crispercas基因靶向技术

1、CRISPR技术技术 CRISPR/Cas9 System ?1987年，日本大阪大学（ Osaka University ）在对一种细菌 编码的碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase ）基因进行研究时， 发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的 DNA 片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的 两端还存在一段不太长的特有的序列，正是这个特有的序列 以后被证明发挥了 DNA的定向识别功能。 2013 以后，研究者们在包括 science 和nature biotechnology 等著名杂志上发表多篇文章介绍 CRISPR-Cas 系统，并且已成功在人类、小

2、鼠、斑马鱼等物种上实现精确 的基因修饰。 CRISPR-Cas 主要由两部分组成： 识别切割 Cas（CRISPR associated ）： 存在于CRISPR位点附近， 是一种双链DNA核酸酶。 CRISPR-Cas 是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系 统。CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats ）， 被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器， 是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者 的基因武器。后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基 因武器，可以用来删除、添加

3、、激活或抑制其他生物体的目标基因， 这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫 和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用 CRISPR担当细菌的防护罩 ? CRISPR 簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组 中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导 区(Leader) 、多个短而高度保守的重复序列区 (Repeat) 和多个间隔区(Spacer) 组成。 ? 前导区一般位于CRISPR 簇上游，是富含AT长度 为300500bp 的区域，被认为可能是 CRISPR 簇的启动子序列。重复序列区长度为 2148bp， 含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间

4、 被长度为2672bp的间隔区隔开。Spacer 区域 由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有 同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别， 并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的 目的。 ? 通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近 存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质 均含有可与核酸发生作用的功能域 (具有核酸酶、 解旋酶、整合酶和聚合酶等活性 )，并且与 CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为 CRISPR 关联基因(CRISPR associated)，缩写 为Cas。 ? 目前发现的Cas包括Cas1Cas10等多种类型。 ? Cas基因与CRISPR

5、共同进化，共同构成一个高度 保守的系统。 CRISPR的工作原理的工作原理 ? 当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在 前导区的调控下，CRISPR 被转录为长的 RNA前体(Pre RISPR RNA ，pre- crRNA) ，然后加工成一系列短的含有保守 重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识 别并结合到与其互补的外源DNA序列上发 挥剪切作用。 CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫，而这种特异性是 由间隔序列（spacer）决定的。 如果改造成我们的目的 基因，就可以定向的进基因，就可以定向的进 行基因修饰 ? 目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型

6、 即I型、II型和III型，它们存在于大约40%已 测序的真细菌和90%已测序的古细菌中。 ? 其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及 向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究 中最深入的类型。 ? 在II型系统中pre-crRNA 的加工由Cas家族中的Cas9单独 参与。 ? Cas9含有RuvC和HNH2个独特的活性位点，在crRNA 成熟和双链DNA剪切中发挥作用。此外，pre-crRNA 转 录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans- activating crRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发 Cas9和双链RNA特异性RNaseIII核酸

7、酶对pre-crRNA 进 行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复 合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA 双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链 保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪 切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链， 最终引入DNA双链断裂(DSB)。 ? CRISPRCas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游 邻近的PAM区(Protospacer Adjacent Motif) 的5 -GG- N18-NGG-3特征区域中的NGG位点，而这种特征 的序列在每128bp的随机DNA序

8、列中就重复出现一 次。研究结果表明，Cas9还可以剪切线性和超螺 旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶。 ? 由于由于crRNA参与并且起到精确导向的作用，所以参与并且起到精确导向的作用，所以 CRISPRCas9打靶系统也被称为打靶系统也被称为 RNA导向导向(RNA guided)打靶系统。打靶系统。 Limitations of the CRISPRi method First, the requirement for an NGG PAM sequence for S. pyogenes Cas9 limits the availability of target sites in t

9、he genome. And recent studies have suggested that the S. pyogenes Cas9 protein could partially recognize an NAG PAM, which might increase both the number of targeta -ble genome sites and that of potential off-target sites. Second, the targeting specificity is determined only by a 14-nt- long region

10、(the 12 nt of the sgRNA and the 2 nt of the PAM), which might confer off-target effects in organisms with large genomes. The theoretical sequence length for unique targeting with a 14-nt recognition sequence is 268 Mb (414). Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. ? 一种用来编辑基因组中DNA指令

11、的强大科学 工具现在也可以应用于RNA。来自加州大学 伯克利分校和劳伦斯伯克利国家实验室的 一个研究人员小组，证实借助于一种方法 可以编程CRISPR/Cas9蛋白复合物在序列特 异性的靶位点识别并切割RNA。这一研究发 现有可能改变RNA功能研究的模式，为检测、 分析和操控RNA转录物铺平了道路。相关论 文发表在9月28日的Nature杂志上。 ? 论文核心：就像可以利用Cas9以一种序列特 异性方式来切割或结合DNA一样，RCas9可 以一种序列特异性方式切割或结合RNA。 ?Cas9之所以可能具有基因组编辑能力是因为 PAM的存在，PAM标记出了切割的位点，并激 活了Cas9酶的切割活性。在这项最新的研究中， Doudna、Mitchell和合作者们证实， 以一种相似的方式PAMmers还可以促进对靶 ssRNA的位点特异性内切核苷酸切割 ? 尽管RNA干扰已被证实可用于操控某些生物 体内的基因调控，我们仍抱着强烈的兴趣 开发出了RCas9这一基于核酸的RNA识别系 统。现在我们清楚了RCas9的RNA识别分子 基础，就只需要设计并合成出一条匹