miRNAs与破骨细胞分化相关的骨代谢疾病.doc

1、最好的资料送给现在奋斗的你！加油！mi RNAs 与 破 骨 细 胞 分化相关的骨代谢疾病2020年4月miRNAs 与破骨细胞分化相关的骨代谢疾病 本文关 键词：代谢，分化，细胞，疾病，相关miRNAs 与破骨细胞分化相关的骨代谢疾病 本文简 介： miRNAs 是长度约 22 个核苷酸的小型、单链、非编码 核糖核酸，是最重要的基因调节因子之一 1.据最新 21.0 版 miRBase数据库统计，从第 1个 miRNAlin-42 于1993年发 现至今，已发现的 miRNAs 达 28645 条，几乎分布于所有的 真核生物和部分病毒中，其中人类有 4552 条。虽然编码 mmiRNAs 与

2、破骨细胞分化相关的骨代谢疾病 本文内 容：miRNAs 是长度约 22 个核苷酸的小型、 单链、非 编码核糖核酸，是最重要的基因调节因子之一 1.据最新 21. 0 版 miRBase 数据库统计，从第 1 个 miRNA lin-42于 1993 年发现至今，已发现的 miRNAs 达 28 645 条，几乎 分布于所有的真核生物和部分病毒中，其中人类有 4 552 条。虽然编码 miRNAs 的基因只占人类基因组数量的 1% , 但可调控超过 1/3 的蛋白编码基因 3.miRNAs 除可通过 与靶基因 mRNA 的 3UTR 或 5UTR 端的特异序列结合 外，也可在蛋白翻译的延伸和终止

3、阶段与多核糖体一起介导mRNA 翻译的抑制效应 4, 实现对靶基因的转录后水平调 控。甚至在应 激环境下 ， miRNAs 能提高 基因的表 达 5.miRNAs 与靶基因组成一个复杂的调控网络，调节细胞 增殖、分化与凋亡，参与个体发育、机体代谢等过程，控制 细胞及个体的重要生命活动。miRNAs 与破骨细胞分化 miRNAs 在骨代谢方面 的研究目前主要集中于调控成骨细胞分化， 但最新研究表明 miRNAs 还参与调控破骨细胞的分化和活性。 破骨细胞是由 造血干细胞的单核 -巨噬细胞前体分化而成的唯一具有骨吸 收活性的多核细胞， 在骨微环境的动态平衡中发挥着举足轻 重的作用。转录因子在破骨细

4、胞分化过程中扮演着不可或缺 的角色，而 miRNAs 的靶分子大多是在生长发育或细胞分 化中起重要作用的转录因子 mRNA.Sugatani 等6 在破骨前体细胞中利用 siRNA 干 扰 miRNAs 合 成 的 重 要 因 子 DGCR8 ( digeorge syn-drome critical region gene 8 ) 、 Dicer 、 Ago2 ( argo-naute2) ,miR-223 生成明显减少， 显着降低破骨细 胞相关转录因子表达并阻遏破骨细胞形成，从而抑制骨吸 收。在最新的一项研究中， Sugatani 等 7发现 DGCR8 敲 除的破骨细胞特征性标记物和关键

5、转录因子均受到抑制， 而 在 CD11b+-cre / Dicer KO 小鼠中，成骨细胞数量和活性并 未受影响， 但因破骨细胞数量和活性的下降， 导致骨硬化病 的发生， 再次证明参与 miRNAs 合成的 DGCR8 对破骨细 胞 分 化 的 重 要 性 。 Mizoguchi 等 8 发 现 cathepsin K-cre/Dicer KO 小鼠体内和体外形成的破骨细胞数量及活 性下降，骨组织 RT-PCR 显示 TRAP ( tartrate-re-sistant acid phosphatase) 、NFATc1 ( nuclear factor ofactivated T cells

6、 1 ) 、Ephrinb2 受到不同程度的抑制； BMMs ( bone marrow-derived macrophages/mon-ocytes) 经 RANKL ( receptor activator of nuclear fac-tor kappa-B ligand) 诱导 24 h 后， Dicer KO 组 miR-155 显着下降。研究结果证明 这些因子在 miRNAs 的生物合成中发挥着重要作用，从而 影响破骨细胞的分化。Sugatani 等 92007 年发现破骨细胞中 miR-223 表达低于破骨前体细胞， 且 pre-miR-223 过表达可以完全抑 制 RAW264

7、. 7 向破骨细胞分化。另一项研究却发现，瞬时 转染反义 miR-223 的 RAW264. 7 显着抑制向破骨细胞分 化6, 提示 miR-223 对破骨细胞分化有双向调节作用， 其作 用方式可能与其在细胞的表达水平有关。 进一步研究证明了 一 个 正 反 馈 通 路 PU. 1/miR-223/NFI-A/M-CSFR: 即 M-CSF ( macrophage colony stimulating factor)诱导的 PU.1 上调 miR-223,miR-223 靶向负调控 NFI-A ( nuclear factor I-A ) ,NFI-A 下 调 引 起 M-CSFR ( ma

8、crophage colony-stimulating factor receptor) 表达增加， 进而促进破骨 细胞分化。 Li 等10在观察抑制 miR-223 活性以治疗 CIA ( collagen-induced ar-thritis ) 小鼠有效性的研究中发现， 慢转 miR-223 靶序列可有效抑制 miR-223 活性，进而上调 NFI-A 表达，阻遏 M-CSFR 表达，降低破骨细胞数量，增 加骨密度，改善类风湿症状。Mann 等 11 研究了 miR-155 在 RAW264. 7 细 胞向巨噬细胞和破骨细胞分化中的作用。 向巨噬细胞分化时 miR-155 表达显着上调，

9、向破骨细胞分化时 miR-155 表达 明显下调。在 RAW264. 7 中过表达 miR-155,可显着抑制 TRAP+破骨细胞数量和骨吸收活性， 并可影响破骨细胞早期 的融合，证实 miR-155 在调控破骨细胞分化中发挥着重要 作用。在 后 续 的 实 验 中 ， 过 表 达 miR-155 可 抑 制 GPNMB 、MITF ( microphthalmia-associated transcription fac-tor) 、PU. 1 等表达； 而通过干预使 MITF 过表达则 可修复 GPNMB 的 mRNA 表达，荧光素酶活性报告支持 miR-155 与 MITF 的 3UTR

10、 配 对 。 此 项 研 究 证 明 了 miR-155 可以通过下调 MITF 和 PU. 1 而抑制 GPNMB 和 TRAP 表达，从而阻遏破骨细胞分化及骨吸收活性，促 进巨噬细胞分化。 Zhang 等12 在研究干扰素 抑制破骨 细胞分化的实验中发现， 干扰素 可诱导 miR-155 上调， 而 miR-155 可靶向抑制 MITF 和 SOCS1 ( suppressor of cytokine signa-ling 1) 表达以抑制破骨细胞分化。 以上研究 都表明 miR-155 在破骨细胞分化过程中的重要作用。Sugatani 等13 在研究 RANKL 诱导 BMMs 向 破骨

11、细胞分化的 miRNA 表达谱时，发现有 33 个 miRNAs 下调， 38 个 miRNAs 上调， miR-21 是两个显着上调的 miRNAs 之一。 c-Fos 和 PU. 1 可以诱导 miR-21 生成，通 过 ChIP ( chromatin immunoprecipi-tation ) 证实 c-Fos 可 与 miR-21 启动 子结合。正 常表达 miR-21 的细胞 中 PDCD4 ( programmed celldeath 4) 没有蛋白表达，却有 mRNA 表达，而在慢转反义 miR-21 的细胞中具有 PDCD4 蛋白表达，提示 miR-21 可以通过转录后负向

12、调节靶基因 PD-CD4 的表达。以上研究结果揭示了调控骨髓源性单核巨 噬细胞系向破骨细胞分化中 c-Fos/miR-21/PDCD4 这一正 反 馈 通 路 。 Mizoguchi 等 14 通 过 对 RANKL 和 未 经 RANKL 诱导 的 BMMs 行 miRNA 阵 列 分 析， miR-31 在 RANKL 诱导 24h 后显着上调，提示 miR-31 可能参与破骨细胞的分化。当使用 miR-31 拮抗剂时， Phal-loidin 染 色显示 actin 环受到损坏呈簇状小环，而利用 RhoA 抑制 剂可以修复 miR-31 拮抗剂对 actin 环的损伤，显示 RhoA 为

13、 miR-31 靶基因。在分析 TNF- ( tumor necrosis factor alpha) 对破骨细胞分化影响时， Kagiya 等15通过对 TNF 和 RANKL 共处理和单独 RANKL 处理 RAW264. 7 细胞行 miRNA 阵列比较显示，新发现一个 miR-378 在破 骨细胞分化过程中上调，共处理组以miR-21、 miR-29b、miR-146a、miR-155 和 miR-210 上调最为显着。Lee 等16 采用 qRT-PCR 研究发现 miR-124 表 达 可 随 BMMs 经 RANKL 诱 导 时 间 的 延 长 而 降 低 ， TargetSca

14、n 显 示 人 和 小 鼠 NFATc1 的 3 UTR 可 与 miR-124 完全匹配，细胞实验显示转染 pre-miR-124 可以 明显抑制 NFATc1 蛋白表达，而过表达 NFATc1 可以修复 miR-124 对破骨细胞的阻遏作用。 后续实验还发现，miR-124 还可能通过上调 DC-STAMP 影响细胞融合， 下调 RhoA 和 Rac1 可抑制破骨前体细胞的增殖和迁移能力。Guo 等17发现破骨细胞分化过程中 miR-125a 表 达逐渐降低， 过表达 miR-125a 可以抑制破骨细胞分化， 而 抑制 miR-125a 表达则促进破骨细胞分化。靶 基 因 软 件 预 测

15、显 示 TRAF6 ( TNF receptor-associat-ed factor 6) 的 3 UTR 可与 miR-125a 不 完全匹配，经荧光素酶报告基因实验证实 miR-125a 靶基因 为 TRAF6.EMSA 和 ChIP 显示 NFATc1 可与 miR-125a 的 启 动 子 结 合 抑 制 其 生 成 ， 过 表 达 NFATc1 可 以 抑 制 miR-125a 生成，而沉默 NFATc1 表达则增加 miR-125a 生 成。以上结果阐述了一个 TRAF6 / NFATc1 /miR-125a 生物 反馈过程，即： RANKL 与破骨细胞质膜上的 RANK ( r

16、eceptor activator of nuclear factorkappa-B) 结合诱导 TRAF6 表达， TRAF6 引发上调的 NFATc1 阻遏 miR-125a 生成，而 miR-125a 则在转录后水平抑制 TRAF6 的蛋白表 达。miRNAs 与破骨细胞分化相关的骨代谢疾病研究 证明 miRNAs 参与破骨细胞分化的调控，而破骨细胞分化 状态的异常是绝经后骨质疏松症、 骨关节炎、 类风湿性关节 炎、骨肿瘤形成和肿瘤骨转移等骨代谢疾病发生的重要病因 机制。 Ou 等18利用深度测序和 iTRAQ 蛋白组学分析了 CLCN7( A G) 突变骨质疏松患者的外周血单核细胞，

17、显示差异表达的 miRNAs 有 123 种，蛋白质有 173 种， 生 物 信 息 学 分 析 发 现 miR-320a 与 ARF1( ADPribosylation factor 1 ) 有一一对应关系， 293T 细胞 进一步证实了 miR-320a 可反向调控 ARF1.Wang 等19 在 胫骨平台骨折预后影响因素的研究中发现，阻遏 miR-9 和 miR-181a 可以促进破骨前体细胞 RAW264. 7 的迁移能力 和破骨细胞的存活率。Sugatani 等20 发现雌激素可抑制 miR-21 生成， 造成上调的 FasL ( fas ligand) 与 Fas 结合，介导破骨

18、细胞的凋亡。而绝经后雌激素匮乏可引起 miR-21 过表达致 破骨细胞凋亡减少、骨吸收过度活跃。Wang 等21 研究发现低 BMD 的绝经后妇女 PBMCs( peripheral blood mononuclear cells) 中 miR-133a 表达上调，提示人外周血单核细胞中 miR-133a 可促进其向 破骨细胞分化，可能是绝经后骨质疏松症发生的一个重要机 制。 Cao 等22最近对于白种人的类似研究中也发现，低 BMD 的绝经后妇女 miR-422a 表达明显上调，提示了 miR-422a 作为绝经后骨质疏松生物标志物的可能性。 此外， Chen 等23 应用 miR-NA 芯

19、片和 qRT-PCR 验证发现绝经 后骨质疏松症患者 CD14+PBMCs 中 miRNAs 表达谱的 差异，其中以 miR-503 表达下调最为明显，骨量正常的绝 经 后 女 性 CD14+PBMCs 可 表 达 miR-503, 降 低NFATc1mRNA 以抑制破骨细胞分化； 而抑制 miR-503 表 达则可明显上调 NFATc1 mRNA 表达、促进破骨细胞分化。 动物实验结果也提示： 正常小鼠中抑制 miR-503 表达可导 致骨吸收增强、骨量下降、骨微结构破坏； 而在去卵巢小 鼠中恢复 miR-503 表达可导致骨密度增加、 骨微结构改善。 RNA22 预测并经荧光素酶报告基因显

20、示 miR-503 可与 RANK 的 3UTR 不完全匹配，抑制 RANK 的翻译。Nakasa 等24 在研究 PBMCs 中 miRNA 的表达 水平与类风湿性关节炎骨破坏关系时发现， 转染 ds-miR146a 可抑制 c-Jun、PU. 1、NFATc1 的表达， 降低 TRAP （ + ） 破骨细胞数量和骨吸收面积。免疫荧光显示转染 ds-miR146a 组 TRAF6 荧光基本湮灭，提示 miR146a 可通 过调节 TRAF6 表达来阻遏破骨细胞分化。 Pauley 等 25 比较了正常人与类风湿患者 PBMCs miRNAs 表达情况，发 现在类风湿患者 PBMCs 中 mi

21、R146a、miR-155、miR-132 和 miR-16 高表达，提示这些 miRNAs 可能通过介导破骨 细胞分化能力影响类风湿骨破坏的进展。此外，研究证明， 系统性红斑狼疮患者 PBMCs 的 miR-148a 表达上调。 Cheng 等26 应用 miRNA 微阵列及 qRT-PCR 验 证， 发 现 CD14+PBMCs 经 M-CSF 和 RANKL 诱导 14 d 后，在 向破骨细胞分化中有 27 个 miRNAs 表达发生变化，其中以 miR-148a 表达上调最显着且随着诱导时间延长而增加。 靶基因预测软件预测并经荧光素酶报告基因检测， MAFB ( V-maf muscu

22、loaponeurotic fibrosarcoma oncogenehomolog B) 为 miR-148a 的靶基因，miR-148a 与 MAFB 的 3UTR 结合，在转录后水平抑制 MAFB 翻译，间接促进 NFATc1 表达，促进破骨细胞分化。动物实验也表明， 静脉注射 anti-miR-148a 可以抑 制骨吸收、增加骨量。在研究破骨细胞与原发性骨质疏松症以及肿瘤骨 转移的关系时， Krzeszinski 等27 发现过表达 miR-34a 的 小鼠表现为低骨吸收和高骨量状态， 对于去卵巢以及乳腺癌 /皮肤癌骨转移的骨质疏松动物给予 miR-34a 纳米颗粒治疗 后后可使模型动

23、物的骨质疏松症状有效缓解，研究表明 Tgif2 ( transforminggrowth factor- -induced factor 2 ) 为 miR-34a 的直接靶基因， miR-34a 作为抑制破骨细胞分化的 强有力因子，有望成为防治骨质疏松相关疾病的潜在靶点。为了探讨肿瘤骨转移溶骨性破坏的机制， Ell 等28 采用共培养方法发现高转移性肿瘤细胞可有效激活 RAW264. 7 向破骨细胞分 化，行 miRNA 表达 谱 显示RAW264. 7 的 miR-33a、miR-133a、miR-141、 miR- 190、 miR- 219 表 达 下 调。 若 在 RAW264. 7 中过表达上述 miRNAs, 则 NFATc1、 cathepsin K 蛋白表达下降，破骨细 胞数与骨吸收面积均受到不同程度抑制。 动物实验显示， 过