生工细胞工程复习思考题仅供参考2015

1、细胞工程复习参考第一章绪论1. 植物组织培养的几个基本概念：全能性，组织培养，器官培养，外植体 细胞的全能性细胞具有发育成一个完整个体的潜在能力。植物组织培养（tissue culture）:用无菌方法，使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的培养技术的总称（属体外培养in vitro culture）外植体（explant）:由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官。植株培养：以具备完整植株形态的材料（如幼苗和较大的植株）为外植体的无菌培养。胚胎培养：以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。器官培养：以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体

2、无菌培养。组织培养：以分离出植物各部位的组织（如分生组织形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳 组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。植物细胞工程概念：是以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。2. 细胞工程的定义及分类。定义：以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞的某些生物学特性按人的意愿发生改变从而达到改良生物品种或创造新品种，加速繁育动植物个体，或获得某种有用的物质的过程。分类

3、：根据生物类型的不同分为动物细胞工程、植物细胞工程和微生物细胞工程。广义包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术狭义的细胞工程：则是指细胞融合和细胞培养技术3. 请简单谈谈植物细胞工程在在育种、食品工业等方面的应用。在植物育种上的应用： 将植物常规育种技术和植物组织培养技术相结合，可以获得常规技术难以获得或无法获得的种质材料，缩短育种周期，提高育种效率。其优势有快速获得特殊倍性材料，克服远缘杂交不亲和，克服杂种胚早期夭折，导入外源基因，种质资源保存， 种苗脱病毒与快速繁殖。在食品工业中的应用：有不受地理、气候、季节条件的影响，节约土地、减低成本、提 高经济效益，容易获得诱变突变体等优点

4、。但许多技术还停留在实验室阶段，生产规模待扩大。应用 利用植物细胞工程生产香料、调料、食品添加剂、天然食品等。4. 动物细胞在食品工业的应用在干扰素生产上的应用，在单克隆抗体生产中的应用第二章细胞培养的设备和操作技术1.基本概念基本实验室，辅助实验室， 超净工作台 无菌操作技术,2. 细胞培养的营养成分主要包括哪些？各有什么功能作用？细胞培养的营养成分包括无机盐、有机化合物和生长调节剂。无机盐：一是组成各种化合物，成为结构物质；二是构成一些特殊的生理活性物质，参与植物的代谢活动；三是这些元素之间互相协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平 衡等生物电化学方面的作用；四是在发育过程中影响组织器

5、官的建成。有机物质：（1）糖：维持培养基合适的渗透压，为细胞提供合成新物质的碳骨架，为细 胞呼吸代谢提供底物和能量。（2） 维生素：利于细胞代谢和器官分化。B1是植物组培必须加入的维生素（3）氨基酸：组成蛋白质及其他代谢功能。（4）肌醇：促进糖类的相互转化，维生素、激素的利用作用，是培养物快速生长。（5）腺嘌呤、硫酸盐的激素：促进芽、根的形成和生长。（6）附加物：为非细胞生长所必需，但对细胞生长有利。琼脂：使培养基在常温下凝 固，不参与代谢。活性炭：利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响。（7）其它有益有机添加物或未知复合成分：提供一些必要的微量营养成分、生理活性 物质和生长激素等。生长调节剂

6、：培养基中对培养物影响最大最显著的就是激素，激素的种类、浓度以及配比都会显著的影响愈伤组织的形成，不定根、不定芽的分化，胚状体的形成等。主要有生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸4类。（1）生长素：诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合 一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生。（2） 细胞分裂素：促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、 抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用。（3）赤霉素：能打破休眠，促进果实成长，能刺激不定胚发育成正常小植株，但在培养 基中很少添加，因为它的作用往往是负面的。（4）脱落酸：阻碍发育、促进老化、形

7、成休眠芽、抑制生长使继代培养时间延长。3. 细胞工程在实验室设计上有何要求？满足实验准备（培养基配制，洗涤与灭菌）、无菌操作和控制培养三个基本要求。4. 植物组培中消毒、灭菌有何作用和意义，具体方法包括哪些？植物组培中，凡用于培养和无菌操作的房间、器具、培养瓶、培养基，培养材料和操作 者的衣物都应随时进行灭菌，以确保不受杂菌污染， 否则，由于杂菌的生长繁殖速度一般都比培养的组织快得多，最终将把组织全部杀死，这些污染微生物还可能排泄对植物组织有毒 的代谢废物，因此在培养容器内部保持一个完全无菌的环境是绝对必须的。消毒灭菌的具体方法包括物理方法和化学方法。物理方法包括高温高压灭菌、烘烤或灼烧灭菌、

8、射线处理、超声波等灭菌方法，过滤、离心沉淀等除菌方法。化学方法即使用灭菌 齐山如熏蒸灭菌、消毒液灭菌（70%酒精、升汞、苯酚、漂白精、新洁尔灭、次氯酸钠、过 氧化氢）。5. 紫外灯如何杀菌？操作中要注意什么？波长200-290mm的紫外线，可透过细菌或病毒的细胞膜对控制着遗传现象和生物机能 核酸（DNA ）造成机能损伤，使它失去繁殖能力，从而达到杀菌的目的。每次实验前要用紫外灯灭菌 20分钟以上，然后喷酒精灭菌，工作过程中注意一直开着 吹风机，并且一定要关掉紫外灯，过滤网应经常清洗。6. 培养基的分类与配置第三章愈伤组织培养1. 定义：分化，脱分化，胚状体，人工种子，愈伤组织，细胞的全能性，植

9、物组织培养 体细胞胚，性细胞胚，继代培养分化：细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变， 从而在个发育中形成各 类组织和器官的生活周期。脱分化：已分化好的细胞在人工诱导条件下恢复分生能力， 恢复到分化状态 的过程。胚状体：对应于胚（embryo）,在离体培养过程中产生一种形似胚 （具有明显 的根端和芽端），功能与胚相同的结构。人工种子：指将植物离体培养产生的体细胞胚包埋在含有营养成分和保护功能的物质 中，在适宜条件下能发芽出苗的颗粒体。愈伤组织：在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。（植物受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中，指在人工培养 基上由外

10、植体长出的一团无序生长的薄壁细胞 ）细胞的全能性：每个细胞都具有发育成完整个体的潜在能力，因为每个细胞 都具有全套的遗传基因，不论是性细胞还是体细胞在特定条件下可以进行表达。植物组织培养的概念：指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株 或生产具有经济价值的其他产品的技术。体细胞胚：是由体细胞组织（一般指愈伤组织）经培养再分化形成； 性细胞胚：是由性细胞（包括卵细胞和精细胞）再分化形成。继代培养：定期（24周）将愈伤组织分成小块，接种到新鲜的原培养基 上继续培养以维持愈伤组织生长的方法。2. 植物组织培养的主要意义有哪些？

11、植物组织培养的主要意义：加速无性繁殖；获取脱毒苗；扩大变异范围；加速亲本材 料的纯化；种质资源的试管保存；为基因工程的全面实施人工控制遗传方向打下基础。应用：1无性系快速繁殖 ；2花药培养和花粉单倍体育种加快育种过程；3药用植物的工厂化生产（如人参）；4种质的保存和基因库的建立；5突变体的筛选培育。3. 如何降低或防止外植体在体外培养过程中的褐变现象？1）培养基中加入抗氧化剂；2）用抗氧化剂浸泡外植体后再接种；3）减少光照强度或在黑暗条件下培养；4）多次更换培养基达到稀释效应；5）加入多胺类物质，如精胺、亚精胺，通过刺激细胞分裂，加速组织生长，减少褐化。4. 请简单分析植物组织培养的影响因素。

12、影响植物组织培养的因素有 植物因素、培养基因素和环境因 素。植物因素如基因型、植物年龄、组织和器官的年龄、植物的生理状态、取材年份及生长条件、取材部位及大小。培养基因素如无机盐、有机化合物、植物激素、天然提取物、琼脂、pH值、活性炭、渗透压。环境因素如光照，包括光强、光质、光周期，温度，湿度，气体。5. 愈伤组织的形成大致经过哪些阶段？各有何特征？愈伤组织的形成大致经过起始期（诱导期）、分裂期、形成期（分化期）三个阶段，三个时期无严格界限。诱导期的特征：细胞脱分化，液泡蛋白体出现，质体转变为前质体；细胞大小变化不大; 细胞质显著变浓；大液泡消失；RNA含量迅速增加，细胞核显著增大并移至细胞中央

13、；细胞器增加。分裂期的特征：细胞数目迅速增加；细胞鲜重下降；细胞体积减小，无液泡；核和核仁 增大到最大；RNA含量减少，DNA含量保持不变；细胞总干重、蛋白质和核酸含量大大增 加，新细胞壁的合成极快；愈伤组织结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态。形成期的特征：细胞平均大小相对稳定； 形成分生组织结节； 细胞分裂已基本停止，开 始形成一些不同形态和功能的细胞。6. （重点选择题）诱导脱分化过程中细胞形态、结构变化：1）细胞大小没有多大变化；2）细胞质显著变浓；3）大液泡消失；4）RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大并逐渐移位至细胞中央；5）细胞器增加。7. 愈伤组织的形态发生方式主要

14、有哪两种方式？两者有何区别？ 愈伤组织的形态发生方式有不定芽方式和胚状体方式两种。 重点）胚状体和不定芽的区别答；胚状体指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构（胚状体），进而长成完整植株 。不定芽指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株。区别：1）胚状体来自单个细胞，具有明显的两极性：分化根端和苗端，而不定芽或 不定根都为单向极性。2） 胚状体形成的小植株与周围组织无结构联系；而不定芽或不定根往往总是与母体 愈伤组织的维管组织相联系。3） 胚状体的维管组织的分布是呈独立的“Y ”字形，而不定芽的维管组织无此现象。8. 愈伤组织形态发生主要受哪些因素调控？愈伤组织的形态发生主

15、要受 外植体本身、培养基和培养环境三大类因素的调控。（1）外植体本身：遗传型：不同植物种、同种植物的不同亚种或品种差异很大。取材的器官和部位：通常同一种植物的不同器官和组织所形成的愈伤组织无论在形态上或生 理上差别均不大，但因植物不同而异。年龄：年龄较幼的外植体不仅易于诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株；愈伤组织的年龄和继代次数也有显著影响。（2）培养基：激素：腺嘌呤/IAA的比例控制芽和根形成；生长素和细胞分裂素之间的相互作用调节芽和 根的形成，生长素/细胞分裂素的比例大则生根，比例小则生苗，比例适中则产生无结构的 愈伤组织；合适范围内激动素促进芽的形成；不同生长素和细胞分裂素对生根

16、和长芽的效果是不同的。无机营养元素：培养基一般都含有C、H、0、N、P、K、S、Ca、Mg、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、CI16种必需元素，但各种类型的植物、器官所需要的各种元素特别是大量元素的 量是有区别的，对离子的形式也有不同的要求。有机成分：在培养基中加入足够的糖、硫胺酸、烟酸、吡哆醇、肌醇和甘氨酸，可以满足愈 伤组织的生长和分化的要求；糖的种类和浓度；加一些植物器官的汁液，有助分化。物理性质：pH对芽的分化有一定影响，通常把 pH调整到5.66.0;渗透压等物理性质的影 响。（3）培养环境：光照：光对器官的作用是一种诱导反应，各种植物的器官发生对光（光质、强度、长度）的 要求是不

17、同的，光照长度对具有光周期反应的植物的器官分化有明显影响。温度：一般采用2428C恒温对外植体培养，可较好地形成根和芽；培养室的温度最好能保 持一定的日夜温差，对器官的发生和生长有利。9. 愈伤组织的分类10. 植物脱毒的方法和基本原理。植物脱毒方法有热处理脱毒、茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒、茎尖微体嫁接、化学疗法脱毒。热处理脱毒原理：当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，是病毒在植物体内减缓增殖或停止增殖，而失去病毒的侵染能力； 但寄主使植物细胞在与病毒繁殖病毒的数量随植株部位及0.11mm区域）则不植物的组织很少或不会受到伤害，反而可以加速植物细胞的

18、分裂,的竞争中取胜。茎尖培养脱毒原理：感染病毒植株的体内病毒分布并不均匀， 年龄而异，越靠近茎顶端区域的部位病毒感染深度越低，生长点（约 含病毒或含病毒很少。由这些细胞愈伤组织培养脱毒原理： 愈伤组织带病毒不均一， 部分细胞是不带病毒的, 再生的植株是无毒的。多次继代的愈伤组织中病毒繁殖速度下降，甚至检测不出病毒。将实生苗砧木在人工培养茎尖微体嫁接脱毒原理： 木本植物茎尖培养难以生根成植株,基上种植培养，再从成年无病树枝上窃取0.41mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。化学疗法脱毒原理：许多化学物品（如嘌呤、嘧啶类似物，氨基酸，抗菌素等）对离体 组织或原生质体具有脱毒效果。1

19、1. 植物脱毒和快速繁殖技术在生产中有何意义？1）能够有效地保持优良品种的特性；2）生产无病毒种苗，防止品种退化；3）快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用；4）节约耕地，提高农产品的商品率；5）便于运输。12. 请简单阐述植物脱毒效果的检测方法主要有哪些？脱毒效果检测方法有外观判断法、指示植物鉴定法、抗血清鉴定法和电子显微镜检查 法。（指示植物是指具有辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物）影响脱毒效果的因素：1 ）母体材料病毒侵染的程度；2）起始培养的茎尖大小13. 结合已做的愈伤组织诱导实验，请详细分析造成实验中出现污染的各种可能因素，并 提出解决措施。1. 防止外植体带菌，外植体接种前要洗涤和

20、消毒；2. 防止器具或培养基等试剂带菌，各种器具及培养基要经过高温灭菌；3. 防止操作环境污染，接种操作前要对无菌室进行消毒，对超净工作台要先用新洁尔灭或酒精擦拭，然后紫外灯照射至少20分钟；4. 防止操作时染菌，未污染的材料要放在超净工作台的上风区， 操作动作幅度不能太大, 手要用酒精消毒，其他与外植体接触的器具要浸泡酒精或灼烧消毒，不能让带菌物体碰触培 养容器内壁。5. 防止空气引起染菌，培养容器要密封完好。6. 出现染菌要分析染菌原因，对症下药进行处理。(P34)12、举例说明植物组织培养的快速繁殖技术的步骤与方法。如芦荟组织培养快速繁殖。(1) 愈伤组织培养：清水冲洗芦荟幼苗，取茎尖部

21、分，用75%乙醇浸泡3060s，再用升汞浸510min，最后用无菌水冲洗数次。取包括茎尖生长点的组织切块接种到愈伤组织培养基上。培养条件为：每天光照1012h，光照度为10002000lx，温度25 2C。培养约1525 天后，形成愈伤组织，标志外植体已脱离分化状态。愈伤组织形成1周后可将愈伤组织转培 养基进行继代培养或分化培养。(2) 继代培养：取出愈伤块，剔除附着愈伤块的培养基并用无菌水冲洗数次。将愈伤块切成数小块，再接种到愈伤组织诱导培养基上，在于诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养。(3) 分化培养：将愈伤块接种到分生培养基上，培养环境同愈伤组织培养。约3050 天后出芽。当分化出的幼

22、苗长到一定高度或分化出一定数量后，取出幼苗进行生根培养。(4) 生根培养：将幼苗接种到生根培养基中培养，培养条件同分化培养。约半个月后 幼苗生根。(5) 炼苗：当幼苗的根长到一定长度，幼苗体已显强壮时，取出幼苗并洗除附着在根上的培养基。排好幼苗，用清水润湿，在1525 C、湿度60%80炼苗1224h。(6) 移栽：将幼苗栽入由蛭石组成的驯化苗圃中驯化，每天定期喷施培养液和清水， 约1520天后即可移栽到苗圃中。第四章植物的细胞培养1. 植物单细胞的分离方法主要有哪些？有物理方法、化学方法和酶法。物理方法即将疏松的愈伤组织放入液体培养集中，经摇床不断振动，使细胞分散。若向细胞悬浮液中吹入脉冲压

23、缩气体，细胞分散得更好。化学方法即在细胞悬浮培养中加入草酸盐，或秋水仙素，或2, 4-D，或水解乳蛋白。酶法即利用果胶酶和纤维素酶使细胞分散。2. 植物单细胞的培养方法有哪些？各有何优缺点？植物单细胞的培养方法有平 板培养、看护培养、液体浅层培养、微室培养和细胞悬浮培养。平板培养便于定点观察，但通气性差。看护培养简便成功率高，适于难以培养的植物种类，但不能在显微镜下直接观察。液体浅层培养通气性好，代谢产物容易扩散减少有害物质的危害，继代培养方便，便 于观察，但由于细胞可以游动，不能进行定点观察。微室培养可以连续观察细胞的发育和分化，但通气性差，水分难保持，pH易变动。悬浮培养可改善营养供应、减

24、少代谢产生的有害物质的危害、改善气体交换，适于大规模培养，但细胞长期培养对无菌要求高，细胞易变异，细胞易聚集且对机械剪切力敏感。3. 悬浮细胞培养的定义，悬浮细胞培养的优点有哪些？并分析影响悬浮细胞生长的可能因 素。悬浮细胞培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 其优点是能改善营养供应、减少代谢产生的有害物质的危害、改善气体交换。影响悬浮细胞生长的可能因素有起始愈伤组织的质量，接种细胞密度，培养条件、方式、温度，继代周期。悬浮培养过程悬浮培养同步化方法：物理：体积选择法：将培养细胞经过一定大小的筛网过滤，对细胞按大小分别进行收集。冷处理法：先收集细胞，后在低温（一般

25、为4度）下处理一定时间后加培养液培养。化学：饥饿法：控制营养使细胞处于饥饿状态，后加营养培养；有丝分裂抑制法：向培养液中加入化学抑制剂抑制细胞分裂，包括尿苷、秋水仙素悬浮细胞培养方法1. 分批培养法；是一种封闭的培养体系，培养过程中不放出培养液，也不补加培养液。2 半连续培养法：在培养过程中，每隔一定时间更换一部分培养液或添加某种营养。3连续培养法：通过控制连续添加和排出的新老营养液的量，维持培养液体积恒定， 据操作的不同又可分为封闭式和开放式两种。封闭式：回收流出的细胞于培养系统中，细胞数目增加开放式：流出的细胞不回收于培养系统中，但进行细胞收获影响悬浮细胞生长的因素答：1）起始愈伤组织的质

26、量；2 ）接种细胞密度；3）培养条件：方式、温度；4）继代周期。4. 一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足哪三个条件？（1）悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；（2）均一性好，细胞团大小、细胞形状大致相同；（3）细胞生长迅速（23天加倍）。5. 植物细胞培养的应用植物细胞含有人类所需的成分，包括初生代谢物（蛋白质、碳水化合物、脂肪等）和次 生代谢物（多酚类、香精油、生物碱、树脂等），传统提取分离这些物质由于资源短缺和需求量的加大，难以满足需求，通过细胞培养生产植物产品成为解决的有效途径。6. 细胞生物反应器的培养过程主要包括哪些步骤？细胞生物反应器的培养过程主要包括细胞的驯化、筛选和细胞株的建立，

27、扩大培养， 生物反应器培养三个步骤。7. 适合大规模培养的细胞株应具备何条件？生长速度快；目的代谢产物含量高； 适合悬浮细胞培养。8. 细胞生物反应器培养系统主要有哪些？各有何特点？细胞生物反应器培养系统包括悬浮培养系统和固定化培养系统。悬浮培养系统利于改善营养供应、减少代谢产生的有害物质的危害、改善气体交换。固定化培养系统：细胞固定而培养液循环流动，细胞接触紧密、生长缓慢，细胞拟组 织化，有利于次生产物的积累； 包埋式固定可减少剪切力的损伤作用；易于把细胞和培养液分开，更有利于连续培养及生物转化过程的实现；高密度的细胞群体，可建立细胞间的物理、化学联系，细胞位置的相对固定，有利于物化梯度的建

28、立，更有利于产物的形成；环境条件易于控制，次生代谢物易于释放；存在产物释放和氧、养分传递的问题。常见的几种固定化培养系统：流化床生物反应器，填充床生物反应器，膜生物反应器9. 细胞培养技术的优点1） 培养细胞是在无菌条件下生长的，不受地区、季节和气候限制；2）占地面积少；3） 天然产物的生产在控制的条件下进行，可以得到超越整体植物产量的代谢产物；4）能够产生原植物所没有的，甚至是至今在自然界还没有的化合物。10. 固定化细胞培养的优点（1）固相细胞接触紧密，生长缓慢，细胞拟组织化，有利于次生产物的积累；（2）细胞包埋在聚合物中得到保护，可以减少剪切力的损伤作用；（3）易于把细胞与培养液分开，更

29、有利连续培养及生物转化过程的实现；（4）高密度的细胞群体，可建立细胞间的物化联系，细胞位置的相对固定，有利于物化梯度的建立，更有利于产物的合成；（5）环境条件易于控制，次生代谢物易于释放11. 提高细胞天然产物代谢的新技术主要有哪四方面？（1）两步培养技术；（2）固定化培养技术；（3）两相培养技术；在培养体系中加入脂溶性有机物，或是具有吸附作用的多聚化合物（如大孔树脂等），使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长和合成次生物质，次生物质分泌出来转到有机相中。（4） 加入诱导物、前体物：可引起代谢途径改变或代谢强度改变的物质。无机离子、真菌提取液、葡聚糖等。前体物作用：消除关键酶的阻碍、阻断内

30、源性中间体的分隔和有效贮存， 大大提高次生代谢物的产量。12. 概念：看护培养看护培养是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂增殖的一种 培养方法。第五章植物的原生质体培养原生质体的概念原生质体培养的优越性原生质体的分离原生质体的培养1、什么叫原生质体？有何特点？原生质体指除去细胞壁的细胞，或是说一个被质膜包被的裸露球形细胞。原生质体的特点：（1）吸收能力增强：（2）分泌能力增强；（3）具有全能性；（4）在一定条件下可诱导原生质体融合，形成杂合细胞；（5）稳定性较差。2、原生质体的分离方法有哪些？如何鉴定获得的原生质体？并简单说明原生质体活力的 检测技术包含哪些？原生质体的分离

31、方法有机械法和酶解法。鉴定原生质体的方法有低渗胀破法，荧光染色法，两种方法都是针对有无细胞壁。原生质体活力的检测技术包括染色法（FDA法，伊凡蓝法）、胞质环流法、渗透压变化法、氧电极法。3、原生质体的发育主要经历哪些过程？原生质体的发育主要经过细胞壁再生、分裂和植株再生三个步骤。4、原生质体的制备：不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结构和性质有所不同，原生质 体的制备方法也不一样。材料的准备与消毒，酶解，纯化，原生质体的活力鉴定原生质体的收集和纯化方法：沉淀法，漂浮法，沉淀法和漂浮法结合，界面法。原生质体活力检测方法：1）染色法FDA法：FDA （二乙酸荧光素）能穿越细胞质膜，被活细胞内的酯酶

32、裂解，在荧 光显微镜下发荧光（荧光素）。伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，但质膜受到严重损坏使细胞被染色。2）胞质环流法：是否存在胞质环流判断原生质体活力；3）渗透压变化法：活原生质体会随着外界渗透压的变化体积变化4）氧电极法：活原生质体在光照下光合放氧，无光呼吸耗氧影响原生质体活力的因素:1 ）分离材料的生理状态;2）酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、时间、酶溶液的渗透压;3）分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间；4）环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响。 原生质体培养方法：固体培养；液体浅层培养；固液双层培养；琼脂糖珠培养影响原生质体培养的主要因素:基因型，原生质体的来源,

33、植物原生质体培养的应用：1）利用原生质体融合获得融合细胞2）利用原生质体进行外源基因的转化3）利用原生质体再生植株4）利用固定化原生质体培养生产次级代谢产物较多的分泌产物5）利用原生质体进行生物转化：通过原生质体中存在的酶或酶系的催化作用，将酶作 用的底物转化为所需的产物，提高转化效率第六章体细胞杂交细胞融合的概念、意义细胞融合的方法和基本程序融合杂种细胞的选择与鉴定植物细胞融合和体细胞杂交1、概念：原生质体融合，非对称融合，电融合法原理，细胞融合，同核体， 异核体，对称融合，非对称融合原生质体融合：也称细胞融合、细胞杂交，是指将不同来源的原生质体相融合，并使之 分化再生，产生新物种或新品种的

34、技术。非对称融合：利用物理化学方法使融合亲本之一的核或细胞质失活后再进行融合。电融合法原理：改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭合成完整的膜形成融合体。细胞融合（cell fusi on）概念： 细胞融合是20世纪60年代发展起来的一项细胞工程技 术也称体细胞杂交 、原生质体融合，是指将不同来源的原生质体相融合 并使之分化再生 形成新物种或新品种的技术。同核体一基因型相同的细胞融合成的杂交细胞；异核体一来自不同基因型的杂交细胞。自发融合：异种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并；诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合

35、。对称融合：即两个完整的细胞原生质体融合。非对称融合：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。植物细胞融合：离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞 的技术2、细胞融合的意义:1）有性杂交变无性杂交，加快育种速度2）打破远缘杂交的不亲和性3）创造新细胞质杂种4）单克隆抗体制备3、原生质体融合的方法和原理，并分析影响原生质体融合的可能因素。原生质体融合的方法有生物法、化学法和物理法。生物法一一仙台病毒法：病毒被膜具有凝聚细胞的能力，两个细胞在病毒的作用下相互靠近凝聚，诱导细胞融合。化学法：（1）盐类融合法：盐（如NaN03）能中和原生质体表面的电荷，促进原

36、生质体聚集，诱导细胞的融合。（2）高Ca2+和高pH值融合：引起原生质体表面电荷的紊乱和再 分布，诱导细胞融合。（3）聚乙二醇（PEG ）融合法：PEG具有轻微的负极性，能与具有正 极性基团的物质形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连，进而促进原生质体融合；PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。（4）PEG与高Ca2+、高pH值结合融合法：PEG使相邻原生质体质膜间形成分子桥，高Ca2+和高pH引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布，诱导细胞融合。物理法电融合法： 改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质

37、膜开始连接直到闭合成完整的膜形成融合体。影响原生质体融合的因素：首先是原生质体的质量，其次是融合方法，以及其他影响因素，比如 PEG融合法的PEG规格、纯度以及作用时间，电融合法中原 生质体密度、交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间、直流高频电压、脉冲 宽度、脉冲次数等。4、简单阐述植物细胞融合的基本程序。植物细胞融合的基本程序：植物原生质体分离，原生质体纯化，原生质体融合，细胞 杂种的选择，愈伤组织形成、器官分化、植株再生，杂种植物鉴定。体细胞杂交的步骤（以植物细胞为例）1）去除细胞壁以获得大量的原生质体；2）诱导细胞融合形成杂种细胞（细胞相互靠近；形成细胞桥 ：最关键的一步；胞

38、质渗透；细胞核融合）3）筛选，培养,促进细胞分裂，分化，4）从细胞团，愈伤组织到最后成株5、体细胞杂种的特点及鉴定方法？体细胞杂种的特点：形态上的趋中性，变异幅度大，非整倍性，双亲形状的共显性，偏亲现象。体细胞杂种的鉴定方法有1）形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。2） 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定（如核型）。3）生化鉴定：同功酶鉴定。4）分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。6. 细胞杂交的应用应用于：植物育种中的核质替换；获得细胞质杂种；远缘杂交创造新物种；细胞器的 互作研究。第七章动物细胞工程1. 基本概念原代培养是指将从机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程。继代培养

39、是指将原代培养的细胞继续转接培养。所谓细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次细胞株：这些存活的细胞一般能够传到4050代，这种传代细胞叫做细胞株。细胞株细胞的遗传物质没有发生改变细胞系：细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去。有限细胞系(finite cell line):指在连续传代培养后，细胞只能在有限的时间存活，最 后细胞逐渐死亡。无限细胞系(infinite cell line)：也称为永久细胞系， 理论上可以无限传代，但实际上，每次传代后细胞有一定变化(例如，发生染色体丢失)，多次传代后必须

40、对细胞再次进行筛选和纯化处理多克隆抗体：由多个不同类群的 B淋巴细胞产生的、针对不同的抗原表位的抗体。 单克隆抗体：由单个 B淋巴细胞及其克隆产生的、针对某种抗原表位的特异性抗体。2. 动物细胞工程是以动物细胞培养技术为主要手段，对动物细胞在离体条件下的细胞形态、结构、生理 功能进行研究，在此基础上，采用工程技术手段对细胞的遗传或生理特性进行改造，以 获得有价值的细胞产物、器官或个体的生物技术3. 动物细胞体外培养特性(1) 细胞生长缓慢；(2)适应环境能力差；(3) 培养过程中需氧量少；(4) 在培养中细胞互相粘连以集群形式存在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、 功能全能性及接触抑制性。(

41、5) 对环境因素非常敏感；(6) 原代培养细胞一般繁殖不超过50代即退化死亡。4. 动物细胞体外培养的生长方式主要有哪些？贴壁生长细胞的生长过程包含哪些阶段？其有何优点？体外培养的动物细胞生长方式主要有贴壁依赖型、非贴壁依赖型和兼性贴壁型。贴壁生长细胞的生长过程包括游离期、细胞接种后在培养液中呈悬浮状态吸附期、细胞附着于底物上，游离期结束潜伏期、细胞有生长活动，而无细胞分裂。对数生长繁殖期：细胞数随时间变化成倍增长，呈对数生长状态，活力最佳，最适合进行实验研究。后期呈现接触抑制，恶性细胞则无接触抑制现象。癌细胞发生密度抑制。停止期：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂退化期：代谢产物积累，P

42、H下降，细胞中毒受损，大量细胞出现死亡。细胞贴壁生长的优点有容易更换培养基、可采用灌注培养、方便产物表达、方便调节培养液和细胞的比例、易于观察等。5. 细胞为何会贴壁？答：血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 而进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团），故细胞会贴壁。胰蛋白酶消化液1）胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影 响细胞骨架，从而使细胞分离。2）胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。3）用含血清培养液终止其对细

43、胞的消化作用6. 动物细胞体外培养的要求，基本方法，各有何优缺点？细胞体外培养的要求环境要求：温度，pH值，气体，渗透压营养要求：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞体外培养的基本方法有悬滴培养法、盖玻片培养法、旋转管培养法、培养瓶培养法、培养板培养法和灌流小室培养法。悬滴培养法优点是便于观察、培养液用量少，缺点是操作繁杂、空间小、培养环境难控制。盖玻片培养法优点是便于观察和染色处理，缺点是表面积小，仅适合短时间培养。培养瓶培养法优点是极大地减小了污染机会、便于观察、换液方便、培养空间大，缺点是成本较高。旋转管培养法优点是培养液的均一性好，有利于细胞生长与物质交换，缺点是培养管

44、球面不利于观察。培养板培养法优点是可进行微量培养、使培养容积标准化、可进行组间比较，缺点是成本较高。灌流小室培养法的优点是保持培养液的不断更新，有利于细胞生长和物质交换，有利于获得高浓度的产物，缺点是操作繁琐，难度较高。7. 动物细胞体外培养所用天然培养基和合成培养基的营养特点及优缺点。天然培养基来自动物的体液或组织液。优点：营养成分丰富，培养效果好，符合细胞生长的要求。缺点：成分不稳定，来源复杂、有限，不能做到标准化，易发生支原体污染。合成培养基根据动物的体液成分和细胞生长的需要，由各种营养物质组合而成。优点： 能够标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点：不能完全满足细胞生长和繁殖的需

45、要，因此培养时一般在培养液中加上一定量的血清。8. 动物细胞体外培养技术有何应用？（1）在组织学与胚胎学研究上的应用：研究组织器官的发生、发育和分化过程及调控 机制；研究动物胚胎的发育过程；应用于胚胎的体外操作。（2）在细胞学研究上的应用：细胞形态学，如细胞核的旋转、细胞膜的运动；细胞生 理学，如细胞的营养需要、细胞的功能；细胞遗传学，如基因转染、细胞融合等。（3）在肿瘤学方面的应用：肿瘤细胞生物学特性研究；肿瘤发病机制研究；异种、异 体移植研究；肿瘤细胞凋亡与体外诱导分化研究。（4）在微生物领域的应用：在病毒学上的应用，如病毒的变异规律、病毒抗原的制作 及疫苗的生产等；在细菌学上的应用，如组织细胞与病菌的互作、致病机制研究等。（5）在免疫学方面的应用：杂交瘤细胞与单克隆抗体制备技术、抗体形成的机制研究 等。（6）在药理学领域的应用：药物的毒理研究、药物的细胞代谢动力学研究等。（7）在生物制药和现代医学上的应用：生物制药，如抗体、疫苗、激素、干扰素、生 长因子等生物工程产品的制备；现代医学，如体外受精、试管婴儿、组织工程技术等。9. 简单阐述动物细胞体外培养传代方法。传代操作过程：吸出旧培养液；加入酶解液，消化至细胞间隙变大、胞质收缩为止；吸 出消化液，用洗液洗；加入培养液，吸管轻轻吹打，制成细胞悬液；重新接种培养。10. 动物的组织或