TUNEL检测方法

1、TUNEL检测方法DeadEnd?Colorimetric?TUNEL System 试剂盒法检测原理：细胞凋亡时，其DNA会产生3 -OH末端，而正常细胞则几乎没有。使用末端脱氧核 苷转移酶（TdT酶）将生物素标记的核苷酸连接到 DNA的 3 -OH末端。再将辣根过氧化物 酶标记的链霉亲和素（Streptavidin?HRP）结合在此核苷酸上。Streptavidin?HRP 可与过 氧化物酶的底物过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯胺（DAB）产生深棕色反应。即可通过光学显微镜观察到凋亡细胞。材料试剂盒（G7130内容:名称量说明平衡缓冲液9.6ml生物素标记的核苷酸混合物40卩l2 X 20

2、卩 lTdT酶40卩l2 X 20 卩 lStreptavid in ?HRP40卩l0.5mg/mlDAB 20X Chromoge n200 卩 lDAB Substrate 20X Buffer200 卩 lHydrogen Peroxide 20X200 卩 lSSC, 20X70mlProte in ase K10mgPlastic Coverslips40(2 X 20)储存条件:?平衡缓冲液,?TdT酶,?生物素标记的核苷酸混合物，蛋白酶 K?：- 20 CStreptavidin?HRP,?DAB?20X?Chromogen,?20X?DAB底物缓冲液，20X过氧化氢：？4 C

3、 20X?SSC塑料盖玻片：室温保存需自备：PBS缓冲液0.3%过氧化氢溶液（用以抑制内源性过氧化氢酶 ?） 固定液（例如：10%缓冲的福尔马林，4%多聚甲醛，4%6甲醇甲醛）？ 封固剂用于组织的检测方法由试剂盒内容制备：20卩g/ml蛋白酶K工作液：10mg蛋白酶K+ 1ml蛋白酶K缓冲液r宀10mg/ml蛋白酶K储备液宀20卩g/ml蛋白酶K工作液TdT酶反应液（使用时制备）：缓冲液成分每标准100ul反应的成分 体积反应次数（实验反 应+选择性阳性对 昭）八、）成分的体 积平衡缓冲液98ulX ?=生物素化的核苷混合 物1ulXrTdT 酶1ul?X ?=?2X SSC用去离子水1: 1

4、0稀释20X?SSCStreptavidin?HRP 工作液： 以 PBS500 1 稀释 Streptavidin?HRP.DAB昆合液（使用时制备，避光，30mins ）:950ul去离子水+ 50ul?20X?DAB底物缓冲液+ 50ul?DAB?20X色原体+ 50ul?20X过氧化氢步骤：1. 0.85%氯化钠溶液浸洗5mins （室温）2. PBS浸洗 5mins （室温）3. 4%多聚甲醛溶液或含10%畐尔马林的PBS溶液中固定15?mins （室温）4. PBS浸洗二次，每次5?mins （室温）5. 除去多余液体，滴加100卩L 20卩g/ml蛋白酶K工作液，覆盖组织。置于平

5、面，孵育10-30mins （室温）。6. 染色缸内PBS浸洗5mins。（室温）7. 4%多聚甲醛溶液或含10%畐尔马林的PBS溶液固定5?mins。（室温）8. PBS浸洗二次，每次5?mins。（室温）9. 除去多余液体，滴加100卩L平衡缓冲液，覆盖组织。置于平面，平衡 510mins （室 温）。10. 置于冰上，除去多余液体，添加100卩LTdT酶反应液，防止干燥。37C，湿盒中孵育 60min,（以使末端标记反应发生）。（过程中应防止干燥）。11. 染色缸内2X SSC浸洗15mins （用于终止反应）。（室温）12. PBS浸洗三次，每次5min,（用于移去未结合的生物素标记的

6、核苷酸）。（室温）13. 0.3%过氧化氢的PBS中浸洗3-5min （用以抑制内源性过氧化氢酶）。（室温）14. PBS浸洗三次，每次5min。（室温）15. 加 100 卩 LStreptavidin?HRP 工作液，反应 30min。（室温）16. PBS浸洗三次，每次5min。（室温）17. 加100卩L?DAB混合液，直到呈现浅棕色背景，但背景不可太深。18. 去离子水漂洗若干次。19. 用水或永久的封片剂封片，水封片剂周围用指甲膏封住，显微镜下观察染色。用于细胞的检测方法需自备：Poly-L-Lys ine 覆盖的切片：在干净的载玻片表面铺 poly- L-lysine （可以Si

7、gma Cat.# P 892010 倍稀释于水制得），在所需区域铺一薄层。待干后，迅速以去离子水冲洗，空气干燥30-60mins。4 C可储存7天。0.2% Trit on X-100 溶液：Triton X-100 溶于 PBSTdT酶反应液（使用时制备）：缓冲液成分每标准100ul反应的成分反应次数（实验反 应+选择性阳性对成分的体 积体积昭）八、）平衡缓冲液98ulX ?=生物素化的核苷混合 物1ulX=rTdT 酶1ul?X ?=?2X SSC用去离子水1: 10稀释20X?SSCStreptavidin?HRP 工作液： 以 PBS500 1 稀释 Streptavidin?HRP

8、.DAB昆合液（使用时制备，避光，30mins ）:950ul去离子水+ 50ul?20X?DAB底物缓冲液+ 50ul?DAB?20X色原体+ 50ul?20X过氧化氢步骤：1. 将细胞以PBS清洗，重悬后铺于Poly-L-Lysine 覆盖的切片上，组织培养罩内空气干 燥约15mi ns2. PBS青洗2次。（室温）3. 4多聚甲醛溶液或含10%畐尔马林的PBS溶液，或10%畐尔马林浸泡细胞25mins。（室 温）4. PBS浸洗二次，每次5?mins。（室温）5. 0.2% Triton X-100 溶液浸洗 5?mins。（室温）6. PBS浸洗二次，每次5?mins。（室温）7. 除

9、去多余液体，滴加100卩L平衡缓冲液，覆盖组织。置于平面，室温平衡510mins。8. 置于冰上，除去多余液体，添加100卩LTdT酶反应液，防止干燥。37C，湿盒中孵育 60min,（以使末端标记反应发生）。（过程中应防止干燥）。9. 染色缸内2X SSC浸洗15mins （用于终止反应）。（室温）10. PBS浸洗三次，每次5min,（用于移去未结合的生物素标记的核苷酸）。（室温）11. 0.3%过氧化氢的PBS中浸洗3-5min （用以抑制内源性过氧化氢酶）。（室温）12. PBS浸洗三次，每次5min。（室温）13. 加 100 卩 LStreptavidin?HRP 工作液，反应 3

10、0min。（室温）14. PBS浸洗三次，每次5min。（室温）15. 加100卩L?DAB混合液，直到呈现浅棕色背景，但背景不可太深。16. 去离子水漂洗若干次。17. 用水或永久的封片剂封片，水封片剂周围用指甲膏封住，显微镜下观察染色。附：用于细胞的检测方法非试剂盒法TUNEI法检测SK-N-SH细胞的凋亡1. SK-N-SH细胞于激光共聚焦专用玻璃培养皿中，PBS洗涤，用4%勺多聚甲醛（以0.1mol/L NaH2PO4 为溶剂，pH=7.4）固定细胞 15 min ;2. PBS洗涤3次，每次5 min3. 含有 0.5%Tween-20和 0.2%BSA勺 PBS室温孵育 15 min4. PBS洗涤 2 min5. 每孔加入50卩L TdT混合物（TdT缓冲液：Biotin-dUTP : TdT为90 : 5 : 5,体积比， 现配现用）室温孵育60 min6. 吸弃TdT混合物，加入1X TB室温作用5 min7. PBS洗涤4次，每次2 min ;每孔滴加50卩L的封闭液室温处理20 min8. 现配的avi