细胞工程_动物细胞工程【知识荟萃】

1、动物细胞工程,专题2 细胞工程,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体制备,动物体细胞核移植技术和克隆动物,1,借鉴内容,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体技术,核移植,动物细胞工程常用技术,其它动物细胞工程的基础,2,借鉴内容,一、动物细胞培养 二、核移植技术,本节内容：,3,借鉴内容,一、动物细胞培养的应用和概念,1、概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。,2、原理：细胞增殖,4,借鉴内容,定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。,胰蛋白酶处理,取出组织,胚胎或幼龄动物器官组织,剪碎,分散成

2、单个细胞,细胞悬液,转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。,原代培养,3、过程,图示,原代培养,5,借鉴内容,强调一：细胞贴壁过程,细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。,培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。,6,借鉴内容,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,强调二：接触抑制,7,借鉴内容,定义： 当原代培养的细胞处于接触抑制后, 用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）

3、,传代培养,8,借鉴内容,细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。,强调：细胞系、细胞株（了解即可，老课本体系）,细胞系：传代50代以后不能再传下去，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。,9,借鉴内容,3、总结：动物细胞培养过程,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,配置细胞悬液,剪碎用胰蛋白酶处理,10代细胞,转入培养瓶,40-50代细胞,传代培养,无限传代,分散成单个细胞,加培养液稀释,传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。,传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变）,为什

4、么用胰蛋白酶处理？,分瓶培养,原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制,继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。,细胞株：一般说遗传物质未改变,细胞系：遗传物质已改变,原代培养,10,借鉴内容,4.动物细胞培养的条件:,1）无菌无毒 的环境：,适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.50.5。 适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4,液体合成培养基：糖、氨基酸、促生长因子、水、无机盐、微量元素等；通常还需加入血浆、血清等天然成分。,4）气体环境：,2）营养：,3）温度和pH：,“95空气+5CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的；CO2维持培养液的PH。,对

5、培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。,11,借鉴内容,问题3：为什么用胰蛋白酶处理？,问题1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官、组织做动物细胞培养材料？,因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。,问题2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰 蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和 细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。,问题4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？,动物细胞培养的最适PH值

6、为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜PH为2，胃蛋白酶在PH为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。,问题5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？,控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。,12,借鉴内容,问题6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,问题7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等。,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体。,问题8、动物细胞培养的原理：,细胞

7、增殖。,问题9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在10代以内，为什么？,10代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。,13,借鉴内容,5、动物细胞培养技术的应用:,1、蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 2、应用于基因工程 主要用于作为受体细胞 3、检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4、细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物,14,借鉴内容,植物组织培养和动物细胞培养的比较：,15,借鉴内容,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,1、定义： 动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终

8、发育为动物个体。,3、分类： 胚胎核移植、体细胞核移植。,胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。,动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难,2、原理： 动物细胞核具有全能性,16,借鉴内容,4、体细胞核移植过程示动物克隆无性繁殖,1）克隆羊多利培育过程：,另一头绵羊的子宫,特别注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？,不可能！因为： 一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自于受体卵母细胞。 二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。,供体,受体,代孕 受体,17,借鉴内容,1、写出ab所代表细胞工程名称：a表示： b表示:,2、实施细胞工程时，所需受体

9、细胞大多采用卵母细胞的原因：,体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。,3、多利面部毛色是： 根据遗传学原理说明判断依据。,4、若黑面绵羊的基因型为AA,白面绵羊的基因型为aa，则克隆羊的基因型为,核移植,胚胎移植,白色,多利全部的核基因都来自白面绵羊,aa,18,借鉴内容,取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？,用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（M中期）为什么？,激活方法： 激活目的：,促融方法：电刺激,胚胎移植至代孕受体内,妊娠、分娩,2）核移植流程,供体：优质高产奶牛,受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）,1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质

10、和营养条件。,有人说它三个母亲，对吗？,19,借鉴内容,核移植流程:,1、供体细胞的采集与培养,5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。,6、电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。,4、将供体细胞注入去核卵母细胞,3、显微操作去除卵母细胞中的核,2、受体卵母细胞的采集与体外培养,7、胚胎移植入代孕母牛体内,8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。,20,借鉴内容,4、体细胞核移植技术的应用前景,21,借鉴内容,广而告之： 你还在为身体有残疾而苦恼吗？你还在为器官移植找不到合适的工体而焦虑吗？你能再这样下去了，看看我们的体细胞核移植技术吧，只需要从你身上取出一个小小

11、的体细胞，通过核移植培养出胚胎干细胞，再用胚胎干细胞诱导分化出各种组织器官，这样的器官的组织相容性抗原跟你的一模一样，用这样的器官进行器官移植，根本不会发生免疫排斥。不夸张的说，如果这项技术研究成熟了，以后大家换条胳膊换条腿就跟给汽车换个轮胎一样。你听明白了吗？这不是天方夜谭，巨大的前景就在眼前，你还在等什么呢？赶紧加入到生命科学的研究中来吧！,22,借鉴内容,23,借鉴内容,5.体细胞核移植技术存在的问题,看书P49-50页,24,借鉴内容,动物细胞融合与 单克隆抗体,25,借鉴内容,动物细胞融合,回忆已学知识，你是否已经见到过动物细胞融合的实例？,人鼠细胞融合实验,26,借鉴内容,1、定义

12、：也称细胞杂交，是指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。,一、动物细胞融合,杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞成为杂交细胞。,27,借鉴内容,基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体 。 来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体。 同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合； 异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。,28,借鉴内容,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,29,借鉴内容,动物细胞融合,30,借鉴内容,2、诱导融合的因素 生物法：灭活的病毒诱导融合.(利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。

13、这是由于病毒的磷脂外壳与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。) 化学法：聚乙二醇(PEG)诱导融合. 物理法：电激融合,病毒颗粒黏 附细胞表面,细胞膜连接,细胞膜被 病毒颗粒穿通,细胞融合、形成杂种细胞,31,借鉴内容,思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂 质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭 活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。,32,借鉴内容,3、动物细胞融合技术的应用,细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。 利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。,33,借

14、鉴内容,制备单克隆抗体,培育新品种,杂交细胞,杂交植株,突破了远缘杂交不亲和的障碍，打破了生殖隔离,电激、振动、离心、聚乙二醇,纤维素酶、果胶酶,胰蛋白酶(或胶原蛋白酶）,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性、细胞的全能性,电激、灭活的病毒、聚乙二醇,融合的原理相同，诱导方法相似,植物细胞杂交与动物细胞融合的比较,34,借鉴内容,人们获得抗体的传统方法是? 将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体 这种方法的缺点是什么? 效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。 能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？ B淋巴细胞在体外不能无限增殖。,二：动物细胞

15、融合的成功应用 单克隆抗体的制备,思考,35,借鉴内容,抗原,吞噬细胞摄取处理,T细胞,暴露、呈递,B细胞,直接刺激,浆细胞,增殖、分化,抗体,产生,从动物血清中分离,淋巴因子,获取抗体的传统方法,该方法的缺点是？,36,借鉴内容,传统获得抗体方法的缺点：,产量低，纯度低，特异性差,如何获得大量的、特异性强的抗体？,利用动物细胞培养技术,克隆单一的经免疫的B细胞,这就是“单克隆抗体”,37,借鉴内容,单克隆抗体的制备极富创造性的方案 将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类

16、型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。 米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。,38,借鉴内容,1.如何取得B淋巴细胞？ 2.把B淋巴细胞与骨髓瘤细胞放在一起，有几种融合方式？ 3.如何筛选出所需的细胞? 4.细胞培养有几种方式? 5.如何提取单克隆抗体？,制备过程提示:,39,借鉴内容,制备单克隆抗体,2.单克隆抗体制备的原理,每一个 只分泌一种特异性抗体。 具有无限增殖的特性。 技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能 ，又能产生足够数量的 。 利用 技术大量培养杂交瘤细胞。,B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,动物细胞融合,动物细胞培养,大量增殖,特定

17、抗体,40,借鉴内容,单克隆抗体制备过程,注射特定抗原,骨髓瘤细胞,免疫的B淋巴细胞（浆细胞）,细胞培养,诱导融合,杂交瘤细胞,专一抗体检验,专一抗体检验阳性细胞,克隆细胞,单克隆抗体,第一次筛选,第二次筛选,41,借鉴内容,筛选1,融合,体外培养,体内培养,注射入小鼠体内培养抗原,培养瓶中,筛选2,小鼠,动物细胞培养,骨髓瘤细胞,单克隆抗体,抗原,免疫处理,动物细胞融合,筛选,动物细胞培养,提取,42,借鉴内容,例：已知细胞增殖时合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。 人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。 鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，

18、 将两种细胞在培养液中混合，加聚乙二醇促融，在培养液中有 种细胞。,加入氨基喋呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的 及其彼此融合的细胞不能增殖。 人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交细胞中可利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。从培养液中分离出杂交细胞。,如何筛选出培养液中的杂交瘤细胞？,5,骨髓瘤细胞,43,借鉴内容,多孔细胞培养板,有限稀释法,将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。,如何筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞？,44,借鉴内容,动物特异性免疫 分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B

19、淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,-Bn） 细胞融合三种融合方式:（BB;BG;GG） 第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G-BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。） 第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 ，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。 选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。 提取单克隆抗体。,1、单抗的制备过程要点：,45,借鉴内容,3）、为何要进行两次筛选？,4）、如

20、何进行第2次筛选？,培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。,第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。,问题强化：,1）、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,46,借鉴内容,单克隆抗体的特点,种类单一，特异性强,纯度高，产量高,47,借鉴内容,1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、

21、快速特点. 2、用于治疗疾病和运载药物： 主要用于癌症治疗。优点：疗效高，毒副作用小。 生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向作用。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）,2、单克隆抗体的优点： 特异性强，灵敏度高，可大量制备。,3、单克隆抗体的应用,48,借鉴内容,动物细胞融合与单克隆抗体总结,一种诱导细胞融合的新方法,一种新细胞,一个优势,49,借鉴内容,具有一定的流动性,C,有丝,不变,抗体能与抗原发生特异性结合的特点,50,借鉴内容,例题2 （1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时， 将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选) （ ） AT淋巴细胞 B效应B淋巴细胞 C抗体 D记忆细胞 （2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中， 正确的是 (多选) （ ） AB淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台 病毒或聚乙二醇诱导 B融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克 隆抗体 C体外培养时，一个B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不 能