靶向MRP1基因pRNATH1.1以及shuttleRFP重组质粒表达载体构建毕业设计论文1

1、齐 齐 哈 尔 大 学毕业设计（论文）题 目 靶向mrp1基因prnat-h1.1/shuttle-rfp重组质粒表达载体构建摘 要癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resistance, mdr）是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，mrp1）的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。rna干扰(rna interference

2、，rnai)是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过rnai技术沉默mdr1基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。目的：本课题选用prnat-h1.1/shuttle-rfp表达穿梭载体。构建针对mrp1 mrna的rna干扰表达载体。方法：将预先根据mrp1基因序列设计合成的编码sirna的cdna序列与prnat-h1.1/shuttle-rfp质粒载体连接，构建靶向mrp1 sirna重组质粒。将重组质粒转化e.coli dh5后大量提取重组质粒，经菌落 pcr和 dna测序分析检测重组载体构建结果。结果：成功构建靶向mrp1基因pr

3、nat-h1.1/shuttle-rfp重组质粒表达载体。为下一步抑制mrp1基因在肿瘤细胞中的表达奠定基础。 关键词：rna干扰；mrp1；prnat-h1.1/shuttle-rfp质粒；穿梭载体 abstractcancer, a serious threat to human health, the incidence are on the rising trend. chemotherapy as the routine clinical therapy of tumor, which is an irreplaceable way in cancer treatment. mdr

4、of tumor cell cause the failure of chemotherapy treatment . the reason causing the cancer mdr is relatively complicated, and the excessively expression of multidrug resistance-associated protein 1(mrp1) is one of the reasons causing mdr. silencing mdr1 gene by rnai, we can improve the effect of chem

5、otherapy by decrease the level of mdr.objective: in this study, prnat-h1.1/shuttle-rfp plasmid was selected to construct the rnai expression vector of mrp1 mrna.methods: according to mrp1 we designed and synthesized the dna fragment that was cloned into prnat-h1.1/shuttle-rfp vector to construct rec

6、ombinant vector. transformed the recombinant vector into e.coli dh5. the result of recombinant vector was analyzed and identified using pcr and dna sequencing .results: constructing prnat-h1.1/shuttle-rfp recombinant plasmid expression vector was constructed successfully. it may be the foundation of

7、 restrain the expression of mrp1 gene in cancer cells.key words：rna interference；mrp1；prnat-h1.1/shuttle-rfp plasmid；shuttle vector目 录摘 要iabstractii第1章 绪 论11.1 rnai的研究进展11.1.1 rnai的发现过程11.1.2 rnai的分子作用机制21.1.3 rnai的特点31.1.4 sirna简介31.1.5 sirna的设计原则31.1.6 rnai在抗肿瘤方面的研究41.2 用于rnai的载体41.2.1载体的选择51.2.2

8、质粒人工构建的目的51.3 mrp1的研究进展51.3.1 mrp的转运底物、组织分布及生理作用61.3.2 mrp在组织中的表达61.4 基因治疗71.5 本课题在国内外的研究现状71.6 本论文的研究目的及意义81.7 本论文的主要内容8第2章 实验材料与方法92.1 实验材料92.1.1 宿主菌92.1.2 质粒载体92.1.3 载体通用引物112.1.4 主要试剂及工具酶112.1.5 主要仪器122.2 实验方法132.2.1 shrna的设计与退火132.2.2 合成干涉片段的退火162.2.3 重组载体的构建172.2.4菌落pcr初步筛选阳性重组子202.2.5 测序鉴定重组载

9、体212.2.6 重组质粒大提的od值检测21第3章 结果与分析223.1 质粒经hind和bamhi双酶切后胶回收结果223.1.1 质粒经hind和bamhi双酶切后结果223.1.2 目的片段的回收233.2 重组载体的菌落pcr243.3 重组质粒大量提取253.4 重组质粒测序结果26讨 论294.1 菌落pcr鉴定重组294.2 重组质粒穿梭载体的构建29结 论30参考文献31致 谢34第1章 绪 论1.1 rnai的研究进展rna干扰(rna interference , rnai)是由双链rna分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为一种双链rna分子在mrna 水平上关闭相

10、关基因表达的过程，是一项新兴的基因阻断技术。rnai有望成为分析人类基因组功能的有力工具，在肿瘤病因、免疫机制及治疗等方面的研究上有广阔的发展前景。1.1.1 rnai的发现过程1990年，rich jorgensan 和他的同事在对矮牵牛花进行实验时，无意中发现一种奇怪的现象。他们尝试把pigment-produing这种由强有力的启动子控制的基因导入矮牵牛花以加深花的紫色，结果却发现不但颜色未加深，许多花呈现杂色甚至白色。rich jorgensan 把这种现象称为共同抑制，因为导入了外源性基因，使得和内源性基因具有相似功能的基因的表达都被抑制了1。遗憾的是当时这种现象并未引起jorgen

11、sen 的重视。1994年，cogoni2和macino采用粗糙脉胞霉进行转基因研究时，发现真菌中也存在类似的现象，他们称之为基因抑制，这一现象后来在其它真菌中也相继被发现。1995 年 guo3 等在对线虫的实验中发现，正义 rna 与反义 rna 一样可以阻断par21 基因的表达，可惜作者同样对这一现象也没有更深入的研究，只做了普通的报道。直到 1998年，关于 rnai 现象的研究才被人们真正的发现4。fire5等将双链 rna，即正义链和反义链的混合物，注射到线虫的体内，却诱发了比正义链或反义链的单独注射效果更强的基因沉默，要彻底使同源基因的表达沉默，在每一个细胞中，只需要很少的几个

12、分子的双链就可以做到。在接下来进行的实验中还证实6，将双链rna注入线虫体内后 ，不但阻断了线虫体内所有同源基因的表达，同时还沉默了其第 1 代子代的同源基因，他们从此把这种现象命名为 rnai。随后，rnai 现象又陆续在果蝇、锥形虫、真菌、涡虫、植物及斑马鱼等真核生物的研究中被发现7。这种情况揭示了rnai现象可能出现于生命进化的早期阶段，在rnai机制发现之前，不同生物中的rnai现象有着不同的描述：真菌中称为“镇压”作用，在植物中被称为转录后基因沉默和基因协同抑制 8。1.1.2 rnai的分子作用机制rnai的作用机制在众多学者的努力研究下日渐明朗。不同生物体内的rna干扰作用机制也

13、各有不同，但是主要可以分为两种类型：特异效应作用机制与非特异效应作用机制。特异性效应一般发生在短双链rna（2123nt）上，非特异性效应发生于长双链rna（30nt以上）。9。其中，rnai的特异效应作用机制是在多个不同的水平上实现的，包括翻译水平、转录水平、转录后水平等。其中，转录后水平rna干扰的研究最为深入，应用也最为广泛。101.1.2.1 特异性效应转录后水平的rna干扰的发生机制是在对果蝇、线虫等生物体进行科学研究从而进一步推导得出来的。随着科学技术的发展和rnai研究的深入，人们对rnai的作用机制的了解也越来越多，通过生化和遗传学研究，现在普遍认为rnai可能的作用机制主要包

14、括两个阶段：第一步：起始阶段，即内源或外源dsrna经特定的rnase iii 家族的双链特异的核糖核酸酶(dicer) 以atp 依赖的方式将长的dsrna 切割成2123 nt的小干扰rna；第二步，效应阶段，即sirna与rna诱导沉默复合物risc结合共同降解靶mrna11。除此之外还有某些研究认为rnai的作用机制还存在着第三阶段循环放大阶段。这是rnai的自身循环放大机制，其机制主要是指在效应阶段，risc活化后与mrna结合，mrna被内切核酸酶切割成大小在l223nt不等的小片段，这些片段可以特异性地阻碍表达靶基因。同时，释放出来一种可以作为特殊引物的sirna，从而以靶mrn

15、a为模板在rdrp的作用下，合成新的dsrna。这种dsrna可以降解成新的sirna，在这个循环中表现出放大效应 10。抑制相应mrna的翻译可阻碍相应的蛋白质表达，这就是翻译水平的rna干扰机制12，其中strna起到了非常的重要作用。转录水平上的rna机制是通过sirna与互补的dna直接发生作用，从而加强同源dna的甲基化，以阻碍目的基因转录，使表达关闭，从而强化基因沉默。有文献谈到组蛋白h3及相应dna区域可被dsrna诱导甲基化。一旦启动子区域出现甲基化，那么转录将被阻断，如编码区出现甲基化，则可以进行转录，但在转录后水平上沉默。1.1.2.2 非特异效应研究表明，长度大于30nt

16、的长双链rna转染至哺乳动物体内，dsrna会激活双链rna所依赖的蛋白激酶途径13，从而导致eif-2因子磷酸化，进而非特异性地抑制翻译，诱发全面的细胞基因沉默。1.1.3 rnai的特点rnai具有高效性，也就是说与细胞内的mrna的量相比，注入细胞内的sirna的量要少得多。但由于循环放大机制的存在，仍可以有效地阻断目的基因的表达；同时，rnai也具有高特异性，小干扰rna由dsrna降解得到的，除在序列识别中不起主要作用的正义链3端的两个碱基以外，其余碱基均为必需。任何单个碱基的改变即导致rnai失效，rnai能特异性降解mrna，针对同源基因共有序列的rnai则可使同源基因全部失活。

17、除此之外，rnai还具有共抑制性、种属时效性和dsrna的长度限制性的特点。1.1.4 sirna简介rna干扰作用是通过sirna（small interfering rna，sirna）这类小rna分子作为较稳定的中间介质实现的。通过对植物的研究证明，双链rna复合体降解为35nt左右的小rna分子后通过序列互补与mrna结合，进而降解mrna。rnaseiii核酶家族的dicer是rna干扰中一个非常重要的酶。它可以结合到dsrna上，并剪切其成为2123nt且3端突出的小分子rna片断，形成sirna。141.1.5 sirna的设计原则rnai 作用的成功与否，关键在于sirna序列

18、的结构，不同结构的sirna序列沉默基因的效率差别很大， 2001年，elbashir s m等15应用化学合成法合成了sirna，并发现可以诱导哺乳动物发生rnai，他们进而据此提出了sirna 设计方法：1) 从起始密码下游50100nt开始搜索sirna以避免出现于5或3端的utrs 的蛋白结合位点，；2)搜索5aa(n19)uu序列，如果没有相应序列，可以选择5aa(n21)或5na(n21)；3)g/c含量在32%79%之间16； 4) 要确定sirna对靶基因的特异性，可以利用blast软件在基因组中进行比对，；5)设置在基因组中无对应序列的sirna的对照sirna。但是，elb

19、ashir s m等的设计方法sirna 筛选效率仍然很低，要更好的掌握rnai，提高效率，理性设计sirna有效序列成为sirna 研究的重要方向。目前, 影响sirna功能的因素包括sirna序列的结构特点，靶mrna的空间结构risc与sirna的相互作用，以及sirna与mrna错配等17。1.1.6 rnai在抗肿瘤方面的研究目前对肿瘤的治疗手段主要有药物化学治疗、手术切除和放射治疗，这些治疗方法均无法做到特异性地杀伤及完全根除肿瘤，而且副作用较大。rnai 具有特异性、简易性及高效性的特点，可稳定沉默突变基因，而对正常基因的表达不产生影响，在肿瘤的研究及治疗上有着无法比拟的优势。随

20、着 rnai 技术的不断成熟，肿瘤的研究有了空前突破，研究的重点主要在有关肿瘤免疫逃逸、肿瘤性疾病信号传导的途径、癌基因及抑癌基因的敲除、提高肿瘤对化疗及放疗的敏感性等方面18。1.2 用于rnai的载体基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，称为载体。是指能够运载外源dna片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源dna片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类dna分子。载体具有以下的功能：（1）运送外源基因高效转入受体细胞；（2）为外源基因提供复制能力或整合能力；（3）为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。目前使用的已知载体除了大肠杆菌

21、中的质粒、噬菌体、m13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母、细菌人工染色体载体以及动、植物病毒载体等19作为基因工程中使用的载体必须具备以下条件：（1）有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体dna上随染色体dna的复制而同步复制；（2）具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；（3）具有筛选转化子的选择性标记基因；（4）分子量小，拷贝数多；（5）具有较高的外源dna的载装能力；（6）安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。载体按其应用范围，可以分为克隆载体和表达载体。克隆载体是指用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型

22、复制子。表达载体是指使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体dna导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。1.2.1载体的选择质粒是为一种1-200kb不等的双链、闭环的dna分子。是染色体外稳定遗传，并能以超螺旋状态存在于宿主细胞中的因子。rna干扰实验通常选用质粒作为载体。质粒载体是为适应实验室操作在天然质粒的基础上人工构建的。构建的质粒载体与天然质粒相比通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)，同时可能带有多个人工合成的单一限制性内切酶识别位点。但是，天然质粒的缺点是分子量大，拷贝数低，所以为使分子量尽可能减少，必须去掉大部分的非必需序列，以便

23、于基因工程操作。20除此之外，质粒载体一般还带有一些可以进行体外转录外源dna、鉴定片段的插入方向等用途的序列。21细菌质粒是独立于细菌染色体的自主复制的环状双链dna分子，只有酵母的杀伤质粒已知是rna分子。环状双链dna分子有三种构型。包括两条链的环状结构都保持完整的呈超螺旋构型的共价闭合环状dna(cccdna)，双链中有一条链环状结构完整，只在另一条单链上有切口的开环dna（ocdna)以及双链断裂呈线状的线状dna22。在琼脂糖凝胶电泳时，同种质粒的三种构型迁移速率各不相同，超螺旋构型的共价闭合环状dna走得最快，其次是线状dna，最慢的是开环dna。1.2.2 质粒人工构建的目的天

24、然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件1.3 mrp1的研究进展在1992年多药耐药相关蛋白1（mrp1又被称为abcc1）的识别以及它的起始特征阐明了这种蛋白确实代表了一种选择性药物泵。编码mrp1的cdna第一次克隆是通过从阿霉素-选择性的多药耐药人肿瘤细

25、胞系（h69r）中筛选差异cdna得到的。mrp1基因(abcc1)位于染色体16p13.1上并且编码含有1531个氨基酸的蛋白。经序列分析，将mrp1分为atp-结合框超家族中的一员，mdr/p-糖蛋白也属于这一超家族。mrp1是一个膜整合糖磷蛋白，其表观分子量为190kda23,24，一个运用atp结合/水解25,26产生的能量，来行使此蛋白主要的有活性的转运功能。1.3.1 mrp的转运底物、组织分布及生理作用mrp1的底物 直接通过细胞毒性分析和底物刺激的atp酶测量进行识别mrp1的底物的，底物是由大量的多样化的疏水复合物，有机阴离子结合物以及阴离子非结合性底物所组成。典型的结合型底

26、物包括：谷胱甘肽，葡糖醛酸和硫酸盐结合物，mrp1的组织分布 mrp1在体内的表达可以说是无所不在。mrp1表达水平最高的组织包括：肺，睾丸，肾，心和胎盘；mrp1的生理作用 mrp1在作为机体主要防线的组织中分布，以及mrp1的底物特异性，表明mrp1有保护机体免受外源生物质和内源毒性代谢物侵害的生理作用。通过对基因敲除的动物进行研究确定了mrp1的功能。尽管很多体外实验明确的证实了：mrp1介导外源和内源物质的转运。但是几次尝试证实mrp1在体内的保护作用都没有成功。1.3.2 mrp在组织中的表达典型的mdr机制在肿瘤耐药中起一定作用，但多数学者发现mdr1基因和p-gp在肿瘤中的表达水

27、平并不高，难以解释nscic的高度耐药。narasaki等发现许多癌组织同时表达mrp1和mdr1，但后者表达较低，故认为mrp 1较mdr1能是反映肿瘤多药耐药更好的指标。在肿瘤复杂的耐药机制中，mrp1和mrp3的过度表达发挥了重要作用。oguri等报道在运用铂类化疗药物后，40例肿瘤患者的mrp5表达较用药前明显增高，且伴有mrp1及gsh的升高，故认为mrp5可能与gsh 一起参与mrp1导的多药耐药27。1.4 基因治疗基因治疗是肿瘤多药耐药逆转的手段之一，所谓基因治疗是指利用遗传或分子生物学方法将外源基因导人生物体内或人体细胞内，以弥补所缺失的基因或关闭、降低异常基因的表达，从而对

28、疾病进行治疗。基因治疗是治疗肿瘤的新手段，目前共有3种mdr基因治疗的策略：将相关凋亡基因转导入肿瘤细胞，促使其凋亡；使用反义技术抑制肿瘤细胞耐药基因表达；将外源mdr1基因转导入人造血干细胞以提高骨髓对化疗药物的耐药性。1.5 本课题在国内外的研究现状多药耐药蛋白基因1编码的多药耐药蛋白的过度表达是重要的肿瘤耐药机制之一。rnai是一种用dsrna作为序列特异性的触发器指导同源单链rna降解的细胞机制。在最近的研究中显示特定目的基因的表达可被rna干扰高效抑制。小干扰rna(sirna)作为一种中间介质，介导哺乳动物细胞中与之同源基因的沉默 28。rnai的作为一种经济、快捷、高效的技术手段

29、，正逐步被应用于遗传性疾病、病毒性疾病以及肿瘤等的基因治疗。从1990年，植物学家对矮牵牛花注入红色素基因，却使花变成白色，到1995年su guo博士利用线虫完成的实验，科学家首次发现了rna干扰的现象，但是并未能对其理论做出合理解释。直到1998年，andrew fire等证实guo等发现的正义rna抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的rna中污染了微量dsrna而引发，andrew fire和craig mello将这一现象命名为rnai，并于1998年在nature上发表了相关论文。随后的研究中发现，rnai现象广泛存在于果蝇，线虫，斑马鱼，真菌以及植物等生物体内，这些生物体利用

30、rna干扰来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。近几年来rnai的研究取得了很大进展,2001年它被science杂志评为十大科学成就之一,2002年被评为十大科学成就之首。29自2002年5月以后，先后出现将rnai技术应用于抑制艾滋病病毒、丙型肝炎病毒（如美国科学家mc caffrey）和癌细胞（如我国徐根兴教授）的研究报道。这一发现提示可以应用rnai技术来抑制mrp1基因的蛋白表达。nieth c等（2003）发现临床上化学合成sirna更适于联合治疗，可以利用化学合成的sirna同时转录多种mrp相关基因，如其他abc转运编码基因或细胞凋亡编码基因等，而且也可同时编码其他致癌基因或血管

31、生成因子进行联合治疗2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家，以表彰他们发现了rna干扰现象。由于rnai技术的高效性和高度特异性，rnai已成为颇为理想的细胞水平基因敲除工具，并迅速成为后基因组时代功能基因组学研究中不可或缺的重要手段，并为基因治疗开辟了新的途径。现rnai已广泛应用到hiv、病毒性肝炎、基因治疗及药物筛选探索中，对肿瘤细胞多药耐药性干扰作用的研究也正在迅速发展中，随着研究的深入和发展，将为mrp细胞的逆转提供一个安全有效的途径。1.6 本论文的研究目的及意义癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替

32、代的作用。肿瘤细胞的多药耐药性是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。rna干扰是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过rnai技术沉默mdr1基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。本实验针对mrp1基因设计并合成了两对能编码sirna的dna片段，进而构建prnat-h1.1/shuttle-rfp重组质粒表达穿梭载体，为研究以rnai技术逆转肿瘤细胞多药耐药提供实验基础。1.7 本论文的主要内容依据研究的目的及实验思路，本论文主要内容包括1根据

33、肿瘤细胞的mrp1基因核苷酸序列，按照靶位点的寻找原则，设计并合成2个编码shrna的dna模板sh-mrp1-1和sh-mrp1-2。2prnat-h1.1/shuttle-rfp质粒的大量提取。3质粒载体经hind 和bamh i双酶切，并进行胶回收。4载体与设计合成的干涉片段连接，构建靶向mrp1基因prnat-h1.1/shuttle-rfp重组质粒表达载体。5用已构建的靶向mrp1基因prnat-h1.1/shuttle-rfp重组质粒表达载体转化大肠杆菌e.coli dh5进行菌落pcr，检测重组质粒构建是否正确；重组质粒大量提取，进行od值检测。第2章 实验材料与方法2.1 实验

34、材料2.1.1 宿主菌e.coli dh5：为感受态宿主菌由北京鼎国生物技术有限责任公司提供。2.1.2 质粒载体prnat-h1.1/shuttle-rfp质粒由华中科技大学吴政星教授惠赠，该质粒源自genscript公司（scotch plamsusa）。prnat-h1.1/shuttle-rfp质粒特性如下： prnat-h1.1/shuttle 是一种腺病毒sirna穿梭质粒，shrna的表达由人的转录启动子h1 promoter启动，h1启动子属于pol启动子，该启动子总在其下游的固定距离开始转录合成rna，转录过程遇到45个连续的u即终止，非常精确；同时cmv promoter为

35、真核生物启动子，可在该质粒中高效启动红色荧光蛋白（red fluorescence protein，rfp）的表达；mcs为多克隆位点。质粒图谱见图2-1图2-1 prnat-h1.1/shuttle-rfp质粒图谱fig.2-1 detailed map of prnat-h1.1/shuttle-crfp2.1.3 载体通用引物正向引物（m13）：5-gttttcccagtcacgac-3反向引物（rev）：5- gagttagctcactcattaggc -32.1.4 主要试剂及工具酶质粒快速提取试剂盒上海生工生物工程技术服务有限司sanprep柱式dna胶回收试剂盒上海生工生物工程技

36、术服务有限司10pcr buffer北京鼎国生物技术有限责任公司dntp上海生工生物工程技术服务有限司marker(1kb,100bp)上海生工生物工程技服务有限公司goldview dna染料北京赛百盛基因技术有限公司吖啶橙北京鼎国生物技术有限责任公司氨苄青霉素上海生工生物工程技术服务有限司edtabio basic inc溶菌酶北京鼎国生物技术有限责任公司liclamrescornasesigmabacto-typtonebio basic incbacto-yeast extractbio basic incpeg8000北京鼎国生物技术有限责任公司tris饱和酚北京鼎国生物技术有限责任

37、公司hindneb公司bamhineb公司t4dna连接酶neb公司taq酶北京鼎国生物技术有限责任公司2.1.4.1 电泳缓冲液及培养基1、 50tae电泳缓冲液：tris碱242g，冰乙酸57.1ml，edta（na2edta2h2o）37.2g溶水，定容至1000ml。2、10tbe电泳缓冲液：tris碱54g，硼酸27.5g，edta（5m，ph8.0）20ml，ddh2o定容至500ml。3、lb液体培养基：将bacto-typtone 2g、bacto-yeast extract 1g和nacl 2g，溶于195ml双蒸h2o，溶解后用5mnaoh调ph值至7.0，定容至200ml

38、，共配置5份，121湿热灭菌30min。4、固体选择培养基（ampr）：每100ml lb液体培养基中加1.5g琼脂粉，121湿热灭菌20min，待温度降至60加入终浓度为50g/ml的氨苄青霉素，混匀后倒平板，4保存备用。2.1.4.2 大提质粒溶液配置(1)溶液i：50mmol/l c6h12o6，25mmol/l tris-hcl（ph8.0），10mmol/l edta（ph8.0）。(2)溶液ii：0.2mol/l naoh，1% sds。(3)溶液iii：5mol/l kac600ml， 冰乙酸115ml，h2o 285ml。(4)溶菌酶（现用现配）：取0.1g溶菌酶溶于10ml

39、10mmol/l tris-hcl（ph8.0）。(5) peg8000缓冲液：取6.5g peg8000溶于50ml 1.6mol/l nacl.。(6) 70%乙醇：取300ml无水乙醇溶于700ml水中。(7) te（ph8.0）缓冲液：1mol/l tris-hcl（ph8.0）500l，0.5 mol/l edta（ph8.0）100l，加水至50ml。2.1.5 主要仪器微量振荡器（mm-2型）上海像华化工有限公司微量振荡器（mm-2型）上海像华化工有限公司恒温空气摇床北京鼎国生物技术有限责任公司电子天平北京赛多利斯天平有限公司紫外分析仪（zf型）上海康华生化仪器制造厂低温离心机（

40、sk18）sigma公司低温离心机（sk18）sigma公司pcr仪（9600型）abi恒温磁力搅拌器（2003-16）常州国华电器有限公司恒温水浴锅上海跃进医疗器械厂自动双重纯水仪上海博通仪器厂2.2 实验方法2.2.1 shrna的设计与退火 根据sirna设计原则34，根据mrp1靶序列，设计合成四对互补反向重复脱氧核糖核酸序列，中间间隔9nt茎环序列(ttcaagaga)，5端带有bamh酶切位点，3端带有hind酶切位点，用blast进行同源性分析，确定与其他基因无同源性。shrna的dna模板由上海生工合成，单链干涉片段退火后形成双链。干涉靶点在mrp1基因mrna全序列中的位置如

41、下(粗体代表靶序列)：1 ccaggcggcg ttgcggcccc ggccccggct ccctgcgccg ccgccgccgc cgccgccgcc61 gccgccgccg ccgccgccag cgctagcgcc agcagccggg cccgatcacc cgccgcccgg121 tgcccgccgc cgcccgcgcc agcaaccggg cccgatcacc cgccgcccgg tgcccgccgc181 cgcccgcgcc accggcatgg cgctccgggg cttctgcagc gccgatggct ccgacccgct241 ctgggactgg a

42、atgtcacgt ggaataccag caaccccgac ttcaccaagt gctttcagaa301 cacggtcctc gtgtgggtgc cttgttttta cctctgggcc tgtttcccct tctacttcct361 ctatctctcc cgacatgacc gaggctacat tcagatgaca cctctcaaca aaaccaaaac421 tgccttggga tttttgctgt ggatcgtctg ctgggcagac ctcttctact ctttctggga481 aagaagtcgg ggcatattcc tggccccagt gtt

43、tctggtc agcccaactc tcttgggcat541 caccacgctg cttgctacct ttttaattca gctggagagg aggaagggag ttcagtcttc601 agggatcatg ctcactttct ggctggtagc cctagtgtgt gccctagcca tcctgagatc661 caaaattatg acagccttaa aagaggatgc ccaggtggac ctgtttcgtg acatcacttt721 ctacgtctac ttttccctct tactcattca gctcgtcttg tcctgtttct cagat

44、cgctc781 acccctgttc tcggaaacca tccacgaccc taatccctgc ccagagtcca gcgcttcctt841 cctgtcgagg atcaccttct ggtggatcac agggttgatt gtccggggct accgccagcc901 cctggagggc agtgacctct ggtccttaaa caaggaggac acgtcggaac aagtcgtgcc961 tgttttggta aagaactgga agaaggaatg cgccaagact aggaagcagc cggtgaaggt1021 tgtgtactcc tcc

45、aaggatc ctgcccagcc gaaagagagt tccaaggtgg atgcgaatga1081 ggaggtggag gctttgatcg tcaagtcccc acagaaggag tggaacccct ctctgtttaa1141 ggtgttatac aagacctttg ggccctactt cctcatgagc ttcttcttca aggccatcca1201 cgacctgatg atgttttccg ggccgcagat cttaaagttg ctcatcaagt tcgtgaatga1261 cacgaaggcc ccagactggc agggctactt c

46、tacaccgtg ctgctgtttg tcactgcctg1321 cctgcagacc ctcgtgctgc accagtactt ccacatctgc ttcgtcagtg gcatgaggat1381 caagaccgct gtcattgggg ctgtctatcg gaaggccctg gtgatcacca attcagccag1441 aaaatcctcc acggtcgggg agattgtcaa cctcatgtct gtggacgctc agaggttcat1501 ggacttggcc acgtacatta acatgatctg gtcagccccc ctgcaagtca

47、 tccttgctct1561 ctacctcctg tggctgaatc tgggcccttc cgtcctggct ggagtggcgg tgatggtcct1621 catggtgccc gtcaatgctg tgatggcgat gaagaccaag acgtatcagg tggcccacat1681 gaagagcaaa gacaatcgga tcaagctgat gaacgaaatt ctcaatggga tcaaagtgct1741 aaagctttat gcctgggagc tggcattcaa ggacaaggtg ctggccatca ggcaggagga1801 gctg

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49、gaggagct ggaacctgac agcatcgagc gacggcctgt2101 caaagacggc gggggcacga acagcatcac cgtgaggaat gccacattca cctgggccag2161 gagcgaccct cccacactga atggcatcac cttctccatc cccgaaggtg ctttggtggc2221 cgtggtgggc caggtgggct gcggaaagtc gtccctgctc tcagccctct tggctgagat2281 ggacaaagtg gaggggcacg tggctatcaa gggctccgtg

50、gcctatgtgc cacagcaggc2341 ctggattcag aatgattctc tccgagaaaa catccttttt ggatgtcagc tggaggaacc2401 atattacagg tccgtgatac aggcctgtgc cctcctccca gacctggaaa tcctgcccag2461 tggggatcgg acagagattg gcgagaaggg cgtgaacctg tctgggggcc agaagcagcg2521 cgtgagcctg gcccgggccg tgtactccaa cgctgacatt tacctcttcg atgatcccc

51、t2581 ctcagcagtg gatgcccatg tgggaaaaca catctttgaa aatgtgattg gccccaaggg2641 gatgctgaag aacaagacgc ggatcttggt cacgcacagc atgagctact tgccgcaggt2701 ggacgtcatc atcgtcatga gtggcggcaa gatctctgag atgggctcct accaggagct2761 gctggctcga gacggcgcct tcgctgagtt cctgcgtacc tatgccagca cagagcagga2821 gcaggatgca gag

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53、tacatgaag gccatcggac tcttcatctc3121 cttcctcagc atcttccttt tcatgtgtaa ccatgtgtcc gcgctggctt ccaactattg3181 gctcagcctc tggactgatg accccatcgt caacgggact caggagcaca cgaaatagtccg3241 gctgagcgtc tatggagccc tgggcatttc acaagggatc gccgtgtttg gctactcc3301 ggccgtgtcc atcgggggga tcttggcttc ccgctgtctg cacgtggacc

54、 tgctgcacag3361 catcctgcgg tcacccatga gcttctttga gcggaccccc agtgggaacc tggtgaaccg3421 cttctccaag gagctggaca cagtggactc catgatcccg gaggtcatca agatgttcat3481 gggctccctg ttcaacgtca ttggtgcctg catcgttatc ctgctggcca cgcccatcgc3541 cgccatcatc atcccgcccc ttggcctcat ctacttcttc gtccagaggt tctacgtggc3601 ttcc

55、tcccgg cagctgaagc gcctcgagtc ggtcagccgc tccccggtct attcccattt3661 caacgagacc ttgctggggg tcagcgtcat tcgagccttc gaggagcagg agcgcttcat3721 ccaccagagt gacctgaagg tggacgagaa ccagaaggcc tattacccca gcatcgtggc3781 caacaggtgg ctggccgtgc ggctggagtg tgtgggcaac tgcatcgttc tgtttgctgc3841 cctgtttgcg gtgatctcca gg

56、cacagcct cagtgctggc ttggtgggcc tctcagtgtc3901 ttactcattg caggtcacca cgtacttgaa ctggctggtt cggatgtcat ctgaaatgga3961 aaccaacatc gtggccgtgg agaggctcaa ggagtattca gagactgaga aggaggcgcc4021 ctggcaaatc caggagacag ctccgcccag cagctggccc caggtgggcc gagtggaatt4081 ccggaactac tgcctgcgct accgagagga cctggacttc

57、gttctcaggc acatcaatgt4141 cacgatcaat gggggagaaa aggtcggcat cgtggggcgg acgggagctg ggaagtcgtc4201 cctgaccctg ggcttatttc ggatcaacga gtctgccgaa ggagagatca tcatcgatgg4261 catcaacatc gccaagatcg gcctgcacga cctccgcttc aagatcacca tcatccccca4321 ggaccctgtt ttgttttcgg gttccctccg aatgaacctg gacccattca gccagtact

58、c4381 ggatgaagaa gtctggacgt ccctggagct ggcccacctg aaggacttcg tgtcagccct4441 tcctgacaag ctagaccatg aatgtgcaga aggcggggag aacctcagtg tcgggcagcg4501 ccagcttgtg tgcctagccc gggccctgct gaggaagacg aagatccttg tgttggatga4561 ggccacggca gccgtggacc tggaaacgga cgacctcatc cagtccacca tccggacaca4621 gttcgaggac tgc

59、accgtcc tcaccatcgc ccaccggctc aacaccatca tggactacac4681 aagggtgatc gtcttggaca aaggagaaat ccaggagtac ggcgccccat cggacctcct4741 gcagcagaga ggtcttttct acagcatggc caaagacgcc ggcttggtgt gagccccaga4801 gctggcatat ctggtcagaa ctgcagggcc tatatgccag cgcccaggga ggagtcagta4861 cccctggtaa accaagcctc ccacactgaa accaaaacat aaaaaccaaa cccagacaac4921 caaaacatat tcaaagcagc agccaccgcc atccggtccc ctgcctggaa ctggctgtga4981 agacccagga gagacagaga tgcgaaccac c根据2个靶序列设计的2对dna干涉片段mrp1-1，mrp1-2序列见表2.1；2.2：表2.1 根据靶位点合成的干涉片段1（mrp1-1）序列table 2.1 sirna sequence synthesized according to target 1point 1mrp1 靶序列1aattctcaa