空气微生物检测培训教材

1、公共场所集中空调通风系统卫生规范公共场所集中空调通风系统卫生学评价规范 卫生微生物学指标与检测方法,范围,公共场所集中空调通风系统卫生规范 涉及到卫生微生物指标的条款包括： 1、嗜肺军团菌 （集中空调通风系统冷却水和冷凝水） 2、细菌总数 500cfu/m3 真菌总数 500cfu/m3 溶血性链球菌等致病性微生物 （集中空调通风系统送风） 3、细菌总数 100cfu/cm2 真菌总数 100cfu/cm2 致病微生物 （集中空调通风系统风管内表面） 集中空调通风系统送风嗜肺军团菌的检测（液体采样法）,目的,控制由于空调通风系统造成生物致病因子经空气播散；预防危害人体健康，疾病传播的公共卫生问

2、题发生；规范现场与实验室操作，为监督执法、预警预报提供准确的数据。,准备与现场采样,1、采样设备、器材、试剂与培养基准备 2、现场调研、现场记录 3、采样人员无菌操作与个人防护 4、采样点的选择 5、采样无菌操作 6、气溶胶样品的采集（六级采样器） 7、水样品的采集 8、尘样品的采集 9、样品采集后的现场整理 10、样品采集过程中，人员的一般安全防护,影响室内环境（1、2、3、4、5）微生物污染的因素,空调系统调查结果（引用）,新风量大室内空气质量高 新设备运行时空气质量优于老设备 清洁设备运行时空气质量优于污染设备 检测生物性污染物对空调系统的污染与对室内空气质量的影响具有卫生学意义。 空调

3、系统的卫生微生物学检测不可能摆脱室内空气污染的规律与概念。,认 识,1、室内污染来源占的份额高于室外。 2、上述因素与空调系统均相关；但并不是说空调设备自身造成了室内空气污染；其危险与潜在的危害，是由于空调通风系统把人类的活动（工作、生活、爱好与环境等）造成的空气质量状态，进行了输送、转移、传播。空调给于了微生物一定的生存条件。 3、空调系统的生物性污染除嗜肺军团菌外还有许多成员。如：目前国外有关室内空气真菌、空调系统所致真菌污染方面的研究日渐增多。 4、环境对室内空气微生物存在极大影响（记录重要）。 5、我们现行的规范要求包括了我们目前遇到的、可能遇到的生物性致病因子。,指示生物与指标菌,微

4、生物在空气中的传播,名词解释： 气溶胶（aerosol）：是固态或液态微粒悬浮在气体介质中的分散体系。其微粒为微生物时，称之为微生物气溶胶。 液态粒子称雾； 小于1m的固态粒子称烟； 大于1m的粒子称尘。,名词解释,气溶胶粒子大小：气溶胶粒子大小分布从0.001100m 微生物气溶胶粒子大小，从0.00230m。,致病性生物因子,凡是在室内空气环境存在的致病性生物因子，都有可能通过空调系统播散，以致可能由于污染环境给人带来危险或潜在的危害。室内空气环境存在的致病性生物因子主要有如下几类室内空气环境存在的致病性生物因子：,空气带菌粒子危害部位,1、15的空气带菌粒子可直接侵入肺泡 2、610的空

5、气带菌粒子易沉着在小支气管 3、1030的空气带菌粒子会沉积在支气管,微生物与粒子,1、空气中与疾病有关的带菌粒子直径一般为420 m。 2、来自人体的微生物主要附着在1215 m的尘粒上。 3、许多真菌以单个孢子的形式存在。,微生物,1、细菌类：结核杆菌、非结核杆菌、肺炎双球菌、嗜肺军团杆菌等160余种。 2、真菌类：球孢子菌、假丝酵母（念珠菌）、曲霉、毛霉、青霉等600余种。 3、病毒类：流感、水痘、风疹、腺病毒等约几百种。 4、其他：支原体、衣原体等。,相关因素,空气中的微生物的存在和生存时间（存活力viability）与水环境、土壤环境的状况紧密相关，微生物本身的特征起主导作用。研究微

6、生物的生境是重要的工作内容。,特 点,依据实验研究，空气中的微生物如果不能回到有利于其生活和繁殖的环境中，迟早是要死亡的。 微生物几乎全部是附着在尘埃上，尘埃并不全部有微生物的附着；灰尘量与菌数并不呈现线性正相关。 不同的采样方法所捕获的带菌粒子也不相同。,趋势,强毒力、高传染性微生物气溶胶的研究 兔热杆菌：志愿者15个左右的菌即可；军团菌：气溶胶中检出即对人有感染。 日本乙型脑炎病毒、裂谷热病毒、拉沙热病毒、出血热病毒、与畜牧业新城疫、流感等。 真菌、真菌毒素。,方法学中的问题,1、空调系统与室内空气质量的相关性 2、不同的采样方法所获得的结果有差异 3、样品处理方式、操作不一致影响结果的一

7、致性 4、注意样品处理过程的一致性,指示生物的选择,肠道指示生物为例（N条）： 肠道独有，代表性强 数量多 存活时间比致病菌稍长 对消毒剂的耐受性比致病菌稍高 对人危害无或很小 检测方便，程序简单,指示生物,大肠杆菌作为水污染与否的卫生指示生物应用多年，行之有效，各界公认，基本符合指示生物的多项要求。对于室内空气而言，指示生物则难以被选出。大肠杆菌作为粪便污染的指示生物，与肠道传染病的病原体不仅同原，还存在诸多共性，有代表性。空气则无法找到这么一个指示生物。所以对空气质量的认同，我们选择了指示生物与致病生物监测两个途径。,指示生物的目前选择,细菌总数、真菌总数、溶血性链球菌、嗜肺军团杆菌等等,

8、检测方法的论述采样,样品保存与运输,1、带培养基的样品 2、一般水、土样品 3、分离军团菌的样品 4、培养基的运输与保存 （时间、温度、避光）（防污染、防增殖、防消亡、防破损、防乱号）,注意事项,1、采样： 气体：（以时间确定）仪器法。 尘量：适时评估确定方法（擦拭、刮拭）。 2、培养基检查有无污染 3、培养时间相关的问题（菌数多少、湿度保证、温度控制） 4、采样点的选择 5、关注采样环境,采样与检测方法,1、对室内空气常用的采样方法有： 自然沉降法（曝皿法）（本稿不采纳） 空气微生物采样器法：推荐撞击式 6级空气微生物采样器 2、液体过滤、冲击采样： 采集室内空气军团菌时应用 3、管道：擦拭

9、法、刮拭法,采样人工,擦（棉）拭法：布、棉花或其他材料，通常用灭菌盐水润湿，通过擦拭采取通风管道表面的微生物；然后在同样的溶液洗脱微生物，并涂平板培养与计数菌落形成单位以供分析，涂板方法可用湿拭子直接涂布，也可以用洗脱液涂布。在无法进行机械采样的风管中应用。 刮拭法：尘量多、板结、粘稠时使用,采样机器人,人工采样受到多方面的影响，一致性不高，难完成规范要求的任务；机器人采样同一性高；能满足规范要求的工作内容；目前品种较少，通风管道没有标化： 符合规范要求 按产品说明书的要求操作 注意质控,采样与检测方法,直接的灰尘培养： 从空调通风管道表面取得灰尘，直接悬浮于0.01%吐温80（PBS或生理盐

10、水）溶液中，然后稀释并选择适宜稀释度，取1mL按倾注法操作，培养与计数菌落形成单位以供分析。 尘量大需要秤量。,检测方法的论述,细菌总数,细菌总数,细菌总数定义： 仪器法采集室内空气，计数在营养琼脂培养基上经3748小时培养所形成的菌落数，换算为每立方米室内空气中菌落总数，以cfu/m3（colony forming units/m3）每立方米室内空气菌落形成单位报告。 管道尘的稀释倾注法：检测管道尘中的细菌总数依Xcfu/cm2 报告。,细菌总数的检测,细菌总数的检测,细菌总数的检测,细菌总数的卫生学意义,空气没有提供作为细菌和它种微生物生长所需要足够的水分与营养物质，所以空气不是微生物产生

11、与繁殖的场所，检测出空气中存在微生物，主要来源于外环境（包括植物在内）与人、动物的活动。某一种或几种致病性微生物存在的内在原因，即是人、畜污染所致，致病微生物的存在，对生活之中的人们就可能构成了潜在的危险，在条件适宜的情况下造成疾病的传播。一般说，室内空气质量在适宜微生物贮留与生长繁殖的场所，与换气量不足、通风不良、人员较多时，就造成微生物数量的增加。虽然单纯微生物种类与数量的多寡，不能说就一定引起人们的疾病，却可以有不舒适的感觉。,室内空气标准制定的情况,苏联：规定夏季清洁空气为细菌总数1500 cfu/ m3、污染空气为细菌总数2500 cfu/ m3；而冬季清洁空气细菌总数4500 cf

12、u/ m3、污染空气为细菌总数7000 cfu/ m3。,室内空气标准制定的情况,日本：日本采用自然沉降法 统一用直径9cm平皿: 将室内空气分为5级： 清洁29、 普通3074、 可接收界限75149、 轻污染150299、重污染300。,室内空气标准制定的情况,我国： 医院：撞击法2500 cfu/m3 沉降法30 cfu/皿。 公共场所 撞击法 4000cfu/m3；沉降法 45 cfu/皿。 香港特别行政区（制订“办公室及公众场所室内空气质素管理指引”，指明微生物污染物包括三大类，细菌、真菌、过滤性病毒。） 空气中细菌标准是，一类500 cfu/m3，二类1000 cfu/m3。,空调

13、通风管道表面细菌浓度,在空调通风管道表面细菌浓度，在3.210 51.5106 cfu /g之间。一般情况下，微生物浓度增加的一些因子包括潮湿条件与空气回流。在空调通风管道表面细菌污染一般情况下低于旋转热交换器（10 7 cfu/ m2）、冷却管或加湿器（10 7 cfu/ m2）。有资料表明，灰尘表面浓度对可生存的微生物浓度影响小，沉积于空调通风管道表面后再形成生物气溶胶的菌存活时间一般较短，有待于更多的实验与检测数据证实。,室内空气标准制定的情况,实验资料：人群聚集80min 空气中细菌数 ，沉降法44 cfu/皿，撞击法4300cfu/m3。在撞击法 细菌总数4000cfu/m3，沉降法

14、 33 cfu/皿，CO2 0.08浓度时，有异臭感和不适感者为24.1；在撞击法 细菌总数6000cfu/m3，沉降法 75 cfu/皿，CO2 0.15浓度时，有异臭感和不适感者出现率为55。,采样方法与要求,采样时必须在空调系统正常运转条件下，关闭门窗（参考时间30分钟），尽量减少人、畜的活动幅度与频率，记录采样位置、室内人员数量、温湿度与天气状况等。,采样方法与要求,采样应用营养琼脂培养基，372培养484小时，观查并记录结果（37培养24h时应进行观查，不必记录结果）。,采样方法与样品处理要求,空调系统管道：无菌操作准确称取管道尘（记录数量），加入到含有0.01% Tween-80的

15、0.03mol/L PBS中，作10倍梯级稀释，视灰尘含菌量多少选三个数量级的稀释液，各取1mL稀释液直接加入平皿中，用营养琼脂培养基作混碟培养。372培养484小时，观查并记录结果（37培养24h时应进行观查，不必记录结果），其所得菌落数乘以稀释倍数，换算cfu/cm2细菌总数。,采样方法与要求,空调送风：依监测目的和应用方法确定采样点，选择仪器法采样一般在送风口下方1520cm距离 50100cm处；室内空气：采样点的高度为1.2m。不同采样方法所获得的结果不一致，报告结果时应注明采样方法。,培养基的制备,成分：蛋白胨 10g 氯化钠 5g 肉膏 5g 琼脂 20g 蒸馏水 1,000ml

16、 制法：将上述成分加热溶化于蒸馏水中，校正pH值为7.47.6。加入琼脂，12120min灭菌。 用途：供空气细菌总数检测用。,含0.01% Tween-80的0.03mol/L PBS,磷酸氢二钠 2.83g 磷酸二氢钾 1.36g 蒸馏水 至990mL Tween-80 最终浓度0.01% 方法：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钾溶于少量蒸馏水中，溶解混匀加水至990mL，按比例加入1% Tween-80液10mL，使最终浓度0.01%，121蒸汽灭菌20min。,注意点,1、采尘样条要浸泡在转运液体中。 2、稀释与取样时充分洗脱，操作一致 3、进口安德森采样器的应用：注意平皿中琼脂的厚度,检测方法

17、的论述,真菌总数：仪器法采集室内空气，计数在沙氏琼脂培养基上经282培养5天培养所形成的菌落数，换算为每立方米室内空气中菌落总数，以cfu/m3（colony forming units/m3）每立方米室内空气菌落形成单位报告。 管道尘的稀释倾注法：检测管道尘中的真菌总数依Xcfu/cm2 报告。,空调系统与真菌病,病态建筑综合症的典型症状包括：眼刺激，鼻刺激和鼻充血，咽刺激和咳嗽、呼吸困难、嘶哑、皮肤刺激、头痛、呕吐、疲劳、精神疲惫和对味的感知问题等。 确定引起上述症状的原因很难。性别、社会心理因素、从事的职业等主观因素影响作用虽小，却难断然排除。,真菌总数的标准情况,我国目前的卫生标准尚无

18、对真菌总数的具体要求，但是该指标受到国际社会日益关注。在某些居室建筑、办公场所中真菌总数每立方米可达数百至千，在有霉变气味的室内真菌总数则更高。污染真菌绝大多数是在土壤中或其他基物上生长、繁殖，真菌孢子体积小、质量轻、数量大，易随气流的运动而被传播，故有“气传真菌”之称。,相关性,空气中真菌的含量有明显的季节性，与温度、湿度、地理位置等因素密切相关。巴黎6月时空气中真菌浓度n104/m3，冬季则仅为100/m3；国内某坑道的监测显示空气湿度增加真菌数也增加，为此我们对南北方以维持高湿度天气的长短，分别给予了不同的要求；室内铺有地毯的一般比没有铺地毯的真菌数高；人的活动、清扫卫生、换衣铺床等空气

19、中的真菌数增加。,相关标准,WHO的要求：150cfu/m3（采样方法：离心式采样器）； 芬兰：200 cfu/m3（采样方法：Anderson采样器）； 美国：1,000 cfu/m3（采样方法：未说明）,标准值依据与参考数值,我国目前的卫生标准尚无对真菌总数的具体要求，但是该指标受到国际社会日益关注。在某些居室建筑、办公场所中真菌总数每立方米可达数百至千，在有霉变气味的室内真菌总数则更高。,采样方法与要求,空调送风：依监测目的和应用方法确定采样点，选择仪器法采样一般在送风口下方1520cm距离 50100cm处； 室内空气采样点的高度为1.2m。报告结果时应注明采样方法。 管道尘：机器人采

20、样与刮拭法采样,采样方法与要求,采样时必须在空调系统正常运转条件下，关闭门窗（参考时间30分钟），尽量减少人、畜的活动幅度与频率，记录采样位置、室内装修状况（织物包厢、地毯铺置、花草养殖）与人员数量、温湿度与天气状况等。,培养要求,应用沙氏琼脂培养基，282培养57d，需逐日观查并及时记录结果（如培养至5日时，霉菌或放线菌的菌丝生长掩盖周围菌落或菌丝长至满皿，可停止观查并记录结果，但在报告时需注明）,采样方法与要求,空调系统管道尘：无菌操作准确称取管道尘，加入到含有0.01% Tween-80的自来水中，作10倍梯级稀释，视灰尘含菌量多少选三个数量级的稀释液，各取0.3mL稀释液直接涂沙氏琼脂

21、培养基平皿，282培养，其所得菌落数乘以稀释倍数，换算成cfu/cm2真菌总数。,培养基的制备,1、沙氏（Sabourands agar）琼脂培养基： 成分： 蛋白胨 10g 葡萄糖 40g 琼脂 20g 蒸馏水 1,000ml 制法：将蛋白胨、葡萄糖溶解于蒸馏水中，校正 pH值为5.56.0，加入琼脂，115 15min灭菌备用。 用途：供空气真菌总数检测用。,说 明,此培养基是国际上培养真菌的标准培养基，应用广泛。培养基的pH值为5.56.0，除真菌外一般菌不易在此酸性培养基中生长，在配制时一般不需调整pH，其值即与此接近。琼脂在酸性条件下多次加热，降低或丧失琼脂的凝固性，需注意。为抑制细

22、菌与放线菌的生长，可在1L沙氏琼脂培养基中加入4050mg氯霉素和500mg放线菌酮，两种抗菌素均耐热，在高压蒸汽灭菌前加入。,含0.01% Tween-80的自来水稀释液,与自来水中加入Tween-80，使最终浓度为0.01%，121 20min灭菌备用。,检测方法的论述,溶血性链球菌,溶血性链球菌（HS）,溶血性链球菌（HS）定义：经3537，2448小时培养，在血平皿平板上形成呈灰白色，表面突起直径0.50.7mm的细小菌落，菌落透明或半透明，表面光滑有乳光；镜检为革蓝氏阳性无芽孢球菌，圆形或卵圆形，呈链状排列（视培养与操作条件影响链可短可长48个细胞至几十个细胞）；菌落周围有明显的24mm界限分明、完全透明的无色溶血环。符合上述特征的菌量称为溶血性链球菌。以cfu/m3（colony forming units/m3）每立方米室内空气菌落形成单位报告。,溶血性链球菌（HS）,溶血性链球菌的卫生学意义,溶血性链球菌与细菌总数的相关性：溶血性链球菌与细菌总数并没有相关性，陶晓燕在空调环境中三家证券交易所的调查报告结果显示，在细菌总数并没有显示严重污染时，溶血性链球菌的数量表明空气污染的程度已很严重。,溶血性链球菌的卫生学意义,因此确认空调覆盖面积大小（换气量大小）与人员数量的关系