细胞克隆形成实验

1、细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。 每个克隆含有50以上的细胞，大小在0. 3-1. 0mm之间。集落形成率表示细胞的 独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定 的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都 能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成 率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细 胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转

2、化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造 血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞， 并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯 度密度分别接种含lOmL 37C预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。 置37工5% C02及

3、饱和湿度的细胞培养箱中培养23周。3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用 PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液， 加适量GIMSA应用染色液染1030分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干4、将平皿倒置并叠加一带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜 (低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率二(克隆数/接种细胞数)X100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料 瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不 能有细胞团，接种密度不能

4、过大。平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料 瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不 能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：(1) 取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞， 作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1 X 106细胞/L。 然后根据实验要求作梯度倍数稀释。(2) 用蒸徭水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，髙压灭菌后， 维持在4(rc中不会凝固。(3) 按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2XDMEM培养基(含有2X抗生素和2

5、0%的小牛 血清)混合后，取3n混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7lOmL),冷却 凝固，可作底层琼脂置C02温箱中备用。(4) 按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2XDMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向 管中加入0. 2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐 形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37C 5%C02温箱中培养1014天。(5) 把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。软琼脂培养法 常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过 401。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细

6、 胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆)将1.2%低熔点琼脂糖与2X细胞培养基以1：1的体积比混合制备0.6%的底层 琼脂，6孔板中每个孔1.4ml温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单 个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个/ml,将0.6%低熔点琼脂糖与2X 细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.3%的上层琼脂，每孔加1ml上层琼 脂和lOOul单细胞悬液(约1000cell/well),混匀，室温凝固。置于37C, 5% C02的细胞培养箱中培养2-3周，计数含50个细胞以上得克隆，计算细胞集 落形成率，SpotII采集图像注意事项1接种时细胞密度适度，不可过高。2.软琼脂与细胞混合时温度不能超过4(TC,否则将会烫伤/死细胞；3琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此 高压灭菌后应进行分装；4.细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受 到很大影响；5细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克 隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为 0. 5%-5%,甚至无法形成单个克隆。因此，为了提髙克隆形成率，有时需要在培 养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成