哺乳动物基因工程xin

1、第十六章 哺乳动物基因工程,第一节 高等哺乳动物基因工程的基本概念,概念：动物基因工程是利用dna重组技术对动物所进行的工程操作。,遗传学动物基因工程：外源基因能够通过配子进行垂直传递并稳定的遗传。 非遗传性动物基因工程：转基因仅在当代表现，不能够遗传给子代。,高等哺乳动物的基因工程,高等哺乳动物转基因技术,高等哺乳动物细胞基因表达技术,转基因动物个体,动物工程细胞,哺乳动物遗传性状改良 药物筛选研究评价模型 人体基因治疗,蛋白质多肽物质大规模生产 药物筛选研究评价模型,第二节 转基因的动物受体细胞,一、高等哺乳动物细胞的生长特性,正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：,锚地依赖性：细胞

2、必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂。,血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长。 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制。 形态依赖性：细胞呈扁平状，并有长纤维网状结构。,上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。,二、高等哺乳动物受体细胞的条件,以高效表达外源基因的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件：,细胞系特征：丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大规模培养。 遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢

3、失，易于长期保存。,合适的标记：便于转化株的筛选和保持。 生长快且齐：分裂周期短，生长均一，便于控制。 安全性能好：不合成分泌致病物质，不致癌。,三、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,营养缺陷型哺乳动物受体细胞,含有胸腺嘧啶核苷激酶（tk）编码基因缺陷的受体细胞（tk-）：不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基（hat培养基）上生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补。,含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（hprt）编码基因缺陷的受体细胞（hprt-）：不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基（hat培养基）上生长，载体上的标记基因hprt能与之遗传互补。,哺乳动物受体细胞

4、常见的遗传选择标记：,常用的高等哺乳动物受体细胞,目前，用于医疗用品大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要是：中国仓鼠卵巢细胞。,遗传背景清楚，生理代谢稳定。 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确。 基因转移和载体表达系统完善。 耐受剪切力，便于大规模培养。 被美国fda确认为安全的基因工程受体细胞。,其优势如下：,第三节 转基因导入动物体内的方法,一、动物细胞物理转化法,优点：转基因不含任何病毒基因组片段，对于基因治疗尤为安全。 缺点：转基因进入细胞后往往多拷贝随机整合在染色体上，导致受体细胞基因灭活或转基因不表达。,磷酸钙共沉淀法,细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链dna的能力。 将待转移的dna

5、加入氯化钙和磷酸盐，生成dna-磷酸钙沉淀，加入培养液中。 由于细胞的吞噬作用，dna-磷酸钙沉淀物进入细胞，dna释出后先进入细胞质、再进入细胞核，整合到受体细胞的染色体上。,磷酸钙转染的基本步骤：,dna-磷酸钙共沉淀物中dna的数量； 共沉淀物与细胞接触的保温时间； 甘油或dmso等促进因子作用的持续时间等。,影响磷酸钙转染效率的因素：,磷酸钙转染的最适条件,电击转化法（electroporation）,将受体细胞悬浮于含有待转化dna的溶液中，在盛有上述悬浮液的电击池两端施加短暂的脉冲电场，使细胞膜产生细小的空洞并增加其通透性，此时外源dna片段便能不经胞饮作用直接进入细胞质。,脉冲的

6、最大电压 脉冲持续的时间,影响因素：,与dna浓度则无多大关系。,脂质体包埋法,脂质体(liposomes)是一种人造的脂质小泡(lipid vesicles)，外周是脂双层，内部是水腔。用它作载体可以把外源dna导入培养的哺乳动物细胞。,将适宜的脂质悬浮在液体介质中，然后迅速地振荡，使之形成大小相当一致的脂质体； 用小型的注射针头，将脂质注射到酒精水溶液中，并快速混匀。,脂质体的制备的两种方法：,脂质转染法：以脂质体为媒介的外源dna导入受体的方法，叫做脂质转染法。,第一种脂质转染法：将外源dna与阳离子型的脂质体混合形成dna-脂质复合物。这种复合物可有效地被受体细胞捕获，实现基因的高频率

7、转移，故这种方法又叫做dna-脂质复合物转染法。在这个过程中，dna并不是被包装在脂质体的内部，而是通过两者之间的静电引力作用结合在一起的。,第二种脂质体转染法又称脂质体载体法：它是将外源dna包装在脂质体的内部，然后通过脂质体的双层膜同受体细胞膜之间的融合作用，使外源dna进入细胞质，尔后再进入细胞核，实现基因的表达。,制备程序比较简单，可以通过多聚碳酸脂滤膜消毒灭菌， 用它包装的dna在4下可长期保存不失活性，,脂质体载体法的优越性：,dna显微注射法,应用玻璃显微注射器，可以把重组dna直接注射到哺乳动物细胞的细胞质或细胞核。,真正的显微注射(true microinjection)法，

8、dna是由注射针直接注入细胞。,“穿刺”(pricking)导入法，dna是处在细胞周围培养基中，它通过穿刺形成的小孔进入细胞的内部，或是随穿刺的针头一道进入的。,二、动物病毒转染法,通过病毒感染的方式将外源基因导入动物细胞内的转基因方法。具有定向性好，实验重复性佳，导入效率高等优点。缺点是载体宿主范围有限。,动物病毒的特点：,具有能够被真核细胞识别的有效的启动子； 在感染周期中能够持续地复制使基因达到相当高浓度，并实现有效地表达；,病毒具有能够控制自身复制的顺式元件和反式作用因子，改造后可发展成为能够在细胞内长时间地保持高拷贝的外源基因的复制型质粒载体；,能高效稳定地整合到染色体，可提高外源

9、基因导入寄主细胞染色体的效率； 病毒外壳蛋白能够识别细胞接受器，能够将外源蛋白高效地导入宿主细胞（假病毒粒子法）。,腺病毒（adenoviruses）,一群无囊膜的20面体的病毒，其双链dna的分子大小约为36kb。腺病毒可插入较大的外源dna片段，而且还可以在寄主细胞中大量地增殖。其次，能最大限度地合成病毒编码的蛋白质。,带有反向的末端重复序列，而且在每一条单链的5-末端还共价地连接着一种蛋白质分子。 当它从病毒颗粒中分离出来之时，便会自发地环化起来，尔后许多环形分子又聚合成多聚体。,腺病毒的一般生物学特性,其基因组长约36kb，两端各有一个反向末端重复区（itr），itr内侧为病毒包装信号

10、。基因组上分布着4个早期转录元（e1、e2、e3、e4）承担调节功能，以及一个晚期转录元负责结构蛋白的编码。,腺病毒载体的构建策略有三种,在细胞内同源重组产生重组腺病毒，首先要纯化出全长的腺病毒dna，外源基因插入到带有腺病毒基因片段的穿梭质粒中，将腺病毒dna和重组质粒共转染表达e1基因产物的hek293细胞中，通过噬斑筛选出重组病毒。,将腺病毒全长dna序列克隆入cosmid质粒中，转化大肠杆菌感受菌，在细菌中复制腺病毒dna序列，然后将外源基因片段插入带适当抗性基因的真核表达质粒，将重组真核质粒线性化后，转化带cosmid质粒的大肠杆菌，在高表达cre重组酶的大肠杆菌发生同源重组，将外源

11、基因表达盒插入腺病毒dna中，用这种方法也可以缺失任何区段的腺病毒dna。,将稀有的限制性内切酶位点引入穿梭质粒和腺病毒骨架载体中，将外源基因克隆入穿梭质粒中，再通过酶切连接的方法将外源基因克隆入腺病毒骨架载体，转化大肠杆菌复制重组质粒，转染相应的包装细胞系后，即可产生复制缺陷型的重组腺病毒。,腺病毒dna载体的特点：,基因重排低：外源基因与病毒dna重组后能稳定复制几个周期。 安全性能好：不整合人的染色体dna，不会导致恶性肿瘤。,宿主范围广：对受体细胞是否处于分裂期要求不严格。 使用效果好：外源基因在载体上容易高效表达。,猴肿瘤病毒（sv40）,sv40病毒编码的蛋白质,在sv40病毒基因

12、组中存在着一个增强子序列。其长度为72bp，以串联重复的形式位于基因组dna复制起点的附近，它的主要功能是促进病毒dna发生有效的早期转录，而且具有一般增强子所共有的基本特性。,sv40病毒的增强子序列,野生型的sv40病毒颗粒的包装范围相当严格，超过其基因组大小(5.2kb)的重组dna就不能够被包装为成熟的病毒颗粒。而且，sv40还存在着寄主细胞的局限性，它只能在受纳细胞中增殖，并最终导致寄主细胞的死亡，这样就不能作长期的培养使用。因此，野生型的sv40病毒必须经过改造之后，才能发展成为基因克隆的有用载体。,以sv40为基础的基因克隆载体，主要有两种不同的类型：,取代型的重组病毒载体：外源

13、dna是直接插入在缺陷性的病毒基因组上。由于插入的外源dna片段，在大小上同被取代的病毒基因组区段是等同的，因此形成的重组体dna能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。但为了补充这段被取代的病毒基因组dna的功能，必须使用一种与之互补的辅助病毒。,利用sv40 dna载体表达外源基因的程序：,重组的病毒-质粒载体：在这类载体中，病毒基因组部分只保留下维持在哺乳动物细胞中进行复制所必须的有关序列，但它融合上了一个细菌质粒，因而还能够在大肠杆菌细胞中进行复制和增殖。不过这种重组体分子没有被包装成病毒颗粒，不会出现裂解感染的情况，它实际上是一种类似于质粒的dna分子载体。,sv40 d

14、na载体的特点：,基因表达好：外源基因能高效表达； 基因重排高：病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象； 宿主范围窄：只能转染猴细胞； 装载量较小。,反转录病毒载体,在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因都能够在正常的细胞中转录。 反转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物和脊椎动物。,反转录病毒具有许多优点，便于发展作为动物基因克隆载体。,反转录病毒具有强启动子，克隆此类载体上的外源基因有可能得到有效的表达。 反转录病毒不但感染效率高，而且通常还不会招致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和形成感染性病毒颗粒的能力。,反转录病毒的一般生物学特性,反转录病

15、毒载体的主要类型,辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体,此种带外源选择标记基因的重组病毒基因组有缺陷，不能合成自身蛋白质，故包装所需的全部蛋白质需靠辅助病毒提供。,不需要辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体,当用缺陷性的重组的反转录病毒质粒载体，例如pmlv-gpt dna传染2包装细胞株时，它便会整合到寄主染色体dna上进行转录，合成出具有psi序列的反转录病毒载体rna。,三、工程胚胎干细胞法,胚胎干细胞(embryonic stem cell，es)是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。,胚胎干细胞介导法：是将外源基因直接

16、导人es细胞，经体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。由这种胚胎发育而成嵌合体的转基因动物，即其中有一部分组织来源于整合有外源基因的供体es细胞。在嵌合过程中，被转化的es细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将引人的外源基因传递下去。,第四节 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,某些氨基酸在代谢过程中能生成含一个碳原子的基团，经过转移参与生物合成过程。体内的一碳单位有：甲基(ch3，methyl)、甲烯基(ch2，methylene)，甲炔基(ch,methenyl)、甲酰基(-cho,formyl)

17、及亚氨甲基(-chnh,formimino)等。,一碳单位的代谢,一碳单位不能游离存在，通常由其载体四氢叶酸（fh4）携带。,哺乳动物细胞内的基因扩增现象,氨基喋呤（mtx）是二氢叶酸还原酶（dhfr）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲蝶呤处理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因得以扩增。抗性细胞通过增加相关基因的拷贝数，提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。而且与基因相邻的dna区域同时也被扩增。,dhfr-mtx系统,gs-msx高效表达系统：,谷氨酰胺合成酶（gs）能解除甲硫氨酸亚砜（msx）对动物细胞的毒害作用。先将带有gs编码基因的载体转入

18、培养的哺乳动物细胞中，由于只有多拷贝的gs编码基因才能抗msx，所以在转染过程中不必使用gs缺陷型的受体细胞，而且在正常的msx浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是gs-msx系统比dhfr-mtx系统优越之处。,通过强化基因转录高效表达外源基因,在载体上安装病毒或细胞来源的强启动子以及有效的翻译元件，也可使外源基因高效表达。,细胞巨化病毒cmv的启动子 动物珠蛋白基因的内含子 sv40的终止子和polya化信号序列,绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体上携带内含子结构，因为mrna前体的剪切能促进成熟mrna向胞质的运输，有利于翻译，有的还有信号肽序列。,利用哺乳动物工程细胞生产人

19、源化的小鼠抗体,大多数恶性淋巴癌细胞表面上都有一种特异性的糖蛋白campath。用人源化的小鼠抗campath抗体治疗非霍金淋巴细胞瘤患者，效果良好。重组抗体采用dhfr-mtx系统表达。,利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂,第一个由重组哺乳动物细胞规模化生产的医用蛋白是治疗急性心肌梗塞的溶血栓药物：人组织纤溶酶原激活剂（tpa）。同样采用dhfr-mtx系统表达。人tpa也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。,第五节 转基因动物的应用研究,改良动物经济性状的尝试试图通过转移单个基因改良动物经济性状的研究，至今仍未见成功的报道，尚需对性状表现的生化代谢途径，有关基因的相互作用

20、以及基因定位整合，基因定量表达、组织特异性表达等进行深入的研究。,乳腺生物反应器的研究1987年，gordon首次报道小鼠乳腺中表达tpa蛋白。至今国际上转基因羊、转基因牛等的成功报道实例已有10多种，生产出抗胰蛋白酶、乳铁蛋白、人凝血蛋白因子、蛋白质c等药用蛋白。国外经济学家预期，10年后，转基因动物生产的药物销售额超过250亿美元。,基因药物生产,第一阶段是细菌基因工程 第二阶段是动物细胞基因工程 第三阶段是转基因动物乳腺生物反应器。,乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不回流到血液循环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响；,转基因动物乳腺生物反应器具有以下特点：,乳腺组织是一种

21、有效的蛋白质合成器。一头奶牛一年可生产乳蛋白250-300kg，一只绵羊或山羊一年可生产乳蛋白25-30kg。如果有百分之一的乳蛋白代换成医用蛋白，产量十分可观。,乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯。表达的蛋白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性接近天然产品。 在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖生产群体。,提高动物的抗病能力 通过克隆特定病毒基因组中的某些编码片段，对其加以一定的修饰后转入畜禽基因组，如果转基因在宿主基因组中能得以表达，那么畜禽对该种病毒的感染应具有一定的抵抗能力，或者应能够减轻该种病毒侵染时为机体带来的伤害。,提高动物生长速度 生长激素基因、

22、生长激素释放因子基因、类胰岛素生长因子-1基因等转基因动物的建立已有较多研究。,提高动物产毛性能 羊毛是角蛋白通过二硫键紧密交连组成。 半胱氨酸是制约羊毛质量的选择性氨基酸。 细菌的丝氨酸转移酶（sat）、d-乙酰丝氨硫化氢解酶（das）可以将二硫化物重新转化为半胱氨酸。澳大利亚研究者以sat和das基因建立转基因羊，以提高羊毛质量。,转基因动物研究存在的问题,转基因动物的低效性 转入基因引起完整基因突变 转入基因表达混乱 病毒转基因对宿主的影响 转基因动物模型与预期不符 乳腺反应器的完善 转基因动物及产品的认可,第六节 基因治疗,人类遗传疾病有5000多种，基本上不可能用常规的方法治疗。个别

23、病例只能对症疗法，减轻症状，但不能治愈。基因治疗可能是唯一的方法。,背景和概念,基因治疗（gene therapy）是向靶细胞导入外源基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗遗传病的目的。,1990年，美国国家卫生院（nih）重组dna咨询委员会（rac）批准治疗腺苷脱氨酶（ada）的临床治疗方案，2个病例症状有改善。 1991年上海复旦大学与第二军医大学合作用基因疗法治疗血友病b的临床试验，患者症状有所改善,基因治疗的类型,基因调控治疗从基因水平调控缺陷基因的表达，以达到改善症状的目的。,镰型细胞贫血症是因珠蛋白的链基因突变，产生不正常的血红蛋白所致。用5-氮胞苷抑制甲基化酶，使因甲基化而关闭

24、的基因重新开放，产生hbf以代替hba。,用具有抑制基因表达的反义rna，或能切割rna的核酶，阻断基因的表达。在肿瘤的治疗上，可以在基因水平上抑制肿瘤细胞基因的恶性表达和引导肿瘤细胞逆转。,基因矫正治疗,基因增补将正常基因导入患者的体内，补偿缺陷基因的功能。 基因替换以正常基因取代变异的基因。 基因修复对异常基因进行原位的特异性修复。,生殖细胞基因治疗：对生殖细胞或早期胚胎细胞进行基因矫正。1987年，成功治疗小鼠颤抖症、免疫缺陷症、地中海贫血症等。,按矫正基因的类型分为两种基因治疗：,体细胞基因治疗：以体细胞为受体细胞，不影响下一代。常用的是细胞介导法：选择靶细胞在体外进行基因修饰，再将其

25、输入体内。,基因治疗的条件,对导入的基因及其产物有详尽的了解； 外源基因有效导入受体细胞、稳定整合、适量表达； 不能使受治细胞基因组及表达调控受影响； 导入基因方法安全，载体对靶细胞无害；,基因治疗的原则,对象是病情严重、预后极差、别无他法的患者； 转移的基因被克隆； 无需高水平的表达和精确定量控制就有治疗效果； 靶细胞获取或回输安全；转移基因的表达对细胞微环境无严格的特异性要求。,基因疗法的步骤,目的基因的选择：根据基因治疗的类型选择相应的目的基因（增补、替换、添加）,基因载体的构建：使目的基因在受体细胞内高效、可控、稳定地表达 受体细胞的选择：容易分离获取，在体外增殖存活，大量扩增。如成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓造血干细胞等。,基因治疗的应用,治疗恶性肿瘤,例如，将已导入il-2基因的til细胞回输给病人，启动自身免疫，治疗黑色素瘤。美国已批准8种基因治疗方案。,治疗艾滋病：用射线照射已导入hiv 基因的成纤维细胞，细胞停止分化，但能产生gp160，将细胞回输给病人，能激活免疫系统，杀伤hiv 感染细胞。,治疗家族性高胆固醇血症（fh） 这是肝细胞低密度脂蛋白（ldl）受体基因混乱造成的遗传病，将ldl基因导入病人离体培养的肝细胞中，然后经导管注入门脉循环的血液中，进入肝细胞后表达相应的功能蛋白。,治疗先天性免疫缺陷综合症 病人因缺少腺苷脱氨酶基因（ada）导致t、b淋巴细胞