影响Westernblot的因素

1、Western blotting的影响因素（一）：电泳Western blotting是一个步骤繁多的实验。很多的操作过程，毎一步都会对最后的结果产生 影响，接下来的这几个帖子我想把我这段时间做Western blotting总结的一些影响实验结果 的因素写下来，如果你有更好的建议，希望也能贡献岀来，大家一起学习进步。电泳过程是第一步，也是很重要的一步，好的电泳能让目的条带整齐，就像人工画的。要做 好电泳也井非易事，我总结有这些方而的因素能影响电泳效果： 1.样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值 是否在7-8 Z间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋

2、白样品是否降解、目的蛋白 是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。2.凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，具体的影响因素有：1分离胶的 PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这 个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。 因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳怎是很重要的。2.所用丙烯酰胺 的纯度和凝胶聚合时间，不纯的丙烯酰胺会含有丙烯酸，它会影响到凝胶内部局部PH环境, 因此会影响电泳的效果，没有聚合充分的凝胶会含有游离的丙烯酰腹，也会影响到局部PH 环境，它们还会

3、与蛋白上的氨基、兢基以及酚疑基反应彫响蛋白的泳动。凝胶聚合时间以分 离胶45inin,浓缩胶：20min为宜。此外，单体放置时间过长也会造成丙烯酸的累积。3. 凝胶母液混合是否均匀也会影响到凝胶浓度的分布C 4.配备的母液中丙烯酰腹和甲叉丙烯酰 胺的比例也会影响到网孔的大小，因此也会对电泳的质量有影响，一般取（3040）： 1,特 姝要求的实验也可以灵活变动。5.APS及TEMED的加入量，APS极易潮解而失去活性，因 此最好是现用现配，APS不宜加入过多，否则会氧化蛋白样品。TEMED作为加速剂，有利 于氧自由基的富集，从而加速聚合反应，因此所用的TEMED尽量不要被氧化（氧化后发黄）, 还

4、有加入的TEMED也不宜过多或过少，过多会升高PH值并能与蛋白反应，过少则会造成 聚合不充分，网孔变大，并且造成游离丙烯酰胺单体的增多，它们也会和蛋白反应以及改变 局部PH。6.点样孔底部要平整。3.点样。样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为&3, 而样品为7.5,混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。因此，建议点样最好用 长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。还有，加样之前最好先冲洗一下加样孔 底部，减少没有聚合的丙烯酰胺的影响。还有，尽量从加样孔的中间点样，这样能使得样品 在加样孔中的浓度分布尽量均匀，这也会对最终蛋白条带的形状有影响的。加样量

5、也不能过 高或过低，过高会影响条带的形状，过低不利于后面的杂交反应。4. 电泳缓冲液。尽量用新鲜配制的。这样能保证PH值和离子强度的稳;5. 电压条件。电压过高，一方而会使凝胶温度上升，改变凝胶内部PH值，甚至会造成溶 胶，另一方而，电流过大也不利于蛋白分子的分离，容易造成条带变形，电压过低，又会有 样品扩散的彫响。我们经常用的浓缩时80V,分离时100V比较好，条带很平。6. 苴他的因素，如做胶的玻璃板要干净，底下或上而不能有杂质（如铁锈等），加分离胶 之前要把上面的有机相洗干净，并尽量吸丁水分。胶板加到电泳槽之后检查胶板底部是否有 气泡，有的话用抢吹走，这个会严重影响电流方向，进而影响电泳

6、效果.（二）：转膜转膜是最终结果影响最大的一步，砖模质量的好坏宜接决圧了实验 结果的好坏。转膜的影响因素不多，主要有膜的选择、转印方法和实验操作三个方而。常规染色可川放射不能用阴离子染料性和非放射性检测检测方式亮蓝染色可用于ECL检测.快速免疫首先是膜的选择问题。膜的选择主要从实脸目的和实脸要求来考虑。例如，要做分子量 小于20kD的小蛋白，0.45 Um的NC膜是不可取的，因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔 而造成膜结合的目的蛋白量不确立，从而影响到最终结果的可靠性。而如果所分离的蛋白需 要进行测序，则非PVDF膜不可，因为只有PVDF膜才能经受住严酷的淸洗条件。常用的Western用膜有NC

7、膜、PVDF膜和尼龙膜，它们的一些主要的特点总结如下表：nameNC 膜尼龙膜PVDF 膜灵敏度和商商分辨率背杲低较為低125* 200 ug/cm2 （适合于SDS存在下结合能力80*110ug/cm2400 ug/cm2与蛋白质的结合）材料质地干的NC膜易脆软而结实机械强度高,?剂耐受无无有性操作程序缓冲液润湿,避免气缓冲液润湿便用前100%甲醇润湿泡常规染色.比较于NC膜可用考马斯检测。0.45um 股蛋白023分子fi小于低浓度小分子责白、酸性蛋白、糖适用范隔20kD贺白贵白和蛋白多糖（主要用在核战检糖来白检测和贵白质测序测中）O.lum 分子S小于 7kD蛋白g眉内价格价格较便宜便宜

8、其次是转膜方法的选择。主要有半干法转膜和湿法转膜。半干法操作要求高，但效率也 高。湿法操作要求相对低，花时间多一些。最肓是实验操作方面的问题。使用PVDF膜的时候需要进行预处理，这里而会带来 一些问题，如甲醇润湿不够，膜的有些区域不能很好的结合蛋白就会引入误菱。膜上而一世 不要有汕脂类的东西，否则也会彫响蛋白结合和抗体的杂交。（三）：抗体杂交与底物显色Western blot最常用的检测方法就是用一抗和二抗的方法，其它的如用生物素-链霉亲 和素或者Protem G/A的方法由于用的比较少，就不在此讨论了。使用一抗和二抗的检测 方法是基于信号放大的原理，加大了检测的灵敏度。当然这样做也能减少成本

9、和提高效率， 我们只需要优先的几种标记的特异性好的二抗就能满定大量的实验要求。抗体杂交方而能影响最后实验结果的因素不多。首先是一抗的选择，尽S选择小鼠或 者兔来源的单克隆抗体，还有要注意所用的抗体是否能够识别变性条件下的目标蛋白，一般 说明书里标明可以用于VB的都是可以用来做Western的。尽量选择小鼠或者兔来源是考 虑到其他实验如果要用这种抗体的话，这两种来源的会增加适用范用。单抗的特异性好，能 减少非特异条带。其次是一抗的杂交条件，一般用4过夜为好，当然首先尊重说明书中的 建议。再其次就是一抗洗涤的条件，一般采用含0.5-1.0%。10*20的TEST来洗，5分钟 一次，洗3至5次即可，

10、如果遇到背景比较脏的情况，也可以适当提高吐温的含量。二抗一 般都是效价很高的，只要室温下杂交1小时就可以了，适当延长也是可以的。抗体的稀释倍 数是由显色方法决泄的，可以先用说明书建议的稀释条件做一下，再根据结果调整稀释倍数。 显影或显色这一步对结果的影响是非常大的。用荧光素、同位素或者生物素标记的不常用， 就不讨论了，垠常用的是用标记的，常用的标记酶包括辣根过氧化物酶HRP （Horseradish Peroxidase,属于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP （Alkaline Phosphatase）,此外 还有比校少见的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、B半乳糖昔酶3 -

11、Galactosidase这些 酶类主要有两种检测方法：底物显色和化学发光。ABTS等则适用于ELISA）中。这几HRP辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、特异性 更强、分子量小（40kD）、稳和作用底物范用广的优点而得到广泛使用。HRP的底物种 类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物2大类。对于底物的选择，主要考虑的是 灵敏度、背景和使用的方便性和稳左性。HRP的生色底物显色有DAB, 4-CN , CN/DAB. AEC和TMB等（而得到可溶性产物的底物如OPD. 种显色底物的各种性能的比较见下表：底物DAB4-CNAECTMB学名3, S-diamino

12、benzidine4-chloro-l -naphthol3-ainino-9-ethyl335,5页1内4carbazoltetrahydrochloridetetramethylbenzidine分了214.14178,58210.282404figJB 内 9稳定-股避光灵敏250pglOOps背訣-股终产不能很好的成像容易成像容易成像物成像性魏色碣色介于蓝色与蓝紫色之间（可棕红色蓝紫色用于 doublistaining)有（班有治癌作用）HRP化学发光反应底物可以用琳琅满目来形容。常见的化学发光底物包括Luminol、 GE Healthcare（原安玛两亚）的ECL系列I，还有Pierce公司的SuperSignal系列等Luminol 系列是经典的HRP化学发光底物，但现在发展出来的高效的化学发光底物更受欢迎。ECL 在许多研究人员心目中的几乎成为化学发光法的代冬词，有时竞然是高品质文章的保证之 一，可见实经典。GE Healthcare公司后