医学生物化学课件--04

1、.,第二章 核酸的结构与功能,第一节 核酸的化学组成 第二节 核苷酸的结构 第三节 核酸的一级结构 第四节 DNA的结构与功能 第五节 RNA的空间结构与功能 第六节 核酸的理化性质及应用 第七节 核酸酶,.,核酸的研究历史： 1868年，瑞士外科医生Fridrich Miescher从脓细胞核中分离到核酸样物质。 核酸分为DNA和RNA。DNA存在于细胞核和线粒体内，RNA存在于细胞质和细胞核内。 1944年，Oswald Avery通过肺炎双球菌转化实验证实了DNA是遗传的物质基础。,.,.,第一节 核酸的化学组成,核酸是一种线形多聚核苷酸。核酸 在核酸酶作用下水解为核苷酸，所以核酸的基本

2、单位是：核苷酸。 核苷酸由碱基、戊糖和磷酸组成。,.,碱基+戊糖 核苷 + 磷酸 核苷酸 poly 聚合 核酸 (核苷酸之间通过3,5-磷酸二脂键连接),.,按戊糖不同，可分： 1、脱氧核糖核酸（DNA）：分布于细胞核中，为染色体主要成份。 D-2-脱氧核糖；磷酸；碱基（腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶） 2、核糖核酸：（RNA）：分布于细胞质和核仁中。 D-核糖；磷酸；碱基（腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶）,.,戊糖,核糖,脱氧核糖,.,核酸的重要性 1、DNA是遗传物质，是遗传信息的载体：DNA RNA多肽中氨基酸的组成和顺序 （中心法则） 2、DNA以自身的半保留复制方式把遗传信息一代一

3、代传递下去； 3、核酸的研究在医学、农学等生命科学中发挥重要作用； 4、基因工程进行的DNA重组，将创造出自然界原来没有的新品种。,.,第二节 核苷酸的结构,一、碱基 1、嘧啶碱： 在嘧啶2位碳原子上由酮基取代H，4位碳原子上有氨基或酮基取代H,嘧 啶(pyrimidine),胞嘧啶 （2-氧，4-氨基嘧 啶 ）Cytosine(C),尿嘧啶 (2，4-二氧嘧啶) Uracil(U),胸腺嘧啶（5-甲基尿嘧啶） Thymine(T),.,此外还有：5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，5,6-双氢尿嘧啶，假尿嘧啶。,假尿嘧啶核苷,DHU:双氢尿嘧啶,.,2、嘌呤碱： 在嘌呤2位或6位碳原子上H被氨

4、基或酮基取代 此外还有：N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤等（p.479，表13-2）。,嘌 呤(purine),腺嘌呤 (6-氨基嘌呤) Adenine(A),鸟嘌呤 (2-氨基6-氧嘌呤) Guanine(G),.,7-甲基鸟嘌呤,mG：甲基鸟嘌呤核苷,.,在DNA和RNA中都有腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。胸腺嘧啶（T）只出现在DNA分子中，尿嘧啶（U）则只出现于RNA分子中。 ,两类核酸分子的组成比较,嘌呤、嘧啶环上由于有共轭双键，在260nm波长附近对紫外光有较强的吸收。,.,二、核苷 由核糖和碱基之间以糖苷键（C-N糖苷键）缩合而成。连接方式是嘌呤环上的N-9或嘧啶环上的

5、N-1与糖的C-1以糖苷键相连。 -构型（1位羟基在环的上面）。 核糖核苷：腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷（p.480，表13-3） 脱氧核糖核苷：腺嘌呤脱氧核苷、鸟嘌呤脱氧核苷、胞嘧啶脱氧核苷、胸腺嘧啶脱氧核苷 （假尿嘧啶核苷：核糖与尿嘧啶第5位碳原子形成C-C糖苷键）,腺嘌呤核苷（腺苷）,核苷=核糖+碱基,.,胞嘧啶脱氧核苷（脱氧脱苷）,.,三、核苷酸 核苷中的戊糖羟基（主要是5位上的）被磷酸酯化，形成核苷酸（p.481，表3-4）。 核糖核苷酸：腺嘌呤核苷酸（AMP）、鸟嘌呤核苷酸 （GMP）、胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧 啶核苷酸（UMP） 脱氧核糖核苷酸：腺嘌呤脱氧核

6、苷酸（dAMP）、鸟嘌 呤脱氧核苷酸（dGMP）、胞嘧啶脱氧核 苷酸（dCMP）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸 （dTMP） 核糖核苷酸在2、3、5位上都有一个自由羟基，能各自被磷酸酯化； 脱氧核糖核苷酸在2位上没有羟基，故只有3、5能被磷酸酯化。,.,四、多磷酸核苷酸 核苷与一个磷酸产生磷酸酯化的核苷酸，称为核苷单磷酸（NMP）；核苷单磷酸进一步磷酸化，形成核苷二磷酸（NDP）和核苷三磷酸（NTP）。 磷酸之间的焦磷酸键含有很高的能量，称为高能键（），是生物体内能量利用和贮存的主要物质（12000卡/每克分子高能键）。 核苷二磷酸：ADP、GDP、CDP、UDP 核苷三磷酸：ATP、GTP、CTP、U

7、TP 脱氧核苷二磷酸：dADP、dGDP、dCDP、dTDP 脱氧核苷三磷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP,.,核苷酸=核苷+磷酸,磷酸基团位于核糖的第五位碳原子C-5上。 NMP（nucleoside monophosphate) NDP (nucleoside diphosphate) NTP (nucleoside triphosphate),.,.,五、环化核苷酸类（3,5-环状腺苷酸，cAMP） 由腺苷酸上磷酸与核糖的3，5碳原子形成双脂环化而成，其中3位的磷酸酯键为高能键： 由腺苷酸环化酶催化ATP脱去一分子焦磷酸而环化成cAMP；它又可被专一性的磷酸二酯酶水解成5-AM

8、P。,.,六、核苷酸的性质 1、紫外吸收：嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，因此使得碱 基、核苷和核苷酸在240290nm的紫外波段有强烈的吸 收峰，最大吸收值在260nm附近。 2、互变异构作用：凡含有酮基的嘧啶或嘌呤碱，在溶液中 可发生酮式和烯醇式的互变异构现象： 在生物细胞内一般是以酮式存在（这对核酸中氢键结构 的形成十分重要）。,酮式,烯醇式,胞嘧啶 （2-氧，4-氨基嘧 啶 ）Cytosine(C),.,.,第三节 核酸的一级结构,一级结构指其核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，也称碱基序列。 DNA：四种脱氧核苷酸按一定顺序以磷酸二酯键相连形成的聚脱氧核苷酸链（polyd

9、eoxynucleotides）。 DNA的书写顺序是53。,.,DNA一级结构,.,5末端的磷酸基团,3，5-磷酸二酯键,3末端羟基,.,.,.,第四节 DNA的结构与功能,一、DNA的二级结构的研究史 二十世纪二十年代，Levene研究了核酸的化学结构并提出了四核苷酸假说。他认为DNA分子是由A、G、C、T 4 种核苷酸不断重复延伸而成。 二十世纪五十年代初，Chargaff采用层析和紫外吸收分析等技术研究了DNA分子的碱基组成，发现不同物种的DNA碱基组成不一样，并总有A=T；C=G。 1953年，Watson和Crick以Chargaff的发现为基础，进行DNA晶体的X-射线衍射图谱研

10、究，提出了DNA的双螺旋结构。1962年， Watson（美）和 Crick（英）与Wilkins共享Nobel生理医学奖， Wilkins通过对DNA分子的X -射线衍射研究证实了Watson和Crick的DNA模型。,.,.,DNA的二级结构(双螺旋),1953年，Watson 和 Crick 提出的DNA双螺旋结构,.,二、DNA双螺旋结构的要点,1、 Watson-Crick模型模型的特性： 双螺旋：两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴相互缠绕，并且均为右手螺旋；双螺旋结构上有二条螺形凹沟：一条较深，称大沟；一条较浅，称小沟。 基团位置：碱基位于双螺旋的内侧，且其平面与纵轴垂直；磷酸

11、与核糖位于双螺旋外侧，彼此通过3,5-磷酸二酯键相连，形成DNA分子的骨架，且糖环的平面与纵轴平行。 基团走向：多核苷酸链的方向取决于磷酸二酯键的走向，习惯上以C3C5为正向。 尺度：双螺旋平均直径为2nm。两个相邻的碱基之间相距高度（碱基堆积距离）为0.34nm，两个核苷酸之间的夹角为36o。因此，沿中心轴每旋转一周有10个核苷酸，每一转的高度（螺距）为3.4nm。 碱基在一条链上的排列顺序不受任何限制，但依据碱基配对原则，当一条链序列确定后，可决定另一条互补链的序列。,.,.,.,氢键：两条核苷酸链依靠彼此碱基之间的氢键相连而结 合在一起： A与T相配对，形成两个氢键：A（N6）-T（O4

12、） A（N1）-T（N3） G与C相配对，形成三个氢键：G（N2）-C（O2） G（N1）-C（N3） G（O6）-C（N4） 上述碱基之间的配对原则，称之为碱基互补。,T = A,C G,.,.,2、Dickerson十二聚体（人工合成）的补充： （1）两个核苷酸之间的夹角并非都是36，可由28至42不等， 实际平均每一螺周含10.4个碱基对； （2）组成碱基对的两个核苷酸的分布并非在同一平面上，而 是碱基对沿长轴旋转一定角度，从而使碱基对的形状像 螺旋桨叶片的样子，故称为螺旋桨状扭曲。这可提高碱 基堆积力，使DNA结构更稳定； （3）维持DNA二级结构的作用力：氢键、碱基堆积力。后者 为维

13、持二级结构的主要作用力。,.,三、DNA结构的多样性,DNA的右手螺旋并不是自然界DNA唯一存在的方式。右手螺旋结构是在生理盐水溶液中提取的DNA的结构，目前将这种结构称为B-DNA。 1979年，Alexander Rich发现了左手螺旋，称为Z-DNA，另外也有A-DNA的存在。,.,1、C-3内式和C-2内式是指呋喃核糖信封式构象中C3还是C2指向C5，见p14图1-13； 2、糖苷键构象：嘌呤六元环或嘧啶的O2指向。远离糖的为反式，指向糖的为顺式。,.,嘌呤六元环顺式,嘧啶O2环顺式,.,四、DNA的三级结构,DNA的三级结构指DNA双螺旋通过扭曲和折叠所形成的特定构象，包括不同二级结

14、构单元间的相互作用、单链与二级结构单元间的相互作用以及DNA的拓扑特征。 环形DNA： 大部分原核生物的DNA是共价封闭的环状双螺旋。包括：某些病毒、噬菌体、细菌质粒、真核生物线粒体和叶绿体、细菌染色体DNA。 线形DNA的两端有粘末端，也可借助DNA连接酶将互补的粘末端连接成环形DNA。,.,超螺旋结构 1、超螺旋的形成原因： 当DNA双螺旋分子以一定构象自由存在时，是处于能量最低状态，为松弛型；如果额外多转或少转几圈，就会使双螺旋中存在张力。当双螺旋分子的末端是开放的，这种张力可以通过链的转动而释放出来，DNA将恢复正常的双螺旋状态；但如果DNA分子的两端是固定的，或者是环状分子，这种额外

15、的张力就不能释放掉，DNA分子本身就会发生扭曲，用以抵消张力。这种扭曲称为超螺旋（双螺旋的螺旋）。,.,2、拓扑学特性： （1）连环数：在双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示； （2）扭曲数：DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目（螺周数），以T表示； （3）超螺旋数：双螺旋链再扭曲成螺旋的周数，以W表示。 三者关系：L=T+W L值必须是整数。,.,3、负超螺旋： 设一段260bp，螺周数为25的DNA。 1）当将此线形DNA连接成环形时，此环形DNA称为松弛型DNA： L=25 T=25 W=0 2）当将此线形DNA的螺旋先拧松两周（其他的周内螺旋不解链），再连

16、接成环形时，可形成两种环形DNA： （1）解链环形DNA：L=23 T=23 W=0 （含有一个解链后形成的突环） （2）超螺旋DNA：L=23 T=25 W=-2 （为负超螺旋）,.,真核生物：DNA和蛋白质组装成染色体，染色体的基本单位是核小体。 核小体由DNA和组蛋白构成。组蛋白有H1，H2A，H2B，H3和H4。 H2A，H2B，H3和H4各两分子构成核小体的核心，称为组蛋白八聚体。DNA双螺旋分子缠绕在八聚体上构成核小体的核心颗粒。核小体的核心颗粒之间再由DNA和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠状结构。核小体进一步旋转折叠形成棒状染色体，将近1 m长的DNA分子容纳于直径只有数

17、微米的细胞核中。,核小体结构模式图,.,真核染色不同层次的结构模型,.,DNA的功能, DNA的基本功能：用为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板，它是遗传繁殖的物质基础。 基因组（genome）： 一个生物体的全部基因序列。最简单的生物如SV40病毒的基因组仅含有5100碱基对（base pair bp）， 大肠杆菌基因组的大小为5700千碱基对（kbp），人的基因组则由大约3.0109个bp组成。,.,第五节 RNA的空间结构与功能,一、结构特点 1、碱基组成：AMP、GMP、CMP、UMP，还有一些稀有碱基； 2、戊糖是核糖； 3、天然RNA是单链线形分子，只有局部区域为链内双螺旋（单

18、链分子自身回折使得互补碱基配对而形成，不配对的区域形成突环）。,.,核糖核酸(RNA)分为,信使RNA(mRNA) 转运RNA(tRNA) 核糖体RNA(rRNA),.,二、类型 1、信使RNA的结构与功能 信使RNA（messenger RNA，mRNA） 不均一核RNA（heterogeneou nuclear RNA，hnRNA）： 在细胞核内合成的mRNA的初级产物，经过剪接成为成熟的mRNA并移到细胞质。,真核生物成熟mRNA的结构特点： （1）5端帽子结构（cap sequence)：mGpppNm. 帽子结构能促进核糖体与mRNA的结合，加速翻译起始速度,同时可以增强mRNA的稳

19、定性。 （2）3末端多聚A的尾巴。可能与mRNA从核内向胞质的转位及mRNA的稳定有关。 mRNA的功能是把核内DNA的碱基顺序按照碱基互补的原则，抄录并转送至胞质，指导蛋白质的合成。,.,.,2、转运RNA的结构与功能,转运RNA（transfer RNA，tRNA）是细胞内分子量最小的一类核酸，其功能是在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体。,tRNA的特点： 1、tRNA分子中含有1020%的稀有碱基，包括双氢尿嘧啶（DHU）、假尿嘧啶（）和甲基化的嘌呤（mG，mA）。,mG：甲基鸟嘌呤核苷,I：次黄嘌呤核苷,.,假尿嘧啶核苷,DHU:双氢尿嘧啶,.,2、tRNA中存在一些能局部互补

20、配对的区域，能形成局部双链，进而形成一种茎-环状或发夹结构，由于茎环结构的存在，使tRNA形成了三叶草形的二级结构。 3、tRNA共同的三级结构：倒L型 。,.,.,结构： （1）氨基酸臂：由7对碱基组成，3末端为-CCA，接受活化 的氨基酸； （2）二氢尿嘧啶环：由8-12个碱基组成，具有两个二氢尿嘧 啶； （3）反密码子环：由7个碱基组成，环中部有3个碱基组成的 反密码子，将由此与mRNA上的密码子配 对； （4）额外环：由3-18个碱基组成，大小不同，为tRNA分类的 依据之一； （5）TC环：由7个碱基组成，含有假尿嘧啶。 （，psai）,.,3、核糖体RNA的结构与功能,核糖体RNA

21、（ribosomal RNA，rRNA）， 是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上。rRNA与核糖体蛋白共同构成核糖体（ribosome）。 传统认为rRNA是构成核糖体的骨架，催化蛋白质肽键形成的是核糖体蛋白质（大亚基）上的肽基转移酶催化的。 现在认为核糖体催化肽键形成的是rRNA，蛋白质只是维持rRNA构象，起辅助作用。 大肠杆菌核糖体中有：5S rRNA，16S rRNA，23S rRNA 动物细胞核糖体中有：5S rRNA，5.8S rRNA，18S rRNA， 28S rRNA。,.,.,核糖体的组成,.,4、其它小分子RNA,.,五、核酶, 某些RNA分子本身具有自我

22、催化能力，可以完成rRNA的剪接。这种有催化作用的RNA被称为核酶（Ribozyme）。1989年，美国科学家Altman和Cech由于发现核酶而获Nobel 化学奖。 是对传统观念的一种挑战。 在医学上有特殊的用途。,.,第六节 核酸的理化性质及应用,一、核酸的一般理化性质 多元酸，较强的酸性。既有磷酸基，又有碱性基，故为两性电解质，在一定的pH条件下，可解离而带电荷，因此都有一定的等电点（p.504-506）。 DNA为线性高分子极性化合物，粘度极大，而RNA分子远小于DNA，粘度也小得多。溶于水，不溶于有机溶剂。,.,由于碱基成分的紫外吸收特征，DNA和RNA溶液均具有260nm紫外吸收

23、峰。 与核苷酸的紫外吸收特性类似，可通过测定核酸溶液中 磷含量W和紫外吸收值，再求出摩尔磷吸光系数(P)来表示溶液中核酸的含量： (P)=30.98A/WL （A=光密度，L=比色杯直径，W=每升中磷的重量（克） 单链多核苷酸的(P)双螺旋多核苷酸的(P)。所以： 增色效应：当核酸变性时，(P)值升高的现象； 减色效应：当核酸复性后，(P)值又降低的现象。,二、核酸的紫外吸收特性,.,三、DNA的变性, DNA变性：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链。监测指标为A260的变化。 常用的变性方法为加热。 增色效应（hyperchromic

24、effect）：DNA解链过程中，其A260增加，并与解链程度有一定的关系。 解链曲线：在连续加热过程中以温度对A260的关系作图。 解链温度：DNA变性从开始到完全解链是在一个相当窄的范围内完成 的。在这一范围内A260达到最大值的50%时的温度称为解链温度，又称为融解温度（melting temperature，Tm）。 Tm的大小与其所含碱基中的G+C比例相关，G+C比例越高，Tm值越高。,.,.,四、DNA的复性与分子杂交,复性；变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，称为复性。热变性DNA经缓慢冷却后即可复性，也称为退火（annealing）。 DNA复性速度受

25、温度的影响。复性时温度缓慢下降才可使其重新配对复性。如加热后将其迅速冷却至4 以下，则不可能发生复性。比Tm低25为DNA复性的最佳条件。,.,核酸的分子杂交(hybridization):,双链DNA,单链DNA,杂交,在DNA复性过程中，双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子之间,也可以发生在碱基序列部分互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间，这种现象称为分子杂交。,.,四、沉降特性 在超离心机强大引力场中，不同构象的核酸沉降速度 差异很大： RNA闭环形质粒DNA开环形及线形DNA蛋白质,离心后，用注射针头从离心管侧面在超螺旋DNA 区带部位刺入，收集这一区带的DNA。用异戊醇抽提收集到的DNA 以除去染料