蛋白质组学及其研究方法

1、 一个细胞或一个机体的基因所表达的全一个细胞或一个机体的基因所表达的全 部蛋白质部蛋白质 系系, ,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动揭示蛋白质的功能与细胞生命活动 的规律的规律 的研究，的研究， 包括蛋白质的功能及蛋白质包括蛋白质的功能及蛋白质 间的相互作用。间的相互作用。 编辑ppt7 0.50nm 0.54nm 氢键 -碳原子 侧链 反平行 俯视 侧视 DNA mRNA 蛋白质 转录 翻译 基因 蛋白质 细胞特 异性基 因表达 生理状态 温度 应激 状态 培养条件 药物作用 数量有限 结构相对 稳定 复杂性 多变性 直接 反应 生命 现象 复 杂 的 调 控 术术, ,以及以及生物信息学生物

2、信息学( (Bioinformatics) ) 分析。分析。 Protein sample Image analysis Protein in gel Protein on membrane Protein in solution 2-D PAGE Excision Blotting Elution Partial degradation Peptide mixture Mass of protein N-terminal sequence MS Edman degradation Peptide mass fingerprint Peptide sequence MS/MS data Dat

3、abase searching Novel or previously studied protein Characterization of post-translocation modifications 蛋蛋 白 白 质 质 组 组 的 的 分 分 析 析 流流 程 程 蛋白质的上样量和检测灵敏度。蛋白质的上样量和检测灵敏度。 三三 第二相：第二相：SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 电泳电泳 根据蛋白质分子量差根据蛋白质分子量差 异异 基本原理 第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF), 再在第再在第 一向垂直方向上进行第二向一向垂直

4、方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)。 IEF-focused proteins SDS-charged proteins in IPG strip SDS-charged proteins resolved according to sizes in SDS-PAGE gel 2-DE原理示意图 蛋白质 溶解 变性 还原 去除蛋白 质杂志 利用不同 pK固定化 电解质可 配置不同 pH范围的 凝胶或利 用商业化 软件设计 第一相电泳： IPGIFE 平衡 第二相电泳： SDSPAGE 考马斯亮 蓝染色、 银染色、 铜染色 样品制备IPG胶制备双相

5、电泳 染色 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresis SDSSDS带负电荷，破坏蛋白质的氢带负电荷，破坏蛋白质的氢 键、疏水键，使之形成单个亚基。键、疏水键，使之形成单个亚基。 SDS-SDS-蛋白质复合物为雪茄形的蛋白质复合物为雪茄形的 长椭圆棒长椭圆棒，消除或掩盖了不同种消除或掩盖了不同种 类蛋白质间原有电荷的差异类蛋白质间原有电荷的差异。 SDSSDS - -蛋白质复合物在凝胶电泳蛋白质复合物在凝胶电泳 中的中的迁移迁移率只是蛋白质分子量的率只是蛋白质分子量的 函数有关函数有关。 制胶：制胶

6、： 试剂试剂 分离胶（分离胶（ml） 浓缩胶（浓缩胶（ml） 1.5M Tris-HCl （pH 8.9） 2.50 30%单体单体 3.50 1.00 10%SDS 0.10 0.10 蒸馏水蒸馏水 3.84 6.34 0.5M Tris-HCl （pH 6.8） 2.50 10%过硫酸铵过硫酸铵AP 0.05 0.05 四甲基乙二胺四甲基乙二胺TEMED 0.01 0.01 样品处理：样品处理： Loading buffer 40%甘油甘油 溴酚兰溴酚兰 SDS -巯基乙醇巯基乙醇 0.5M Tris-HCl（pH 6.8） 50ul样品样品 50ul(2)Loading buffer M

7、ix 950C/5min 上电极缓冲液上电极缓冲液 下电极缓冲液下电极缓冲液 样品槽样品槽 上样器上样器 阴极阴极 阳极阳极 电泳电泳 方向方向 聚丙烯酰胺凝胶板聚丙烯酰胺凝胶板 蛋白质点染色蛋白质点染色, , 该法操作方便、重现该法操作方便、重现 性好性好, , 同银染法一样同银染法一样, , 质谱测定时也质谱测定时也 必须先脱色必须先脱色. . 2-DE获得的蛋白质图谱 图像采集 斑点检测 背景消减 获得蛋白质相关信息 图像内及图像间的比较 2-DE2-DE图像分析软件包操作过程：图像分析软件包操作过程： 丙烯酰胺有神经毒作用。丙烯酰胺有神经毒作用。 询、鉴定蛋白质。询、鉴定蛋白质。 多维色谱技术（多维色谱技术（LC/LC-MS/MS） 多维蛋白质鉴定技