检需5-10ml抗凝血，骨髓需1-3ml抗凝，常温送检(样

2、本量根据单个核细胞的数量来确定，一般需要5x106单个核细胞以上)。（2）加进等体积无菌PBS于外周血及骨髓中充分混合，形成细胞悬液；（3）加进5ml淋巴细胞分离液于另一离心管。（4）吸取5ml细胞悬液沿管壁轻轻加进到淋巴细胞分离液表面（注重勿与淋巴细胞分离液混合）。离心1500rpm 20min。（5）用吸管轻轻吸出界面层（白膜）中的MNC进另一离心管中。无菌冷PBS洗2次，最后1次洗涤可以将细胞悬液移进EP管中，离心往上清直接或加进TRIzol混匀后-70冻存，或直接提取RNA（可以先进行细胞计数以保证细胞数）。2利用Trizol的方法提取细胞总RNA（参照Invitrogen公司Triz

3、ol说明书）以下步骤要严格防止RNA酶降解RNA，所使用的离心管和枪头要用0.1% DEPC水处理24h，然后高压灭菌并烤干。尽量快地进行操作，减少RNA降解。（1）先加1ml Trizol于1107细胞中，若冻存细胞直接加进Trizol，不需解冻，吹打裂解后室温静置5-10min。（可-70，1月）（2）加进0.2ml氯仿（三氯甲脘），剧烈震荡（vigorously）15s，室温静置2-3min。（3）在4下1,2021g离心15min。（4）小心吸出上清水相约500l移进另一离心管（注重不要抽到蛋白层），加进500l异丙醇（专用），颠倒混匀（不要太剧烈），室温静置10min（RNA沉到底部

4、）。（5） 41,2021g离心10min，倒往上清液，底部可见针尖大小白色物质（RNA）。（6）加进1ml 70%乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇。（7） 47500 g离心5min，往除乙醇（尽量用枪头吸干净）后晾5-10min，不要太干,否则难以溶解。RNA可以在70%乙醇中-80保存1年。最新血液RNA提取！1、血液收集：最好用肝素抗凝，因为EDTA可能会对后续的pcr有影响，因为EDTA会螯合pcr 反应中的Mg2+，也可以根据实验的具体要求瞧选择怎么样的抗凝。2、白细胞的分离：一般选择1.5ML新鲜的血液，或选取冷冻的5ML的血液（冷冻血液的保存：先液氮速冻，再置于-80保存），或隔天的5

5、ML的血液，就可以分离到比较多的白细胞了。可以选择溶红素（BD公司的）或红细胞裂解液按一定的比例（1：3或1：5）分离白细胞，一般在3500转离心6分钟即可，效果不好的话，可以重新裂解一次。分离得到的白细胞，马上用质量好的TRIZOL裂解白细胞，假如不能马上提取的话，可以置于-20或-80保存，过后抽提。3、RNA抽提：选择一般的组织或细胞的RNA抽提试剂盒即可。本方法简单，省钱，经过大量的实验表明是可行的，并且本人用进口的血液RNA抽提试剂盒都不能跟上述方法比！在用血液标本进行基因表达研究时，需要及时把新鲜血液中有核细胞的RNA提取出来。全血还不能直接放到-80保存，即使在-80保存，全血中

6、的RNA也轻易发生降解。传统的提取新鲜全血RNA方法是把先把有核细胞从全血中分离出来，需要加白细胞分离液、离心等步骤，比较繁琐，在临床医院往往难以实施。作为RNA提取的领先公司，北京艾德莱的研发人员在05年国内首家研发成功液体样本RNA提取试剂RN01 TRIpure LS(LS 意思是Liquid Sample。可以直接裂解全血提取RNA，避免了先裂解白细胞可能导致的RNA降解，也大大简化了操作步骤。操作时间比普通方法节约至少三分之一。在临床上采血时，可以先把TRI pure LS Reagent分装750ul到1.5ml的离心管中。血液样本可以先抗凝处理（EDTA抗凝或者其他抗凝方式都可）

7、，然后取250ul全血样品加进到750ul的TRI pure LS Reagent中，用移液枪反复抽打并振荡混匀，在室温裂解5min-10min，直至血细胞充分发生裂解。然后可把此裂解液保存在-20下可达2个月，-80可达半年。在此期间，可以把该裂解液运输到北京艾德莱生物公司进行RNA的抽提，运输过程可以41天，-20一周。在全血RNA提取试剂直接裂解全血的基础上面，北京艾德莱又进一步简化了操作，增加了离心柱操作，推出了RN23 RNAliquid 超速全血（液体样本）总RNA 提取试剂盒。点此详见。经过离心柱子吸附漂洗，除了进一步简化了操作步骤外，更适合临床高通量操作外，还极大的提高了RNA

8、的纯度。除了一般常见的RT PCR 或者荧光定量PCR外，RNA纯度可以满足最严格的实验要求比如基因表达谱芯片要求， 1ml的全血可以得到10g左右的total RNA，足够满足芯片分析的需要需要预备的试剂氯仿、异丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free 的水1.匀浆处理（Homogenization）直接取新鲜的血液，加进3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000 rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200l血液收集的白细胞沉淀加进1ml TRIzol。2分层（Phase Separation）a. 样品加进TRIzol后，

9、室温放置5min，使样品充分裂解。注：如不进行下一步操作，样品可放进-70长期保存。可选步骤：4 12,000 rpm 离心10分钟，取上清。假如样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心往除。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除往。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。b. 每1ml TRIzol加进200l氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相。3RNA沉淀（RNA Precipitation）a. 4 12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（通常可吸取550l）转移到新管中。注：

10、小心吸取水相，千万不要吸取中间界面，否则将导致RNA样品中有DNA 污染。b. 在上清中加进等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4 12,000 rpm 离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。4RNA漂洗（RNA Wash）a. RNA沉淀中加进1ml 75%乙醇（用RNase-free水配制），热和振荡离心管，悬浮沉淀。每1ml TRIzol加进1ml 75乙醇。b. 4 5,000-8,000 rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注重不要吸弃沉淀。室温放置1-2分钟晾干沉淀。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。5.溶解RNA（Rediss

11、olving the RNA）沉淀中加进50-100l RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70保存。注重事项1. 经常更换手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。2. RNA在TRIzol试剂中不会被RNase污染，但在氯仿分相后的上清中已经没有了RNase的抑制剂，所以分相后的所有操作要非凡小心，保证使用的离心管和枪头都是RNase-free的。3. RNase-free水的配制方法：将水加进干净的玻璃瓶中，加进DEPC至终浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌；RNase-free的塑料和玻璃器皿处理方法：玻璃器皿可在150烘烤4小时；塑料器皿可在0.5

12、M NaOH中浸泡10分钟，然后用DEPC水彻底清洗，再灭菌，即可往除RNase。6. 不同组织或细胞中提取RNA预期得率血液 (35 g/ml人全血).RNA纯度及浓度检测完整性 RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：1.2%胶；0.5TBE电泳缓冲液；150v，15分钟）检测完整性。由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV 下应能瞧到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16S rRNA。RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。纯度 OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，OD260/OD280值（10mM Tris, pH7.5）在2.0左右。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一