灭蚊真菌贵阳腐霉原生质体诱变育种实验研究

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减灭蚊真菌贵阳腐霉原生质体诱变育种实验研究（作者：单位：邮编：）【摘要】目的：建立采用紫外线和氯化锂诱导灭蚊真菌发生突变的方法，为培育理想菌株开辟新的途径。方法：对出发菌株贵阳腐霉的原生质体进行诱变处理，通过正突变率与紫外、化学 诱变剂量的相互关系，确定最佳诱变条件，经过酪蛋白平板透明圈和 菌粉得率粗筛突变株，连续8代传代培养及摇瓶实验检测突变株的遗 传稳定性。结果：当用0.6%氯化锂处理90 min时，突变株的致死率 和正突变率分别为86.9%和26.9% ;用20 W紫外灯30 cm照射180 s，突变株致死率为81.3%、正突变率为78.5% ;筛选了

2、7株突变 株，其中U22经传代实验证明其遗传性状稳定。结论：本研究所建立 的对贵阳腐霉原生质体诱变系统基本成功，为该菌的细胞工程育种创 造了条件。【关键词】贵阳腐霉；原生质体；紫外线；氯化锂；诱变；育种Abstract Objective： To establish a mutation inductionsystem for mutati on breed ing of Pythium guiya ngense Su, a fungal pathogen of mosquitoes. Methods: Protoplasts of original strain were treated w

3、ith UV or LiCl for mutatio n in ducti on. Case in plate tran spare nt loop method and mycelial weight determ ine were used to scree n muta nt col on ies. Pert inent in ducti on con diti on comb in ati on were summarized based on the an alysis of the relationship between the positive mutation rates a

4、nd treatment dosages and periods of UV or LiCl. One of the mutational colonies was continu ously cultivated for 8 gen erati ons on KPYG2 plates for the observation of genetic stability. Results: A lethal rate of 86.9% and a positive mutation rate of 26.9% were achieved when the protoplasts were trea

5、ted by 0.6% of LiCl for 90mins, and a lethal rate of 81.3% and a positive mutati on rate of 78.5% were obta ined when the protoplasts were irradiated by a UV lamp of 20W in a dista nee of 30cm for 180s. Seve n muta nts were obta in ed, and one of them, U22, was proved genetically stable. Conclusions

6、: The mutation induction system of P. guiyangense by UV and LiCl is successful, and can provide basis for the mutati on breedi ng of P.guiya ngense in the future.Key words Pythium guiyangense Su; protoplasts; ultraviolet rays; lithium chloride; mutation breeding丝状真菌贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su )具有灭蚊能

7、力强，繁殖速度快，易于人工培养以及对其它非靶生物相对安全等 优点1，在蚊虫生物防治中具有潜在的应用前景。但是，与大多数微生物一样，贵阳腐霉在人工培养基经过多次传代后其毒力和产孢量 会有所下降；同时，与大多数丝状真菌一样，其有效贮藏期不够长。为将贵阳腐霉真正用于灭蚊，提高其灭蚊能力和延长有效贮藏期，对 贵阳腐霉进行了改良。微生物改良育种方法较多，原生质体诱变技术 是一种行之有效的方法2，3。杜海英4等通过原生质体诱变选育乳 糖酶高产菌株。目前有关利用原生质体紫外诱变和氯化锂诱变提高丝 状真菌遗传稳定性方法报道较少。贵阳腐霉是发现的新种，其诱变研究尚未见报道。2008年1月8月对贵阳腐霉原生质体进

8、行紫外诱 变和（或）氯化锂诱变，为该真菌的细胞工程改良奠定基础。1材料与方法1.1实验材料1.1.1菌种来源于贵阳医学院蚊虫生物防治实验室。菌丝在固 体培养基上每7天转种1次，培养温度为（25 1 ）C。1.1.2培养基菌丝培养液（KPYG2 ）:葡萄糖1.5 g/L，酵母1.0 g/L，蛋白胨 1.0 g/L，氯化钙0.075 g/L，胆固醇0.02 g/L，玉米油10 g/L。菌丝 固体培养基：KPYG2加入琼脂粉10 g/L。酪蛋白水解培养基： NaHPO4 7H2O 1.07g/L，KH2PO4 0.36 g/L，酪蛋白 4 g/L，琼脂粉 20 g/L。再生培养基：用0.6 mol/

9、L进口蔗糖渗透压稳定剂溶解 KPYG2 各成分。氯化锂的诱变培养基为 LiCI（0.2%1%）加再生培养基。1.1.3酶液配制配制浓度为0.6 mol/L的进口蔗糖作为渗透压。取1 g酶用渗透 压稳定剂溶解成质量分数为1%的酶液，经0.22呵 微孔滤膜过滤除 菌后使用。1.2诱变方法1.2.1贵阳腐霉原生质体的制备与再生参考文献5制备足够量（6.48 X106个/ml）的原生质体，经系 列稀释后取0.1 ml于再生培养基平板，同时将原生质体悬液用无菌 水稀释，普通培养基平板作为对照。（25）C培养5 d后计算其再 生率。1.2.2原生质体诱变处理1.2.2.1紫外线（UV）诱变取5 ml （1

10、.0 X106个/ml）贵阳腐霉原生质体均匀涂于再生培养基 中,在磁力搅拌作用下距20 W紫外灯30 cm处分别照射30 s、60 s、 90 s、120 s、150 s、180 s、210 s，对每个处理进行系列稀释；再 各取0.1 ml涂布于再生培养基平板，用黑纸包好后置于温室避光培 养5 d。以上操作均在红光下进行。根据形成的菌落数计算原生质体 致死率和正变率。致死率二（1-再生的菌落数/原生质体总数X再生率） X100%，正突变率二（透明圈比出发菌株大的菌落总数/所有被测菌落 总数）X100%。以诱变时间为横坐标，致死率为纵坐标绘制紫外线对 原生质体的致死曲线。1.2.2.2 LiCl

11、诱变处理将获得的贵阳腐霉原生质体浓度控制在约106107个/ml ,加入LiCI溶液，形成LiCI终浓度分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、 1.0%的1 ml反应体系，置（25 ）C温箱中避光反应45 d，然后 置于（25 ）C恒温摇床分别振荡30、60、90、120、150 min，迅 速低温离心（6 000 r/mi n,4 C ,5 min ），取上清液，加硫代硫酸钠中 止反应，用生理盐水洗涤2次、离心、收集上清液6，用渗透压稳定 剂稀释后涂布平板。对照组的菌液以同样方法进行。计算致死率、正 突变率，选择最佳LiCl浓度及诱变时间。1.3突变株筛选方法1.3.1菌丝得率切取1

12、 cm3含诱变菌株的琼脂块至菌丝培养液（KPYG2）中， 摇床培养5 d，过滤得湿菌丝体，滤干，以100 ml培养基中得菌丝湿 重计算得率。1.3.2突变体粗筛将诱变所得的菌株分别接种于含酪蛋白的培养基上，观察酪蛋 白水解圈（HC）。每个平板接种一块出发株作为对照，（25 I）C培 养，测量HC值7 （HC二水解圈直径/菌落直径）。见图1。1.4遗传稳定性观察将获得的26株突变株每株接种两个斜面和 2个三角瓶传代培 养，并对其中生长力特别旺盛的7株进行跟踪观察，筛选出的菌丝得 率最高的U22连续8次继代培养，观察其每代菌丝得率的变化。2结果2.1紫外线照射的诱变效果原生质体致死率与紫外线照射时

13、间 有关。照射时间越长，存活的原生质体越少，即致死率越高（图2 ）。原生质体经UV处理诱变后形成的再生菌落在菌落直径和形态方面与 对照组都有较大差异。以菌落直径大、生长速度快作为标准，共筛选 26个诱变株保存。紫外线照射后贵阳腐霉原生质体致死率和正突变 率见图3。A.无紫外照射；B.紫外照射60 s ； C.紫外照射180 s ； D. 紫外照射210 s。2.2 LiCI诱变与致死率和正突变率的关系分别固定处理时间（90min）测最佳LiCI浓度（图4）,固定LiCI 浓度（0.6%）测试最佳作用时间（图5）。2.3贵阳腐霉诱变株的遗传稳定性7株菌的菌丝得率都很稳定，U2为0.53%，U6为

14、0.68%，U7 为 0.23%，U14 为 0.98%，U15 为 0.32%，U21 为 1.06%，U22 为 1.25%，原菌株0.8%，特别是U22菌丝得率最高的。 U22连续8 次继代培养，各代的菌丝得率基本上都超过原始菌株 （表1）。表1突 变株U22连续8代继代培养菌丝得率比较（略）3讨论丝状真菌菌丝有细胞壁，不宜作诱变材料。去除细胞壁的原生 质体对外界环境比较敏感，经诱变剂处理后容易发生突变。原生质体 诱变技术一般能保持原有菌种的主要生物学性状特点，育种周期短， 突变株生物学性状比较稳定，不易退化。因此，原生质体诱变育种方法已成为当前丝状真菌育种的一种重要方法8。在物理和化学

15、诱变研 究中，致死率和正突变率的范围选择是关键。一般认为，致死率以 9099.9%效果较好，致死率高说明诱变的作用比较强。但也有报道 认为，较低的致死率有利于正突变菌株的产生，以70%80%或更低的致死率为好9。贵阳腐霉原生质体，菌丝体在（25 1） C培养5254 h后，用1%纤维素酶与1%溶壁酶、加上1%蜗牛酶消化5 h可获足 够量（6.48 X106个/ml）的原生质体，但是再生率比较低（0.043% ） 5。本研究中，经过改良再生培养基后再生率提高为0.54%，此再生率基本上能满足原生质体诱变育种的需要，为开发以贵阳腐霉原生质体为媒介的生物技术提供了一个良好的再生系统。本试验中发现，紫

16、外照射时间越长，致死率越高；当照射时间 大于210 s时，致死率高于91.5% （图3），表明贵阳腐霉原生质体 对紫外线的敏感性较低。经反复试验的结果，贵阳腐霉原生质体在 20 W紫外灯30 cm处照射180s诱变效果最好，该条件下致死率为 81.3%时，正突变率为78.5%。HC值是反映菌株产酶能力的指标。一般来说，高 HC值的突 变株优于低HC值的突变株。虽然LiCl导致的总体正突变率（图4 和图5）低于与紫外线诱导引起的总体正突变率（图 3），但LiCl正 突变株HC值总体较紫外诱变株HC高，仍然说明LiCl具有较好的诱 变效果。在0.6%LiCI作用90 min条件下进行两次试验，致死率分 别为86.9