液相色谱-质谱联用仪

1、液相色谱-质谱联用仪液相色谱-质谱联用仪摘要：液相色谱-质谱联用技术是以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统的现代分析手段。本文介绍了液相色谱-质谱联用技术的分析特点及关键技术，并详细介绍了该技术应用情况，以“应用液质联用技术测定化妆品中12种磺胺类药物”为例详细说明了该技术的应用方法及优化条件。最后展望了该技术的发展趋势。关键词：液相色谱-质谱联用仪、分析条件、优化条件Abstract:LC-MS is a modern analytical tools with liquid chromatography as a separation system and mass spectromet

2、ry as a detection system.This paper introduces both the characteristics of the liquid chromatography - mass spectrometry technology and its key techniques, and shows the application of this technology, and takes Determination of 12 kinds of sulfonamide residues in cosmetics by LC-MS-MS method as an

3、example to explain its application and optimal conditions in detail.Finally， the future development and of the technology is prospected.Key words: liquid chromatography - mass spectrometry, analytical conditions, the optimum conditions1前言液质联用（LC-MS）又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离

4、子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。LC-MS除了可以分析气相色谱-质谱（GC-MS）所不能分析的强极性、难挥发、热不稳定性的化合物之外，还具有以下几个方面的优点：分析范围广、分离能力强、 定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快、自动化程度高2液相色谱-质谱联用仪 液相色谱-质谱联仪主要由高效液相色谱、接口装置（同时也是离子源）、质谱仪和数据处理系统构成。高效液相

5、色谱仪和一般的液相色谱仪基本相同，其作用是将混合物试样分离后进入质谱仪。该仪器生物关键部分是LC和MS之间的接口装置，其主要作用是出溶剂并使试样离子化。由于接口装置同时就是离子源，因此质谱仪部分只包括质量分析器，对进入的离子进行质量分离，分离后的离子按质量的大小先后由收集器收集，并记录质谱图。 液质联用仪器3关键技术液质联用技术的关键在于：如何将液相色谱过程使用的流动相与样品分开，如何使极性大、难挥发、相对分子质量大的样品完全离子化并引入质谱分析器。3.1接口技术 LCMS最重要的位置是接口装置。样品经液相色谱分离，进入质谱，要除去溶剂并使其电离，同时要求液相色谱的高流速与质谱的气相和高真空度

6、条件相匹配。接口的作用就是将被分析的样品分子电离成带电离子，并使这些离子在离子光学系统的作用下汇聚成一定几何形状和一定能量的离子束，然后进入质量分析器被分离。这是当时解决联用技术的最大难题。自20 世纪70年代初，人们开始致力于液-质联用接口技术的研究。在开始的20 年中处于缓慢的发展阶段，研制出了许多种联用接口，但均没有应用于商业化生产。直到大气压离子化（atmospheric-pressure ionization,API）接口技术的问世，液-质联用才得到迅猛发展，广泛应用于实验室内分析和应用领域。 主要有大气压电离接口、热喷雾电离接口、离子束电离接口等，大气压电离接口是现有商品化仪器中最

7、为普遍的电离接口。3.2、基质效应3.21 基质效应的来源 LC-MS中的基质效应现象最初在1993年被发现，当改变样品基质的种类和浓度时，待测物电喷雾化质谱的响应值降低了。美国FDA2001年出版的生物分析方法验证准则明确提出：在LC-MS分析方法开发和验证过程中需要对基质效应进行评价。基质效应是指样品中除了待测物以外的其他基质成分对待测物测定值的影响，它源自色谱分离过程中与被测物共流出的物质对被测物离子化过程的影响，共流出干扰物可分为内源性杂质和外源性杂质。内源性杂质是指样品提取过程中同时被提取出来的有机或无机分子，当这些物质在共提取液中浓度较高，并与目标化合物共流出色谱柱进入离子源时，将

8、严重影响目标化合物的离子化过程。外源性杂质通常易被人们忽视，但也会带来严重的基质效应。这些干扰物由样品前处理各步骤引入，文献报道的主要包括的聚合物残留、酞酸盐、去污剂降解产物、离子对试剂、有机酸等离子交换促进剂、缓冲盐或SPE小柱材料及色谱柱固定相释放的物质等。3.22 基质效应的确认方法目前报道的缺人基质效应的方法有两种，一种是标准曲线测定法，另一种方法是利用柱后灌注技术进行测定。3.23 基质效应的补偿 基质效应的存在会严重影响对待测物的定量准确度和精密度，且影响因素多变，很难被完全消除。近儿年来，致力于消除和补偿基质效应的研究逐渐增多，主要包括优化质谱条件，优化色谱分离体系，多步净化措施

9、，使用内标物定量，采用基质匹配标准曲线定量，回声峰技术等。4、应用随着联用技术的日趋完善，HPLC-MS逐渐成为最热门的分析手段之一。特别是在分子水平上可以进行蛋白质、多肽、核酸的分子量确认，氨基酸和碱基对的序列测定及翻译后的修饰工作等，这在HPLC-MS联用之前都是难以实现的。HPLC-MS作为已经比较成熟的技术，目前己在生化分析、天然产物分析、药物和保健食品分析以及环境污染物分析等许多领域得到了广泛的应用。4.1应用实例应用液质联用技术测定化妆品中12种磺胺类药物4.11分析条件4.111色谱条件8色谱柱,5Lm,211mm150 mm;流速:0125mL/min;柱温:30e;进样量:2

10、5LL;流动相:流动相A为U=011%的甲酸水溶液,流动相B为甲醇;洗脱梯度程序见表1。表1分离12种磺胺类药物的洗脱梯度Tab1 Elution condition for determination of 12 kinds of sulfonamide4.112质谱条件离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应检测;干燥气:N2;雾化气压力:27518kPa;干燥气温度:340e;干燥气流速:8L/min。12种磺胺类药物质谱分析的条件参数如表2所示。表2 12种磺胺类药物的质谱参数Tab2 12 Parameter of Mass spectra of 12

11、kinds of sulfonamide4.12样品处理称取化妆品110g(精确到01001g)于50mL 容量瓶中,用乙睛定容至刻度,充分摇匀后超声提取20min,上层提取液经滤纸过滤,将25 mL滤液吸取至100mL蒸发瓶内,并将其接至旋转器上,于40e水浴中减压蒸馏至干,用5mL水溶解,加入5mL正己烷涡旋30s,静置分层,弃掉上层正己烷,再加5mL正己烷涡旋30s,静置分层,弃去正己烷层,移取3mL水相于5mL聚丙烯离心管中,以10000r/min离心10min,过0120 Lm滤膜,供液相色谱- 串联质谱仪分析。4.13结果与讨论4.131 样品提取磺胺类药物易溶于乙腈,而且乙腈又有

12、较强的清除蛋白能力,因此利用乙腈作为提取溶剂。超声波提取20min, 旋转蒸发富集提取液,用水溶解,正己烷脱脂, 再经C18色谱柱将样品测定液中磺胺类药物进行有效分离,利用串联三重四极杆质谱对其进行准确的定性定量分析。试验结果表明,该处理具有操作简单、测定周期短, 适用于大批量样品的快速检测,而且有较高的稳定性和满意的提取效率。4.132质谱条件优化以直接进样方式将每种100 ng/mL 的磺胺药物标准溶液分别注入离子源中,在正离子检测方式下进行母离子全扫描,得每种磺胺的分子离子峰,以每种磺胺的准分子离子峰为母离子,进行二级质谱扫描, 最后采集全扫描的二级质谱图, 得碎片离子信息,再对得到每种

13、磺胺的二级质谱参数如破碎电压、碰撞能量等进行优化,使每种磺胺的定性离子与定量离子产生的离子对强度比例达最大时为最佳,得每种磺胺的二级质谱图。4.133色谱条件优化图1为标准样品混合物的总离子流图。为使所有的磺胺类药物达到满意的分离度,分别考察含有014%乙酸或012% 甲酸的10mmol/L乙酸铵溶液、U=011%的甲酸水溶液和甲醇、乙腈、U=50%的甲醇-乙腈等有机溶液作流动相时的分离效果。结果表明,以011%甲酸水溶液和甲醇为流动相梯度洗脱时,可使12种磺胺类药物得到较好的分离。图1 12种磺胺类药物混合标准品的总离子流图Fig1 TIC diagram of 12 kinds of su

14、lfonamide4.134线性范围和检出限将逐级稀释的标准工作溶液分别进样25LL,测定结果经线性回归,线性范围、回归方程(y为峰面积;x为质量浓度,Lg/L)、相关系数、检出限(S/N=3)和定量限见表3。表3 12种磺胺类药物的回归方程、线性范围、相关系数及检出限Tab.3 Regression equation,linearity range,conlative cofficient,detection limit of 12 kinds of sulfonamide4.135方法的加标回收率和精密度表4列出了加标回收率实验数据表4 化妆品中12种磺胺类药物的加标回收率数据（n=6)T

15、abl 4 Recovery of 12 kinds of sulfonamide in cosmetic samples具体操作程序为:称取空白样品6份,每份1g,分别添加质量浓度为110Lg/mL的12种磺胺类药物的混合标准溶液011 mL,按供试品溶液制备方法制备后,进行测定。从表4中的回收率及精密度数据可以看出,加标回收率在8011% 9315%, 相对标准偏差在2157%7141%, 满足试验要求。5发展趋势与已成熟的GCMS联用技术相比较，LC-MSMS联用技术还处于发展阶段。但LC-MSMS所具备的一系列优点，决定了它的应用前景比GC-MS更为广泛。在“接口”方面，API接口的成

16、功应用，使得液-质联用成为可能。在对大分子和小分子化合物分析中，展现了它作为通用接口的广阔应用前景。能够实现微径HPLC与质谱的联用，这是近来的一个发展趋势。在串联质谱方面，目前以四极杆串联质谱为主，它可进行MS1和MS2操作(空间上)。离子阱质谱和富利叶变换质谱(FTICRMS)亦可完成多级串联质谱分析(时间上)，离子阱质谱通过改变阱里射频场最多可进行10级MS操作，FT-ICR-MS通过离子回旋共振进行多级MS操作。飞行时间质谱(TOF)作为第二个质量分析器，由于其分辨率高、质量范围宽、扫描快和灵敏度高等优点，成为一个重要的发展方向。LC-MSMS联用技术愈来愈多地受到人们的重视，一些国际

17、著名的分析仪器公司和研究机构建立多个研究实验室参于研究开发。总之，为应用目的而建立的LC-MSMS联用技术会越来越多，应用研究课题也会越来越多。参考文献：1 Cao Hong,Wang Hao,Liu Yanqin, Yang Hongmei, Guo Qilei.Determ ination of 12 kinds of sulfonam ide residues in cosmetics by LC - MS - MS method.China SurfactantDetergent & Cosmetics，2010,40（4）：1-3. 2 Liu Fuyan,Liu Fuqiang,X

18、ie Yuanchao,Yu Yingjun.Recent Development in the Application of Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Pharmaceutical Analysis.Drug standards of China.2008,9(6):443.3 Sun Huang,Fu Cuiying,Jiang Liange,Bai Zhengzhong.Progress of LC-MS in detection of chemical drugs mixed into traditional Chinese

19、medicines.Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis.2010,30(8):1567.4 Liu Fei.A Review for the Applications of Chromatography-mass Spectrometry in Food Analysis.Quality and Technical Supervision Research.2009.6.5 Zhang jianli,Wang Zhangliang,Zhang Yinong.Detection of Sedative Hypnotic Drugs in Heal

20、th Products by LC-MS.Journal of Chinese Mass Spectromet ry So ciety.2009,30(5).6 Liu Yi,Bai Yu,Pang Nannan,Liao Yiping,Liu Huwei.Applications of LC-MS and CE-MS in the analysis of traditional Chinese medicine.Sciencepaper Online.2009,4(3):179.7 Liu Han, XU Jinzhong, Ding Tao, Zhang Xiaoyan, Yang Wen

21、quan.Simultaneous Determination of 26 Pesticides Residues in Vegetables by High Performance Liquid Chromatography- Mass Spectrometry.Journal of Ins trumental Analysis.2009,28(2):181-185.8 Ding Huiying,Xie Wen,Zhou Zhaoqian,Li Bo,JIANG Qinting.Determination of 11 Benzoylurea Insecticides Residuesin Vegetable by LC-MS/MS.Journal of Ins trumental Analysis.2009,28(8):970-974.9 Liu Fuyan,Liu Fuqiang,Xie Yuanchao,Yu Yingjun.Recent Development in the Application of Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Pharmaceutic