生物化学实习报告

1、生物化学大实验 实习报告 院 系：理 学 院 专 业：应 用 化 学 学 号： 20110153013 姓 名：黄 学 云 指导教师：任梅蓉 李靖 赵宁 贾璐 日 期：2013年06月21日 目 录序言2实验一、各种谷物中营养成分的测定4一、实验目的4二、实验原理4三、实验器材5四、实验步骤5 （一） 玉米粉中粗蛋白的测定6 （二）玉米粉中粗脂肪的测定7 （三）玉米粉中还原糖及总糖的测定8 （四）玉米粉中灰分及水分的测定10五、结果处理 11六、结论 15七、注意事项 15八、讨论 15实验二、苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定16 一、实验目的16 二、实验原理16三、实验器材17四、实验步骤1

2、8 五、结果处理21六、结论22七、注意事项23八、讨论23序言 生物化学是用化学的原理和方法，研究生命现象的学科。通过研究生物体的化学组成、代谢、营养、酶功能、遗传信息传递、生物膜、细胞结构及分子病等阐明生命现象。生物体内几乎所有的化学反应都是酶催化的。酶的作用具有催化效率高、专一性强等特点。酶的结构与功能的关系、反应动力学及作用机制、酶活性的调节控制等是酶学研究的基本内容。通过x射线晶体学分析、化学修饰和动力学等多种途径的研究，一些具有代 表性的酶的作用原理已经比较清楚。70年代发展起来的亲和标记试剂和自杀底物等专一性的不可逆抑制剂已成为探讨酶的活性部位的有效工具。多酶系统中各种酶的协同作

3、用，酶与蛋白质、核酸等生物大分子的相互作用以及应用蛋白质工程研究酶的结构与功能是酶学研究的几个新的方向。酶与人类生活和生产活动关系十分密切，因此酶在工农业生产、国防和医学上的应用一直受到广泛的重视。 生物化学对其他各门生物学科具有深刻的影响，最紧密的有细胞学、微生物学、遗传学、生理学等领域。通过对生物高分子结构与功能进行深入的研究，揭示了生物体物质代谢、能量转换遗传信息传递、光合作用、神经传导、肌肉收缩、激素作用、免疫和细胞间通讯等许多奥秘，使人们对生命本质认识跃进到一个崭新的阶段。应用一直受到广泛的重视。分离纯化意义：（1）分离大分子，研究其结构与功能，对于了解生命活动规律有重要意义（2）满

4、足工业生产的需要（3）满足医疗的需要（4）满足基因工程的需要 生物体内几乎所有的化学反应都是酶催化的。酶的作用具有催化效率高、专一性强等特点。酶的结构与功能的关系、反应动力学及作用机制、酶活性的调节控制等是酶学研究的基本内容。通过x射线晶体学分析、化学修饰和动力学等多种途径的研究，一些具有代 表性的酶的作用原理已经比较清楚。70年代发展起来的亲和标记试剂和自杀底物等专一性的不可逆抑制剂已成为探讨酶的活性部位的有效工具。多酶系统中各种酶的协同作用，酶与蛋白质、核酸等生物大分子的相互作用以及应用蛋白质工程研究酶的结构与功能是酶学研究的几个新的方向。酶与人类生活和生产活动关系十分密切，因此酶在工农业

5、生产、国防和医学上的应用一直受到广泛的重视。生物大分子的分离纯化一般可以分为以下几个阶段：1材料的选择和预处理；2破碎细胞及提取；3分离和纯化：包括粗分级分离和细分级分离；其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。离心的原理：将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质量，密度，大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不同，由此便可以得到相互间的分离。受到的力：离心力、介质的摩擦阻力、浮力、重力及重力浮力(均可忽略不计) 本次试验包括“各谷物中营养成分的测定”和“苯丙氨酸解氢酶的纯化及活性测

6、定”两个试验。 苯丙氨酸解氨酶（l-phenylalanine：ammonie lyase，简称pal；ec4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等的合成密切相关。在植物生长发育和抵制病菌侵害的过程中起重要作用。pal催化l-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸在290nm处有强大的吸收值。规定1h内增加0.01为pal的一个活力单位。酶的比活力是指样品中每毫克蛋白所含的酶活力单位数。在实验中将会看到随着pal的逐步被纯化，其比活力也在逐步增加。 在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为盐析。溶液的盐浓度通

7、常以盐溶液的饱和度表示，饱和溶液称100%饱和度。沉淀一种酶所需的具体浓度需要经试验确定。谷类含蛋白质在8-12%之间，因谷粒外层蛋白质较里层含量高，因此，精制的大米和面粉因过多的去除外皮，使蛋白质含量较粗制的米和面低。谷类脂肪含量较少，约2%，但玉米和小米可达到4%,主要存在于糊粉层及谷胚中。大部分为不饱和脂肪酸，还有少量磷脂。胚芽油中含有较多的维生素e，有抗氧化作用。【摘要】本次试验主要测定苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定和各种谷物中营养成分的测定这两个实验【关键词】苯丙氨酸解氨酶、sephadexg-25、层析、dns试剂、凯氏定氮法、索氏提取脂肪法实验一各种谷物中营养成分的测定一、 目的

8、1.掌握样品中蛋白质含量测定的方法之一凯氏定氮法2.掌握测定食物中的灰分、水分、油脂及碳水化合物的方法二、 原理谷物是人类特别是发展中国家人民的主要蛋白质来源，谷物中蛋白质的含量是衡量其品质和营养价值的最重要的指标。培育高蛋白质谷物品种，是广大育种工作者的奋斗目标。对现有谷物进行评价、利用，对大批原材料（种质资源）及育成品系筛选，都需要测定种子蛋白质的含量。测定种子蛋白质含量的方法很多，一般可以分为间接方法和直接方法两类。凯氏定氮法是间接方法中的一种，国际谷物化学委员会（icc）、美国分析化学协会（aoac）、美国谷物化学协会（aacc）等不少国际机构都将凯氏定氮法定为标准方法。 蛋白质是生命

9、的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，蛋白质是含氮的有机化合物，是有机形态氮的表现形式。样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后在用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即得蛋白质含量。用反应式表示如下：2nh2(ch2)2cooh+13h2so4(nh4)2so4+6co2+12so2+16h20(nh4)2so4+2noh2nh3+ na2so4 +2h2o2nh3+4h3bo3(nh4)2b4o7+5h2o(nh4)2b4o7+2hcl+5h2o2nh4c+4h3bo4三、仪器、试剂和材料、仪器：（1）凯

10、氏定氮仪；（2）索氏抽提器；（3）马弗炉；（4）微量滴定管；（5）722n型可见分光光度计；（6）干燥器；（7）烘箱；（8）电子天平；（9）恒温水浴锅；（10）瓷坩埚；（11）称量瓶；（12）烧杯、容量瓶、刻度吸管；（13）电炉；2、实验试剂；（1）hcl(0.1mol/l);（2）naoh(40%);（3）硼酸溶液（4%）;（4）浓硫酸;（5）硫酸铜和硫酸钾;（6）3，5二硝基水杨酸;（7）标准葡萄糖溶液（1mg/ml）;（8）无水乙醚;（9）碘-碘化钾溶液;3、实验材料；玉米粉、面粉和大米粉四、实验步骤、玉米粉、面粉和大米粉中粗蛋白的测定（凯氏定氮法）（一）实验步骤；消化） 消化样品前，要

11、将实验仪器洗干净并烘干。同时将样品研磨。） 用电子天平称取0.5000g样品粉末（米粉、面粉、玉米粉），用硫酸纸桥加入消化管底部。（注意：称量药品时要用硫酸纸；加样品时避免将样品沾到消化管壁） 称取0.5000g硫酸铜（催化剂）和3.0000g硫酸钾（提高硫酸的沸点）加入消化管。） 用移液管取10ml浓h2so4加入消化管（注意：浓硫酸具有强烈的腐蚀性，避免占到皮肤、衣服以及地面；如有溅出立即清洗） 另外做两支空白样，消化管里加入0.5000g葡萄糖，其他与上管相同。） 架好消化管，将消化管的横梁密封好，两端皮管接好通入盛满水的水桶。） 接通电源，初始消化时电压调至90v，半小时后调至180v

12、。消化液变至绿色继续加热半小时。关闭电源前，要先将皮管从桶里拿出，关闭电源。） 静置至消化管变冷，备用蒸馏。2 蒸馏） 定氮前，要按说明接好水管，检查仪器是否正常。） 用一只消化管接在蒸汽入口处，要密封，再放250ml的三角锥瓶在氨的出口管，打开冷凝水，开启仪器，蒸汽清洗定氮仪半小时。（将naoh管通入50%naoh溶液中，打开naoh开关，抽提溶液进入消化管中，关闭naoh开关，为了让整个naoh管路中的水被naoh替换） 清洗完毕后，关闭电源。用盛有样品的消化管换下空消化管，用盛有50ml的4%的硼酸的三角锥瓶替换空三角锥瓶，加1-2滴指示剂到硼酸三角锥瓶中，升高三角锥瓶直至出氮的玻璃管完

13、全浸入硼酸液面下。） 将naoh管通入50%的naoh溶液中，打开naoh开关，进50ml的溶液进入消化管中，关闭naoh开关。） 打开进水开关，仪器启动完毕。） 当三角锥瓶中的溶液颜色变为蓝色继续蒸馏10分钟，调低三角锥瓶，用洗瓶冲洗氨出口管，关闭定氮仪。） 用空消化管替换蒸馏完毕的消化管，同时用空三角锥瓶替换溶液变为蓝色的三角锥瓶。启动仪器，并将naoh管通入蒸馏水中，打开naoh开关，吸取三次蒸馏水，冲洗管道中浓碱。清洗半小时。关闭仪器。） 用0.1mol/l 的hcl滴定变色溶液，直至溶液变为没有通入氨前的颜色。记录体积。） 计算样品的含氮量。3样品含氮量的计算=0.1mol/lv滴定

14、体积14含氮系数m样品总质量100%（含氮系数随种子的不同而不同）b、粗脂肪的测定（索氏法）1.将抽提瓶洗干净后放入几粒沸石，然后放到烤箱中恒温干燥至恒重备用。2.将水浴锅加入纯净水备用。3.称取实验用材料（玉米粉）5.000g，用滤纸包裹后放入抽提筒中，慢慢加乙醚于抽提筒中至溶剂稍高于虹吸管，使乙醚流入烧瓶中，然后再加入乙醚至虹吸管1/3处（注：所加乙醚不能超过50ml），装上冷凝管回流提取，调节水浴锅温度，使乙醚冷凝后下滴速为2滴/秒。4.提取1.5小时后，当乙醚从提取器中全部回烧瓶中便可停止加热，提高冷凝管，用镊子取出滤纸筒，再放下冷凝器，继续蒸馏，当乙醚快要达到虹吸管高度时停止加热，待

15、冷凝管中不再滴下乙醚后，移走冷凝管，取出提取筒，将乙醚由虹吸管中倒入回收瓶中，重新装好仪器，继续蒸馏，至冷凝管中不再滴下乙醚时即可停止加热5.拆下仪器，取出平底烧瓶放入烤箱中恒温干燥至恒重，用减量法称出油脂质量，计算含油率含油量=m油脂质量m总质量100%c、还原糖及总糖测定（3，5-二硝基水杨酸比色法）一、实验原理植物体内的还原糖，主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。他们在体内的分布，不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是呼吸作用的基质。还原糖还能形成其他物质如有机酸等；此外，水果，蔬菜中含糖量的多少，也是鉴定其品质的重要指标。还原糖在有机体的代谢中起着重要的作用，其他碳水化合物，如淀粉、蔗

16、糖等，经水解也能生成还原糖。各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度的不同，可以将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成还原性的单糖。在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸共热，3，5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸和其他产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光值，查对标准曲线并计算，便可分辨出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解成单糖时，每断裂一个糖苷键需要加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0

17、.9。二、仪器、试剂和材料1.仪器（1）离心管或玻璃漏斗2（2）烧杯：1001（3）三角瓶：1001（4）容量瓶：1003（5）刻度吸管：1ml1;2ml4;10ml1（6）恒温水浴锅（7）电炉（8）离心机（9）电子天平（10）分光光度计2.试剂（1）1mg/ml葡萄糖标准溶液(2)3，5-二硝基水杨酸（nds）试剂（3）碘-碘化钾溶液（4）酚酞指示剂（5）6m hcl和6m naoh 各100ml三、操作步骤1.葡萄糖标准曲线的制作取7支20ml具塞刻度试管编号，按表一分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液、蒸馏水和3，5-二硝基水杨酸（nds）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。试剂管

18、号123456葡萄糖标准溶液（ml）00.10.20.30.40.5蒸馏水（ml）10.90.80.70.6053，5-二硝基水杨酸(ml)0.750.750.750.750.750.75将各管摇匀，在沸水域中加热5min，取出后立即冷却至室温，再加入蒸馏水9ml，混匀。在540nm波长下，以一号管调零，分别测定其余试管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。2.样品中还原糖和总糖含量的测定（1）样品中还原糖的提取：准确称量3g玉米粉，放在100ml三角瓶中，先以少量的蒸馏水调成糊状，然后加入50ml蒸馏水，搅匀，至于50恒温水浴锅中保温20min，使还原糖浸出，将浸出液

19、（含沉淀）转移到六支10ml离心管中，于4000r/min下离心5min，沉淀可用20ml蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清夜收集在100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。（2）总糖的水解和提取：准确称取1.00g玉米粉，放入100ml三角瓶中，用15ml蒸馏水及10ml 6m hcl,置沸水域中加热水解30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查），待三角瓶中的水解液冷却后，加入一滴酚酞指示剂，用6mol/l naoh中和至微红色，在100ml容量瓶中用蒸馏水定容，混匀。将定容后水解液过滤，取滤液10ml，移入另一100ml容量瓶定容，混匀，作为总糖待测液。（3

20、）显色和比色取4支试管，编号，按下表所示操作管号还原糖测定管号总糖测定管号1212还原糖待测液（ml）0.50.5总糖待测液（ml）0.50.5蒸馏水（ml）0.50.50.50.53，5-二硝基水杨酸(ml)0.750.750.750.75加入试剂后，在沸水域中加热5min，冷却至室温，在540nm波长处测吸光值。d、样品中灰分及水分的测定（恒重法）：（一）样品中灰分的测定1洗两个瓷坩埚放到烤箱中干燥后，用铅笔在瓷坩埚上标记，放到马弗炉中恒重2小时（马弗炉的温度为600）；2.待温度降到200左右时，将瓷坩埚取出放到干燥器中冷却至室温，用电子天平准确称出其质量，记下数据；3.继续将瓷坩埚放到

21、马弗炉中恒重1小时，取出冷却后准确称出其质量，记下数据，两次数据相对误差不超过万分之五就可使用；4.将瓷坩埚放到电子天平上，分别称取玉米粉1.000g放入其中，然后在电炉上碳化至无青烟飘出后，把瓷坩埚放到马弗炉中（马弗炉的温度为600），四小时后关闭马弗炉电源，待温度降到200左右时，取出瓷坩埚冷却后称出质量；5.再将瓷坩埚放回马弗炉中恒温1小时，待温度降到200左右时，取出瓷坩埚冷却后称出质量；两次数据相对误差不超过万分之五即可；6.计算灰分含量=m灰分质量m样品质量100%（二）样品中水分测定1.将两个洗净的称量瓶放到烤箱中恒温干燥至恒重；2.分别称取玉米粉2g与称量瓶中，然后放到烤箱中恒

22、温干燥至恒重；3.用减量法称出称量瓶的质量，计算水分含量=m水分m样品质量100%五、实验结果与计算（一）玉米粉中粗蛋白的测定消化管号1234葡萄糖质量（g）0.54410.5123玉米粉质量（g）0.50080.5302硫酸铜质量（g）0.53050.52670.53790.5208硫酸钾质量（g）3.07913.01023.05553.0769浓硫酸体积（ml）10101010滴定消耗hcl(ml)3.633.8200含氮量%6.09%6.05%00=0.1mol/lv滴定体积14含氮系数m样品总质量100%1=0.10.00363146.00.5008100%=6.09%2=0.10.0

23、0382146.00.5302100%=6.05%=(1+2)2=（6.09%+6.05%）2=6.07%（二）粗脂肪的测定抽提瓶编号12恒重抽提瓶及沸石总质量（）97.886792.0005玉米粉质量（）5.02315.0024干燥后抽提瓶及油脂总质量（）98.031692.1487粗脂肪质量（）0.14490.1482含油量（）2.88%2.96%平均含油量（%）2.92%含油量=m油脂质量m总质量100%1=98.0316-97.88675.0231100%=2.88%2=92.1487-92.00055.0024100=2.96%=(1+2)2=2.92%（三） 样品中还原糖和总糖的含

24、量测定1. 制作葡萄糖标准曲线管号123456葡萄糖标准溶液（ml）00.10.20.30.40.5蒸馏水（ml）10.90.80.70.6053，5-二硝基水杨酸(ml)0.750.750.750.750.750.75吸光度a54000.1150.2870.4680.6470.794由上表绘制的葡萄糖标准曲线如下：2. 还原糖和总糖测定还原糖%=查曲线所得还原糖质量（mg)测定时取用体积提取液总体积样品质量（mg)100%总糖%=查曲线所得水解后还原糖质量（mg)稀释倍数样品质量（mg)100%管号还原糖测定管号总糖测定管号1212还原糖待测液（ml）11总糖待测液（ml）0.50.5蒸馏水

25、（ml）0.50.50.50.53，5-二硝基水杨酸(ml)0.750.750.750.75吸光值a54001890.1920.3260.303平均吸光值a5400.19050.3145对应标准曲线葡萄糖含量（mg）0.13120.2069由以上数据可计算得：还原糖%=07100%=0.43%总糖%=0.20691025.4100%=0.02%（四）灰分及水分测定1.灰分测定坩埚编号12恒重坩埚质量（）32.818231.6444玉米粉质量（）1.07681.0114坩埚及灰分质量（）32.828131.6530灰分含量（）0.919%0.850%计算公式：=m灰分质

26、量m样品质量100%1=32.8281-32.81821.0768100%=0.919% 2=31.6530-31.64441.0114100%=0.850%则：=（0.919%+0.850%）/2=0.8845%2.水分测定称量瓶编号12恒重后称量瓶质量（）19.495215.3729玉米粉质量（）2.01262.0240干燥后称量瓶及玉米粉质量（）21.344717.2339干燥后玉米粉质量（）1.84951.861水分（）0.16310.1630含水量（）8.10%8.05%计算公式：=m水分m样品质量100%1=2.0126-（21.3447-19.4952）2.0126100%=8.

27、10%2=2.0240-（17.2339-15.3729）2.0240100%=8.05%则：=（8.10%+8.05%）/2=8.075%六 结论 本实验通过测量粗脂的含量，灰分，水分，含氮量的测定，以试验数据充分知道了玉米粉的各项含量，对本实验含氮量了解了玉米粉中的营养成分的多少。实验以对照组重复实验，增加了实验数据的可靠性。七 注意事项 1.标准曲线制作与样品的含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。 2.用乙醚提取还原性糖类。 3.在做样品还原糖的实验时一定不要取到沉淀，沉淀对测量有影响。八、讨论1、索氏提取脂肪为什么提取的是粗脂肪，提取时应该注意哪些问题?答：所有溶于提取液的物质都会被

28、提取出来，溶于提取液的物质除了脂肪外，还有别的物质，所以提取出来的是粗脂肪。1接好装置,保证密闭性.2用滤纸或滤布包好要提取的东西,放在索氏提取器里面,从上端加入提取液,注意提取液的高度不要超过虹吸管上端2、凯氏定氮法的适用范围及其优缺点是什么？答：凯氏定氮针对有机氮化合物,主要是指蛋白质,核酸,尿素以及大量合成的氮为负三价的有机氮化合物.它不包括叠氮化合物,联氮,偶氮,腙,硝酸盐,亚硝酸盐,硝基,腈,肟和半卡巴腙类的含氮化合物.凯氏定氮法只是一个氧化还原反应,把低价氮氧化并转为氨盐来测定,而不能把高价氮还原为氮盐的形式,所以不可以测出物质中所有价态的氮含量.实验二 苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性

29、测定一、目的1. 掌握大分子分离纯化的一般步骤和原则；2. 了解层析技术、离心技术。超过滤技术的原理及应用；3. 学习一种常用的酶活力测定方法；二、原理苯丙氨酸解氨酶（l-phenylalanine:ammonia lyase,简称pal；ec4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等的合成密切相关。在植物生长发育和抵制病菌侵害的过程中起重要作用。pal催化l-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸在290nm处有强大的吸收值。规定1h内增加0.01为pal的一个活力单位。酶的比活力是指样品中每毫克蛋白所含的酶活力单位数。在实验中将会看到随着p

30、al的逐步被纯化，其比活力也在逐步增加。在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为盐析。溶液的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱和溶液称100%饱和度。沉淀一种酶所需的具体浓度需要经试验确定。 sephadex（交联葡萄糖凝胶）是由细菌葡聚糖长链，用交联剂1-氯2-，3-环氯丙烷交联而成。凝胶商品名后面的g值表示每克干胶吸水量（毫升数）的10倍。交联度大，网孔小；交联度小，网孔大。交联度的大小还与凝胶颗粒的机械强度有关，交联度大，机械强度也大（硬胶），在柱层析中流速快。根据需要，选用一定型号的凝胶柱做柱层析介质（蛋白脱盐一般用g-25或g-50，g-100g-2

31、00分离不同分子质量的蛋白组分）。由于被分离物质的分子大小和形状不同，分子质量大的进入凝胶网孔中被阻滞，从而后流出层析柱，达到分离的目的。 deae纤维素是以天然纤维素为母体联接了二乙基氨基制备而成的。deae纤维素柱层析属于阴离子交换层析的一种，deae纤维素经过处理上柱后，由于静电吸力等可吸引在固定相和流动相中的一些阴离子（如oh-、cl-等）。蛋白质粉在水溶液中可以做两性解离，控制溶液ph，可使蛋白质分子成为阴离子。对于deae纤维素而言，应使酶溶液ph大于酶蛋白分子的ph，使其成为阴离子。在实验中还要测定蛋白质的含量，用考马斯亮蓝法。考马斯亮蓝法是染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态

32、下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者的最大光吸收在456nm处。在一定的蛋白质浓度范围内（0-100微克/毫升），蛋白质-色素结合物在波长595nm处的光吸收与蛋白质的含量呈正比，故可以用于蛋白质的定量测定，而且该反应非常灵敏，可用于测定微克级蛋白含量。三、实验器材1. 仪器(1) 高速冷冻离心机(2) 研钵(3) 恒温水浴锅(4) 电子天平(5) 试管、烧杯(6) 量杯(7) 量筒(8) 层析柱(9) 移液管（10）胶头滴管（11）蛋白质核酸自动分析仪（12）紫外分光光度仪（13）可见分光光度仪等2.试剂(1)0.1mol/l硼酸-硼砂缓冲液（ph=8.7）(2)酶提取液0.1mol/

33、l(3)6mol/l的hcl(4)固体硫酸铵(5)0.02mol/l磷酸盐缓冲溶液（ph=8.0，含0.5mmol/l edta,2.5%甘油，20nlmol/l.- 基乙醇）(6)sephadexg-25(7)标准蛋白质溶液（0.1ug/ml）(8)考马斯亮蓝g-250蛋白质染色液（称取10mg考马斯亮蓝g-250，溶于5ml95%乙醇中，加入85%（w/v）磷酸10ml，混匀后即为母液。用时按15ml母液加85ml蒸馏水的比例稀释，混匀后过滤即为稀释液(9)0.6mol/l苯丙氨酸溶液3.材料：马铃薯四、操作步骤1.酶液提取（1）用电子天平称取马铃薯5g，切成小块，加入10ml酶提取液，于

34、冰浴上同时加石英砂，用研钵研成浆。（2）用胶头滴管浆已经匀浆的酶液转入离心管，再用少量的提取液冲洗研钵及研棒，将冲洗液转移到同一个离心管中，在8000转下离心15分钟。（3）取离心后的上清液（即粗酶提取液），倒入量筒量出其体积。（4）从粗酶提取液中吸出1ml于eppendorf管中放入冰箱，作为后面活力测定用（贴好标签，置于冰箱中）。2.硫酸铵分级沉淀酶蛋白（1）余下的酶液根据实际体积、温度和饱和硫酸铵的用量表，算出达到38%饱和度应该加入的硫酸铵的量（38%饱和100ml加硫酸铵21.32g），并称取硫酸铵。（2）将酶液倒入烧杯中，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铁，待全部加完后，再缓慢搅

35、拌10分钟；然后然后于8000r/min下冷冻离心15分钟，保留上清液于烧杯内。（3）根据硫酸铵饱和度用量表，算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵的用量。（4）按上述方法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。（5）将沉淀溶于4ml酶抽提液中，取1ml于eppendorf管中冰箱保存，以作为后面活力测定用。3.sephedexg-25 层析脱盐（1）凝胶溶胀：称取sephedexg-25g，加入适量的0.02mol/l磷酸盐缓冲溶液，在室温下溶胀。待溶胀平衡后，虹吸去除上清夜中的细小凝胶颗粒，这样处理2-3次。（2）装柱：固定好层析柱，柱保持垂直，将20ml蒸馏水装入柱内，打开止水夹赶去出口内气泡

36、，当柱内保留1ml左右水层时，把处理好的sephedexg-25 用玻璃棒搅匀，尽量一次加入柱内，待胶床表面仅有1-2cm液层时，旋紧止水夹。装好的胶柱应无气泡、无节痕、床面平正。（3）上样：让胶床表面几乎不留液层，将lml 酶液小心注入胶床面中央，注意不要冲坏床面，吸取lml 磷酸盐缓冲液，把吸附在玻璃壁上的沉淀液洗入柱内，在床表面仅有lml 左右液层时，再小心地用滴管加入5-6cm 高的磷酸缓冲液洗脱。（4）洗脱收集：取刻度试管5支（包括上面一支），编号，柱床上不断加磷酸缓冲液洗脱，出水口用刻度试管收集处溶液。（5）将出现峰值的试管集中在一起。吸取1.0ml 于eppendorf管保留，以

37、作后面活力测定用。4.酶活力的测定（1）取试管4支，按下表所述加样（0号为调零管，其余为测定管）试管编号0e1e2e30.1mol/l硼酸缓冲液（ml）5.003.903.903.90酶液（ml）0.100.100.100.06mmol/ll苯丙氨酸溶液（ml）_1.001.001.00a29000.16080.12290.0699（2）将各管混匀，放入40。c恒温水浴锅中保温30min，然后加入0.2ml 2mol/l的hcl终止反应。（3）紫外分光光度计预热10min，于波长290nm处测定各管的a2905.蛋白质含量测定（考马斯亮蓝染色法）（1）取第一次和第二次eppendorf管中保留的酶提取液各0.1ml，用蒸馏水稀释50倍，取第三次eppendorf管中的酶提取液0.5ml，用蒸馏水稀释10倍。（2）取9支试管按下表加入各种溶液，并做一组平行组。试管编号012345e1 稀释酶液e2 稀释酶液e3 稀释酶液0.1mg/ml标准蛋白溶液（ml）00.20.40.60.81.0稀释酶液（ml）111蒸馏水（ml）2.