SNPs功能学研究理论策略和实践PPT课件

1、2021/4/13,1,提 纲,单核苷酸多态性 Single Nucleotide Polymorphism 基因多态性与疾病发生遗传易感性 Gene Polymorphism and Genetic Susceptibility to Disease 启动子区单核苷酸多态性的功能学研究 Functional Study on SNPs within Promoter Region 展望 Future Prospects,DNA Structure,2021/4/13,3,Human Genome Project,2021/4/13,4,基因突变,基因突变（Gene Mutation)：一个基

2、因内部由于DNA碱基对的置换、插入或缺失而引起的可以遗传的基因结构的变化。 广义的突变还包括染色体畸变，狭义的突变专指点突变。 基因突变通常可引起一定表型（Phenotype）的变化。,2021/4/13,5,基因突变,根据基因结构的改变方式，基因突变可分为碱基置换突变和移码突变两种类型： 碱基置换突变：由一个错误的碱基对替代一个正确的碱基对的突变叫碱基置换突变。碱基替换过程只改变被替换碱基的那个密码子，不会涉及到其他的密码子。 移码突变：基因中插入或者缺失一个或几个碱基对，使DNA的阅读框架（读码框）发生改变，导致插入或缺失部位之后的所有密码子都随着发生变化，结果产生一种异常的多肽链。 碱基

3、对：形成DNA、RNA单体以及编码遗传信息的化学结构。组成碱基对的碱基包括A、G、T、C、U。严格地说，碱基对是一对相互匹配的碱基（即A：T， G：C，A：U相互作用）被氢键连接起来。 密码子：mRNA链上决定一个氨基酸的相邻的三个碱基叫做一个“密码子”，亦称三联体密码。,2021/4/13,6,基因突变,根据遗传信息的改变方式，基因突变又可以分为同义突变、错义突变和无义突变三种类型： 同义突变：DNA的一个碱基对改变并不影响其所编码蛋白质氨基酸序列，这是因为改变前后的密码子为简并密码子，编码同一种氨基酸。 错义突变：一对或几对碱基对的改变使决定某一氨基酸的密码子变为决定另一种氨基酸的密码子。

4、该突变有可能使其所编码蛋白质部分或完全失活。 无义突变：一对或几对碱基对的改变使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子。,2021/4/13,7,单核苷酸多态性,单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNPs）：指在基因组水平由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。 SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中即有1个，人类30亿碱基中大约有1000万个SNPs。 SNPs如只涉及单个碱基的变异，可由单个碱基的转换（Transition，嘌呤嘌呤或嘧啶嘧啶）或颠换（

5、Transversion，嘌呤嘧啶）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNPs是指转换和颠换。,2021/4/13,8,单核苷酸多态性,人类中最常见的为CT（GA）转换，约占2/3。 转换频率发生较高的原因是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶（C）残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发脱去氨基形成胸腺嘧啶（T）。,单核苷酸多态性,Example of an SNP comprising a GA substitution Electropherograms produced by fluorescence-based sequencing using an

6、ABI 3700 showing the genomic DNA from an individual homozygous for G at the site of the SNP (a) and an individual homozygous for A (b). The base substitution is denoted by an arrow.,2021/4/13,10,单核苷酸多态性,人类基因组中大约每个基因有两个常见的错义突变。 在公共数据库中至少有500万个SNPs。 仅有少量（可能为50,000250,000）SNPs在一定程度上（小到中等度）能反映与疾病发生危险相关的

7、表型。 根据SNPs在基因中的位置，可分为基因编码区SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周边SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因间SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三类。,2021/4/13,11,单核苷酸多态性,63% Intronic（内含子） 24% Locus region（基因座区） 11% Untranslated region（非翻译区） 1% Nonsynonymous（nsSNPs，错义SNPs, 改变氨基酸） 1% Synonymous（同义SNPs,不改变氨基酸） 1% Splice site（剪

8、接位点） 1% Unknown coding variant（不明编码变异）,SNPs在基因组中的分布十分广泛，但不同的区域出现的频率不同。SNPs分布区域：,2021/4/13,12,单核苷酸多态性,SNPs应用极为广泛 多基因病和复杂性疾病如人类肿瘤、糖尿病、自身免疫性疾病、老年性痴呆等的病因学及发病机制探讨。 应用于“药物基因组学”(Pharmacogenomics)研究，揭示人群中不同个体对不同药物的敏感性差异原因。 用于法医学研究，如罪犯身份的鉴别、亲子鉴定等。 用于器官移植中供体和受体间的配对选择。 用于研究人类起源、进化和群体遗传学特征。,SNPs研究所揭示的人种、人群和个体间D

9、NA序列的差异将对疾病的诊断、治疗和预防带来革命性的变化。,2021/4/13,13,单核苷酸多态性,今后SNPs的研究主要包括两个方面： SNPs数据库构建：主要目的是发现特定种类生物基因组的全部或部分SNPs。非常规实验室所能胜任。 SNPs功能研究：是SNPs研究的目的。特定DNA区域的特定SNPs在特定群体的序列验证和频率分析以及SNPs与特定生理/病理状态关系的研究是今后SNPs研究的主要方向。,2021/4/13,14,标签SNPs（TagSNPs）,染色体中相邻一组SNPs是以blocks形式遗传。某block中的SNPs谱（SNP pattern）称为单倍型（haplotype

10、）。 Blocks中可能存在很多SNPs, 但少数SNPs即足以独特地识别该block中的单倍型。 把能够识别单倍型的特异SNPs称为标签SNPs（Tagging SNPs, TagSNPs），它是高度连锁的基因组区域的代表性SNPs。,SNP1 (locus 1),SNP2 (locus 2),G,A,T,C,Diploid,Genotype: G/T A/C,Haplotype GA TC,SNP and Haplotype,Modified from Yang /seminars/ppt/hap-pool.ppt.,2021/4/13,1

11、6,标签SNPs（TagSNPs）,无需对某染色体区域每个SNP进行基因分型即可识别遗传变异。 标签SNPs能捕捉一个区域中绝大多数的差异所在，可有效地降低研究费用。 国际人类基因组单倍型图计划(HapMap Project)希望利用标签SNPs发现与人类疾病相关的基因。,2021/4/13,17,提 纲,单核苷酸多态性 Single Nucleotide Polymorphism 基因多态性与疾病发生遗传易感性 Gene Polymorphism and Genetic Susceptibility to Disease 启动子区单核苷酸多态性的功能学研究 Functional Study

12、on SNPs within Promoter Region 展望 Future Prospects,2021/4/13,18,问题,基因选择 哪些基因和位点值得研究？ 相对于全基因组，候选基因研究有何优点？ 如何将SNP功能信息融入相关性研究中？ 实验室方面 如何选择合适的实验室方法？ 如何进行质量控制？ 如何利用公共数据库信息？ 研究设计和数据分析 何种研究设计和分析方法是实现研究重现性所必需？ 如何处理人群遗传结构上的差异，如单倍型区段、种族差异等？,2021/4/13,19,基因选择,各物种基因数量比较,物 种 基因数量 小鼠（Mouse） 30,000 拟南芥（Arabidopsis

13、） 27,000 人类（Human）25,000 线虫（C. elegans） 19,500,2021/4/13,20,基因选择,候选基因（Candidate Genes） 候选基因具有对生物学合理性(Biological Plausibility)和疾病因果关系(Disease Causality)作最大化推理(Maximizing Inferences)的优点。 候选基因可根据某一特定疾病发生过程中基因功能信息来加以限制。,2021/4/13,21,基因选择,生物学上的考虑：基于疾病的发病机制(生物学合理性、权威的科学假说等),易感基因（Susceptive Genes） 敏感基因（Sen

14、sitive Genes） 生物学通路（Biological Pathways）,Apoptosis Pathway,,Base Excision Repair Pathway,,Folate Metabolism Pathway,DNA Damage-Response Pathway,p53 Protein Accumulation,Binding to Transcription-Replication-Repair Factors TFIIH (XPB, XPD) and p62 binds to p53

15、 PCNA (p21WAF1 and GADD45),Altered Expression BAX and Fas Bcl2,Increased Expression p21WAF1, MDM2, cyclin G, and GADD45,Modified from Harris, 1994,2021/4/13,26,基因选择,药物治疗反应（Treatment Response） 基因表达改变（Gene Expression Changes） 病人的存活状况（Survival Status） 药物的毒副反应（Side Effects or Toxicities）,这些因素与某一特定药物、后续事

16、件的时序以及剂量等有关。,如在药物遗传学和药物基因组学研究领域，在选择候选基因时可考虑下列因素：,2021/4/13,27,多态性位点选择,复杂疾病的易感性往往是由稀少的变异（Rare Variants）所决定。 错义SNPs（nsSNPs）或调控SNPs（rSNPs，指可导致基因转录调控改变的SNPs）是人类个体间差异的重要分子基础。 未来研究的重要挑战是对rSNPs的识别和功能揭示。,2021/4/13,28,多态性位点选择,多态性位点选择次序 编码区SNPs：外显子(Exon) 非编码区SNPs Promoter Region-转录调控 5-UTR-转录调控 Splice Site-剪切

17、 3-UTR-mRNA稳定或转录后翻译 Intron-剪切？,2021/4/13,29,多态性位点选择,关于基于全基因组和单倍型的研究 合适的流行病学设计和足够的统计学功效（Statistical Power）是必需的。 尽管全基因组研究不易重复，但仍可识别基因组中与疾病发生存在因果关系的区域（Causative Regions）。 连锁不平衡区段（Linkage Disequilibrium Blocks) 存在于整个基因组中，其长度可因人群遗传学结构上的差异而不同。 采用单倍型区段（Haplotype Block）的信息较单纯基于SNP的分析可提高1550%的功效。,2021/4/13,3

18、0,基因选择的总结,全基因组研究方法在今后的研究中是可行的，但在高通量、数据库以及统计分析方面将面临巨大挑战。 候选基因方法在确定特定疾病因果关系上仍然具有重要的意义。 SNPs功能学意义是理解和认识流行病学关联性研究生物学基础的关键。 在关联性研究的基础上，应深入探讨SNPs的功能学意义，包括对基因翻译和转录调控等的作用。,一、基于候选基因研究： 疾病发病机制假说 Environment-gene Interaction,二、基于全基因组的研究： 基因芯片（DNA Microarray) 基因表达谱（Gene Expression Profile ） 差异表达基因 功能鉴定筛选重要基因 标签

19、SNPs（TagSNPs）,研究的总体思路,2021/4/13,32,实验室研究,高并联（High Parallel）：小样本多位点 高通量（High Throughput）：大样本少位点,理想的基因分型方法应包括5-10%重复样本,优化实验通量和质量控制，两种方案：,2021/4/13,33,实验室研究,实验室研究的主要问题是质量控制。 基因型的错误分类(Misclassification)可导致偏倚(Bias) 常见的实验室问题包括DNA污染、DNA质量或数量不合适、样本/板方向标错、检测误差等。 基因分型时应包括盲样重复、阳性对照和空白对照。,对于病例-对照研究（Case-Control

20、 Study），病例和对照样本不应分开检测以减少潜在的错误。,2021/4/13,34,实验室研究,基因多态性的检测方法 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism):限制性片段长度多态性 PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism):单链构像多态性分析 PCR-SSP(sequence specific primers):序列特异引物聚合酶链反应 DNA Sequencing：DNA测序 PCR-ASO(allele specific oligonucleotide):等位基因特异性

21、寡核苷酸探针法 PCR-SSO(sequence specific oligonucleotide):顺序特异寡核苷酸法 PCR-荧光法 PCR-fingerprints:PCR指纹图法 DNA Microarray:DNA微探针阵列，又称基因芯片法 ,2021/4/13,35,SNPs相关数据库,公共数据库和资源，常用的网址如下： /SNP (National Center for Biotechnology Information) / (NIEHS SNPs Program) htt

22、p://home_1.cfm?CFID=264728 Lanes 3, 7, and 8： represented the mobilities of the labeled probes with nuclear extracts in the absence of competitor. A specific nuclear protein binding can be completely abolished both by 100-fold unlabelled 1797C or C/EBP probes (Lanes 4 and 5).

23、 Super shift assays incubating with anti-C/EBP antibody showed a supershifted protein complex (Lanes 2 and 9).,C1797G多态性与膀胱癌组织MDM2 mRNA表达水平关系（RT-PCR）,C1797G多态性与膀胱癌组织MDM2 蛋白表达水平（Western blot),Lanes 1-2:1797CC;Lanes 4-5:1797CG;Lane 3:1797GG,Lanes 4, 7-9, 11-12, and 16-22: 1797CC Lanes 1-3 and 13-15: 1

24、797CG Lanes 5-6 and 10: 1797GG,研究实例二 RUNX3标签SNPs与 膀胱癌遗传易感性研究,2021/4/13,79,RUNX3 基本信息,人类RUNT相关转录因子3(human runtrelated transcription factor 3，RUNX3)基因属RUNT家族成员，参与胚胎发育过程中细胞基因表达的调控。 人类RUNT家族成员包括3个RUNT基因，分别为RUNX1、RUNX2和 RUNX3。其中RUNX3是最小的，是哺乳动物RUNT家族进化的基础，对其研究也是最少的。,2021/4/13,80,RUNX3 的定位、结构特点,定位：基因位于染色体l

25、p36 基因全长约67kb，含有P1和P2两个启动子，6个外显子和1290bp的ORF，内含子1跨越了整条基因全长的一半(35 kb),2021/4/13,81,TagSNPs选择,HapMap数据库日期为2007/01，所选人群为CHB、MAF=0.10，标签选择方法为pairwise tagging only The location of 10 tagSNPs in the RUNX3 gene. The exons are indicated by black boxes and the 5and 3UTR are denoted by gray boxes.,Significance

26、 of each tagSNPs. Associations of tagSNPs are indicated by negative base-10 logarithm of the P values for each allele. Point above the dotted line represents tagSNP association found to be significant at the P = 0.05 level.,2021/4/13,83,rs760805分层分析,2021/4/13,84,10个tagSNPs单倍型分析,2021/4/13,85,SNPs之间交互

27、作用研究,Potential locuslocus and geneenvironment interactions were performed by using the non-parametric multifactor dimensionality reduction (MDR) software. Then, interaction dendrogram was employed. The attributes (i.e. SNPs) that were strongly interacting appeared close together at the leaves of the

28、 tree, whereas those that do not interact appeared far from one another.,Interaction dendrogram: The colors indicate the type of interactions. Red denotes a high degree of interaction, orange a lesser degree, and green represents week interaction. The hierarchical cluster analysis placed SNP4 and SN

29、P10 on the same branch but SNP3, SNP5, SNP7, SNP8 and pack-years of smoking on the other branch.,2021/4/13,88,提 纲,单核苷酸多态性 Single Nucleotide Polymorphism 基因多态性与疾病发生遗传易感性 Gene Polymorphism and Genetic Susceptibility to Disease 3. 启动子区单核苷酸多态性的功能学研究 Functional Study on SNPs within Promoter Region 展望 Fut

30、ure Prospects,2021/4/13,89,人类基因组计划(HGP)和环境基因组计划(EGP) 大范围SNP识别计划(Large-scale SNP Identification Project),展望,宿主遗传学特征决定了复杂疾病发生的易感性，这方面的研究已经覆盖了临床医学的各个领域。,上述两个计划将为全基因组遗传相关性研究和精确地绘制疾病易感性基因座（Loci）提供大量的遗传标志物。,2021/4/13,90,采用基于单倍体结构的高通量基因分型方法对于SNPs与疾病发生易感性研究将更为合理，但研究所需的标志物数量和样本量令人望而却步。 采用体内和体外方法研究SNPs的功能 人类基

31、因密集遗传学图谱的绘制 评价环境暴露与人类疾病的关系,展望,SNPs功能学研究思路,2021/4/13,92,Thank You!,2021/4/13,93,实验室研究,高并联（High Parallel）：小样本多位点 高通量（High Throughput）：大样本少位点,理想的基因分型方法应包括5-10%重复样本,优化实验通量和质量控制，两种方案：,2021/4/13,94,Case-Control Study,病例与对照的基本来源有两个: 以医院为基础（Hospital-based）：来源于医院的现患病人、医院、门诊的病案及出院记录等 以社区为基础（Community-based）：来源于社区、社区的监测资料或普查、抽